章海鑫，余智杰，張燕萍，張愛芳，王 生，李 涵，付輝云

(江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所，南昌 330039)

草魚(Ctenopharyngodonidellus)是我國淡水養(yǎng)殖面積最大、產(chǎn)量最高的品種，產(chǎn)量占淡水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的18.4%[1]。水產(chǎn)養(yǎng)殖(特別是草魚養(yǎng)殖)是為國民提供優(yōu)質(zhì)蛋白的主要方式之一，但養(yǎng)殖過程中存在著因養(yǎng)殖密度大而導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化、病害增多、品質(zhì)低下等問題。因此，發(fā)展既能保證產(chǎn)量又能提高產(chǎn)品質(zhì)量，減少環(huán)境污染的養(yǎng)殖技術(shù)是草魚養(yǎng)殖面臨的迫切問題，而生態(tài)養(yǎng)殖是解決這一問題的重要發(fā)展方向。

水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)是由養(yǎng)殖動(dòng)物、水體、底泥等因素構(gòu)成的相互影響、相互作用的綜合生態(tài)系統(tǒng)。其中，底泥中的微生物對(duì)系統(tǒng)中有機(jī)質(zhì)、無機(jī)鹽等物質(zhì)循環(huán)代謝的強(qiáng)度直接影響水體富營養(yǎng)化水平[2]和水體理化環(huán)境[3]；水體中水生植物對(duì)微生物分解形成的無機(jī)鹽的吸收和利用又反過來影響著微生物的群落結(jié)構(gòu)和養(yǎng)殖動(dòng)物的生長；養(yǎng)殖動(dòng)物所產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)對(duì)于微生物的結(jié)構(gòu)組成又有一定選擇作用。所以，底泥微生物在整個(gè)養(yǎng)殖系統(tǒng)中扮演著重要的角色，它不僅參與養(yǎng)殖系統(tǒng)中有機(jī)質(zhì)、無機(jī)鹽等物質(zhì)的循環(huán)代謝及能量代謝[4]，本身又受到水體環(huán)境因子、水體植物和養(yǎng)殖動(dòng)物的影響。

許多研究者認(rèn)為通過提高養(yǎng)殖系統(tǒng)微生物的分解能力，平衡好水生植物和浮游植物對(duì)無機(jī)鹽的吸收和其為養(yǎng)殖動(dòng)物提供餌料的關(guān)系是生態(tài)養(yǎng)殖發(fā)展的方向[5]，也是解決養(yǎng)殖過程中高產(chǎn)量與污染相矛盾的重要手段[6]。在不同的養(yǎng)殖方式下，養(yǎng)殖池塘底泥、水體和養(yǎng)殖動(dòng)物腸道中的微生物均有所不同，從而表現(xiàn)出多樣性，微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性同樣會(huì)影響著不同養(yǎng)殖條件下水體理化環(huán)境因子和養(yǎng)殖效果。因此，從底泥微生物群落結(jié)構(gòu)角度出發(fā)，探討分析不同養(yǎng)殖方式底泥微生物群落結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)及其與水體的理化環(huán)境的關(guān)系可以為開發(fā)生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)提供理論支持，也能夠?yàn)樘接懖煌B(yǎng)殖模式之間的優(yōu)劣提供一個(gè)依據(jù)，具有重要生態(tài)和經(jīng)濟(jì)意義。目前，草魚池塘養(yǎng)殖中常見的模式有魚菜共生模式[6-7]、山塘模式[8]和傳統(tǒng)精養(yǎng)模式，本實(shí)驗(yàn)比較了具有代表性的兩種草魚生態(tài)養(yǎng)殖模式——魚菜共生模式和山塘模式與傳統(tǒng)精養(yǎng)模式條件下池塘底泥的微生物群落結(jié)構(gòu)的四季變化，并分析微生物群落結(jié)構(gòu)與水體環(huán)境因子的關(guān)系，旨在為評(píng)估和判斷草魚養(yǎng)殖環(huán)境的變化情況，發(fā)展草魚生態(tài)養(yǎng)殖提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 養(yǎng)殖模式構(gòu)建

在江西省南昌縣蔣巷鎮(zhèn)三洞村選取一個(gè)面積為30 000 m2的草魚養(yǎng)殖塘，改造成3個(gè)面積均為10 000 m2，深度為2.5 m的標(biāo)準(zhǔn)養(yǎng)殖塘。選取其中一個(gè)塘采用山塘模式養(yǎng)殖(投喂草，投喂率10%)，另一個(gè)塘采用魚菜共生模式養(yǎng)殖(使用PVC管構(gòu)建浮床，種植水空心菜，種植面積占水面10%，投喂配合飼料，投喂率3%～4%)，剩余一個(gè)塘采用傳統(tǒng)精養(yǎng)模式(投喂配合飼料，投喂率3%～4%)。其中山塘放養(yǎng)草魚3 740尾/ 10 000 m2，規(guī)格為16～24尾/kg，精養(yǎng)池塘和魚菜共生池塘均放養(yǎng)草魚12 000尾/1 0000 m2，規(guī)格為16～24尾/kg。放養(yǎng)時(shí)間均在2018年12月，水深常年保持在2～2.2 m。

1.2 樣品采集與預(yù)處理

1.1.1 底泥樣品采集與預(yù)處理

三種養(yǎng)殖模式條件下樣品的編號(hào)情況見表1。每次采樣用彼得森采泥器在池塘四個(gè)角離岸邊25 m處和池塘中點(diǎn)采集表層底泥樣品各50 g，然后混勻成一個(gè)樣并編號(hào)，每個(gè)池塘按季度采四次。采集的底泥暫時(shí)保存于干冰采樣箱中，24 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，凍存于-80 ℃冰箱中。

表1 養(yǎng)殖信息及樣品編號(hào)Tab.1 Information of culture models and sample number

1.1.2 水樣采集與處理

1.2 底泥樣品DNA 提取、擴(kuò)增和測(cè)序

將每季度混合后的底泥樣品充分混合后稱取2 g用土壤 DNA 提取試劑盒(OMEGA Soil DNA Kit,D5625)提取。16S rRNA基因V3-V4區(qū)擴(kuò)增引物為：341F(5′-CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT-3′) 和 805R(5′-GGACTACNVGGGTWTCTAATCC-3′)。PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)后，利用凝膠回收試劑盒(QIAGEN)對(duì)目的條帶進(jìn)行回收。然后使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒(Illumina)進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過 Qubit 和 Q-PCR 定量,使用 HiSeq2500(諾禾致源公司，北京)進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

1.3.1 序列處理

參照陳瓊等[9]的方法采用Miseq測(cè)序平臺(tái)得到原始數(shù)據(jù)(raw data)，然后進(jìn)行拼接和質(zhì)控，得到有效數(shù)據(jù)(clean data)，再進(jìn)行嵌合體過濾，得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)(effective tags)。 然后基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行 OTUs(operational taxonomic units)聚類。

1.3.2 統(tǒng)計(jì)分析

水質(zhì)數(shù)據(jù)采用Excel 2010處理數(shù)據(jù)，用SPSS19.0進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析。

序列數(shù)據(jù)利用 Uparse 軟件對(duì)所有樣品的全部effective tags進(jìn)行聚類，以97% 的一致性將序列聚類成OTUs。根據(jù)OTUs聚類結(jié)果對(duì)每個(gè)OTU的代表序列做物種注釋，得到對(duì)應(yīng)的物種信息，根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取每個(gè)樣品在門和屬2個(gè)分類級(jí)別上最大豐度排名前10的生成相對(duì)豐度柱形累加圖。對(duì)所有樣品的OTUs進(jìn)行豐度分析、Alpha多樣性分析等。使用Qiime 軟件(Version 1.7.0)計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)，包括豐富度指數(shù)(Richness)、ACE 指數(shù)(ACE Index)和Chao1 指數(shù)(Chaos1 Index)。不同模式間進(jìn)行UPGMA(unweighted pair-group method with arithmetic means)聚類分析和Anosim(analysis of similarities)分析。

2 結(jié)果

2.1 水體環(huán)境因子

圖1 水溫變化情況Fig.1 Changes of water temperature in four seasons

圖2 pH、溶解氧、氨氮、總氮、總磷和CODMn四季變化情況Fig.2 Changes of and CODMn in four seasons

2.2 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)

測(cè)序得到的序列經(jīng)過拼接和質(zhì)控，然后過濾掉嵌合體后得到Effective Tags條數(shù)為54 775～68 965。去除無法聚類到OTUs和沒有注釋的序列條數(shù)后得到可構(gòu)建OTUs的序列(taxon tags)條數(shù)為48 067～63 071(表2)。以97%的一致性,將每個(gè)樣品所得的序列聚類成 OTUs(表2)。

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)

2.3.1 物種相對(duì)豐度

樣品中相對(duì)豐度最高的10個(gè)OTUs在門水平上分布見圖3，可以看到三種養(yǎng)殖模式條件下四季底泥樣品中豐度最高的均是變形菌門(Proteobacteria)。但A組變形菌門占比四季是下降趨勢(shì)；其余占比超過10%的門是擬桿菌門(Bacteroidetes)和酸桿菌門(Acidobacteria)，其中酸桿菌門四季占比逐漸升高。B組變形菌門占比先降后上升；擬桿菌門和酸桿菌門占比均超過10%，而且擬桿菌門占比逐漸下降和酸桿菌門占比逐漸上升；綠彎菌門(Chloroflexi)占比也超過10%。C組除了變形菌門外，擬桿菌門占比也超過10%；但綠彎菌門、酸桿菌門、硝棘菌門(Nitrospinae)、螺旋體門(Spirochaetes)等占比均比較高；而且每個(gè)門占比四季存在一定的波動(dòng)。

圖3 樣品在門水平上物種相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of samples at phylum level

2.3.2 核心群落相對(duì)豐度

樣品在屬水平上相對(duì)豐度最高的10個(gè)OTUs為核心群落，可以反映群落物種的基本結(jié)構(gòu)情況。從圖3和表3中可以明顯看到三組中沒有鑒定的種類在四季中占比均最高，有未培養(yǎng)(uncultured)、未培養(yǎng)細(xì)菌(uncultured-bacterium)、未培養(yǎng)土壤細(xì)菌(uncultured-soil-bacterium)和未培養(yǎng)原核生物(uncultured-prokaryote)四種。其中地桿菌屬(Geobacter)和厭氧粘細(xì)菌屬(Anaeromyxobacter)在三組中四季均有，其余種屬A組與B組和C組相差較大，而且A組的種屬四季差異較大。B組和C組重要種屬相似，且四季差異較小。具體詳見表3。

圖4 樣品在屬水平上相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of samples at genus level

表3 在屬水平豐度最高的10個(gè)OTUSTab.3 Top ten OTUs with the highest abundance in genus level

2.3.3 微生物群落結(jié)構(gòu)聚類分析

UPGMA聚類分析結(jié)果(圖5)可知，各樣品在時(shí)間上的相似性(不同季度)的相似性高于空間上(不同養(yǎng)殖方式)。具體表現(xiàn)為B組和C組相似性接近，而A組與B組和C組相似性低;B組和C組均是夏季和秋季相似度最高，A組是春夏兩季相似度高。

對(duì)A、B、C三組樣品均作了Anosim差異性分析，從圖6可以看到A組與C組的組間差異大于A組和B組以及B組和C組，組間差異最小為B組和C組。A、B、C三組的組間差異均顯著高于組內(nèi)差異。

2.4 多樣性分析

三組多樣性方差分析結(jié)果見圖7，從圖7可以看到A組ACE指數(shù)顯著低于B組和C組，B組和C組間差異不顯著，但Shannon指數(shù)三組差異不顯著。從表4中可以看到三種養(yǎng)殖模式條件下豐富度指數(shù)ACE各季度差異也大。其中A組四季豐富度指數(shù)變化差異大，其次是B組，C組豐富度指數(shù)四季最穩(wěn)定；除A組外，B組和C組豐富度均是先增后降的趨勢(shì)。Chao1指數(shù)的變化情況與ACE類似。多樣性指數(shù)Shannon A組冬季多樣性高于B組和C組，但夏季和秋季低于B組和C組，C組除了冬季外其他時(shí)間多樣性均小于B組；各組內(nèi)四季也存在一定的變化；A組除了秋季外，其余三個(gè)季度均比較穩(wěn)定； B組和C組類似，均是夏季> 春季>秋季>冬季。

圖7 ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)差異分析圖Fig.7 Differentiation analysis of richness(ACE) and Shannon indices in groups***表示差異極顯著

表4 基于OTUs的多樣性指數(shù)的 Alpha 多樣性分析Tab.4 Alpha diversity of bacteria samples associated with the number of observed OTUs

2.5 環(huán)境因子與微生物群落多樣性相關(guān)性分析

表5 環(huán)境因子與多樣性相關(guān)性分析Tab.5 Correlation analysis between environmental factors and the microbial community diversity

3 討論

3.1 三種養(yǎng)殖模式條件下底泥微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

3.2 三種養(yǎng)殖模式條件下底泥微生物核心群落

底泥微生物核心菌群的種類和分布情況可以一定程度上反應(yīng)底泥微生態(tài)情況，比較三種養(yǎng)殖模式各季度微生物群落在屬水平的分布情況可以發(fā)現(xiàn)，A組主要屬在豐度上和種類上四季均有很大差別。春夏季以進(jìn)行還原作用的厭氧或兼性厭氧菌屬的地桿菌屬、WCHB1-32屬、厭氧粘細(xì)菌屬、Crenothrix屬和脫氯單胞菌屬等[11、13-18]為主。而秋季則出現(xiàn)了進(jìn)行亞消化作用的硝化螺旋菌屬[19-21]和能夠在好氧條件下進(jìn)行固氮，厭氧條件下還原硫的藍(lán)細(xì)菌屬[22]。同時(shí)鯨桿菌屬、大腸桿菌志賀菌屬、鮑曼不動(dòng)桿菌屬的豐度占比也進(jìn)入了前10。其中鯨桿菌屬的種類通常寄生于水產(chǎn)動(dòng)物腸道，參與促進(jìn)和合成蛋白質(zhì)及碳水化合物和脂肪的代謝[23、24]；大腸桿菌志賀菌屬和鮑曼不動(dòng)桿菌屬均是環(huán)境中的條件致病菌，而鮑曼不動(dòng)桿菌屬中菌能夠引起水產(chǎn)動(dòng)物疾病[25-26]。冬季則是以厭氧粘細(xì)菌屬、Syntrophorhabdus、地桿菌屬等和Methanoregula等占主要地位。說明A組底泥微生物核心菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差。與之相比，B組雖然主要種屬的豐富度在四季存在一定的變化，但種類變化較小，主要以地桿菌屬、厭氧粘細(xì)菌屬、Crenothrix、螺旋體屬、脫硫酸鹽橡菌屬等為主。其中的地桿菌屬[11、13]、厭氧粘細(xì)菌屬[15]、Crenothrix屬[18]、脫硫酸鹽橡菌屬[27]均屬于厭氧或兼性厭氧菌，在厭氧條件下還原有機(jī)物。說明B組底部溶氧不足和有機(jī)物沉積過量，因?yàn)橛袡C(jī)物的積累能刺激地桿菌屬和厭氧年細(xì)菌屬等菌屬的大量富集[14]。對(duì)水體理化檢測(cè)的數(shù)據(jù)也支持這一結(jié)論(DO最低、COD(Mn)及三氮均最高)。C組春季豐度較高的是地桿菌屬、脫氯單胞菌屬、厭氧粘細(xì)菌屬和Candidatus-Competibacter屬等還原有機(jī)物，脫硫及除磷作用的菌屬，到夏季開始出現(xiàn)藍(lán)細(xì)菌屬和Crenothrix，且豐富度上升，Candidatus-Competibacter屬豐富度也上升。因?yàn)樗{(lán)細(xì)菌屬具有能夠在好氧條件下進(jìn)行固氮，厭氧條件下還原硫的作用[22]，Crenothrix[18]具有硝化作用，所以C組池塘夏季底泥中除磷、固氮和硝化菌種類和數(shù)量均升高，促使水體COD(Mn)、總磷、總氮和氨氮等理化指標(biāo)均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。同時(shí)鯨桿菌屬也是C組系統(tǒng)中的主要菌屬，鯨桿菌屬具有參與促進(jìn)和合成蛋白質(zhì)及碳水化合物和脂肪的代謝的作用[23、24]，是對(duì)養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物有益的腸道菌群。所以，從核心菌群功能結(jié)構(gòu)、微生物的多樣性關(guān)系，以及參照水體理化指標(biāo)來分析，均可以表明魚菜共生系統(tǒng)底泥菌群結(jié)構(gòu)更為優(yōu)化。

3.2 水體理化環(huán)境對(duì)底泥微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

4 結(jié)論

山塘模式雖然水體DO相對(duì)較高，水體理化環(huán)境最好(TN、TP等最低)，但菌群結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、四季波動(dòng)大，加上養(yǎng)殖密度低、產(chǎn)量也低，也存在能引起魚類病害的條件致病菌的隱患，所以其沒有達(dá)到充分提高養(yǎng)殖效益的目的。魚菜共生模式雖然產(chǎn)量與精養(yǎng)模式一樣，但水體有機(jī)物低于精養(yǎng)模式，水生植物能夠吸收無機(jī)鹽類，提供溶氧，而且底泥微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，水環(huán)境因子能夠促進(jìn)底泥微生物的生長和繁殖，能夠穩(wěn)定持續(xù)的凈化水體環(huán)境，是一種能夠保證產(chǎn)量且提高養(yǎng)殖效益的養(yǎng)殖方式。