張來(lái)福，盧承印，王孝輝，武愛(ài)玲

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州450046；2.河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院/河南省骨科醫(yī)院，河南 洛陽(yáng) 471002)

骨折以交通傷害為首要致病因素[1]。骨折不愈合時(shí)不僅影響患者的身體健康，還會(huì)造成心理問(wèn)題，降低患者生活質(zhì)量[2]。因此如何促進(jìn)骨折愈合，降低骨折對(duì)患者的影響成為治療的關(guān)鍵。在固定斷骨的同時(shí)，配合促進(jìn)骨痂生長(zhǎng)的藥物是臨床治療骨折的常用手段[3-4]。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，有諸多促進(jìn)骨折愈合的中草藥，如骨碎補(bǔ)、杜仲、續(xù)斷等[5]。臨床也常用含有骨碎補(bǔ)的方劑治療骨折[6-7]，并取得了較好的療效，但骨碎補(bǔ)促進(jìn)骨折愈合的作用機(jī)制仍未完全明確。

中藥骨碎補(bǔ)(Rhizoma drynariae)是水龍骨科植物槲蕨(Drynariafortunei(Kunze)J.Sm.)根莖的加工品，味苦性溫，歸肝腎經(jīng)，具有療傷止痛、補(bǔ)腎強(qiáng)骨、消風(fēng)祛斑的功效，臨床常用于跌撲閃挫、筋骨折傷、腎虛腰痛、筋骨痿軟、耳鳴耳聾、牙齒松動(dòng)、外治斑禿、白癜風(fēng)的治療[8]?！端貑?wèn)·宣明五氣篇》中指出“腎主骨，肝主筋”?！秱浼鼻Ы鹨健芬粫?shū)也提到“腎應(yīng)骨，骨與腎合”“肝應(yīng)筋，筋與肝合”的相關(guān)理論?！端貑?wèn)·陰陽(yáng)應(yīng)象大論篇》中云：“腎生骨髓，在體為骨”，說(shuō)明腎主骨生髓，骨是人體的支架。在骨折治療時(shí)，若腎生骨髓不足，則骨無(wú)以養(yǎng)、骨難愈合[9]。因此，在骨折的治療中須配合補(bǔ)腎強(qiáng)骨之法。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是將化學(xué)基因組學(xué)與網(wǎng)絡(luò)藥理生物學(xué)相結(jié)合的新學(xué)科，2007年首次被Hopkins AL[10]提出，旨在構(gòu)建“藥物-靶基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)，從整體上分析藥物成分與疾病中多成分、多靶基因、多通路的關(guān)系，從而揭示藥物治療疾病中潛在的有效成分、作用靶基因及通路。本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法構(gòu)建“骨碎補(bǔ)-活性成分-靶基因-骨折”的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(詳細(xì)研究步驟見(jiàn)圖1)，研究骨碎補(bǔ)治療骨折的作用機(jī)制。

圖1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究骨碎補(bǔ)促進(jìn)骨折愈合作用機(jī)制步驟

1 分析方法

1.1 骨碎補(bǔ)有效成分篩選

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine system pharmacology，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)是根據(jù)中草藥系統(tǒng)藥理學(xué)的框架建立，用于藥物篩選和評(píng)估，可以提供中草藥活性成分及其對(duì)應(yīng)的靶基因、目標(biāo)疾病等信息[11]。在TCMSP中檢索骨碎補(bǔ)活性成分及對(duì)應(yīng)靶基因，以口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥30%、藥物相似度(Drug-likeness，DL)≥0.18的條件進(jìn)行篩選[12]，結(jié)果共得到18種活性成分及其各自對(duì)應(yīng)靶基因(見(jiàn)表1)。利用軟件perl(https：//www.perl.org/)和基因庫(kù)Uniprot(https：//www.uniprot.org/)為靶基因進(jìn)行注釋得到基因名，并排除無(wú)法找到基因名的靶基因。

1.2 骨折對(duì)應(yīng)靶基因篩選

以骨折(fracture)為關(guān)鍵詞分別在GeneCards(https：//www.genecards.org/)和OMIM(https：//www.omim.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索相關(guān)靶基因。

1.3 篩選骨碎補(bǔ)-骨折對(duì)應(yīng)靶基因的交集

利用軟件R(https：//www.r-project.org/，版本3.6.1)對(duì)骨碎補(bǔ)與骨折靶基因取交集，得出骨碎補(bǔ)-骨折共同靶基因的venny圖(見(jiàn)圖2)，并從中得到骨碎補(bǔ)-骨折的靶基因列表。

1.4 構(gòu)建“骨碎補(bǔ)-活性成分-共同靶基因-骨折”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

利用軟件perl和Cytoscape(https：//cytoscape.org/，版本3.7.2)對(duì)骨碎補(bǔ)、有效活性成分、骨折、共同靶基因進(jìn)行計(jì)算畫(huà)圖，得到“骨碎補(bǔ)-活性成分-骨折-共同靶基因”的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖3)。

1.5 構(gòu)建“骨碎補(bǔ)-骨折共同靶基因”蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network，PPI網(wǎng)絡(luò))，篩選核心靶基因

將“骨碎補(bǔ)-骨折靶共同基因”輸入軟件STRING(https：//string-db.org/cgi/input.pl)，同時(shí)以人類(lèi)(Homo sapiens)為選擇條件，以0.4為最小互作分?jǐn)?shù)，得到相應(yīng)結(jié)果(圖4)。并將結(jié)果輸入R軟件中，進(jìn)而得到PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶基因圖(圖5)。

1.6 GO功能富集分析

GO(Gene Ontology)分析通過(guò)在數(shù)據(jù)庫(kù)(org.Hs.eg.db)中對(duì)基因進(jìn)行細(xì)胞成分、生物學(xué)過(guò)程、分子功能三部分的描述，進(jìn)而得到基因的注釋信息，通過(guò)比較得到差異表達(dá)基因，進(jìn)一步得到GO富集分析。將“骨碎補(bǔ)-骨折共同靶基因”輸入軟件R，利用相應(yīng)腳本得到GO功能富集分析圖(圖6)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.7 KEGG通路富集分析

KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通過(guò)將生物體內(nèi)所有通路進(jìn)行富集分析，檢測(cè)目標(biāo)基因是否在某類(lèi)通路中富集而得到的結(jié)果。將“骨碎補(bǔ)-骨折共同靶基因”輸入軟件R，利用相應(yīng)腳本得到KEGG通路富集分析圖(圖7、圖8)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨碎補(bǔ)有效活性成分篩選

依據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，結(jié)果共得到18種活性成分和304個(gè)對(duì)應(yīng)靶基因。見(jiàn)表1。

表1 根據(jù)OB和DL參數(shù)在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)骨碎補(bǔ)活性成分篩選結(jié)果

2.2 骨碎補(bǔ)-骨折對(duì)應(yīng)的靶基因交集

在軟件R中利用腳本對(duì)骨碎補(bǔ)與骨折靶基因取交集，得出骨碎補(bǔ)-骨折共同靶基因的venny圖及共同靶基因列表。其中骨折對(duì)應(yīng)相關(guān)靶基因有3 490個(gè)，骨碎補(bǔ)對(duì)應(yīng)靶基因有77個(gè)，骨碎補(bǔ)-骨折共同靶基因有55個(gè)。

圖2 骨碎補(bǔ)-骨折靶點(diǎn)

2.3 “骨碎補(bǔ)-活性成分-骨折-共同靶基因”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

從圖3中得知骨碎補(bǔ)有14種活性成分，分別為：柚皮素((2R)-5，7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-chroman-4-one)、金魚(yú)草素(Aureusidin)、豆甾醇(Stigmasterol)、去甲異辛醇(黃烷酮)(Eriodyctiol (flavanone))、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、山奈酚(kaempferol)、柚皮苷(naringenin)、(+)兒茶素((+)-catechin)、圣草素(eriodictyol)、木犀草素(luteolin)、22-豆甾烯-3-酮(22-Stigmasten-3-one)、環(huán)木菠蘿烯酮(cycloartenone)、大蒜素(davallioside A_qt)、黃姜烯醇(xanthogalenol)。其中圣草素OB最高，為71.79%；環(huán)木菠蘿烯酮DL最大，為0.79；活性成分連接靶基因最多的是山奈酚、木犀草素，分別連接26、25個(gè)靶基因。在骨碎補(bǔ)治療骨折的過(guò)程中，可能通過(guò)這14種有效成分作用于55個(gè)共同靶基因促進(jìn)骨折愈合。

注：圖中部分代表藥物骨碎補(bǔ)，部分代表疾病骨折，部分為骨碎補(bǔ)中活性成分，部分為靶點(diǎn)。

2.4 “骨碎補(bǔ)-骨折靶基因”P(pán)PI網(wǎng)絡(luò)

圖4中每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)基因片段，節(jié)點(diǎn)內(nèi)填充為基因形狀(未填充為基因片段形狀未明確)。連線(xiàn)代表節(jié)點(diǎn)之間的相互作用，節(jié)點(diǎn)連線(xiàn)越多則代表成為核心基因的概率越大。圖中共有407條連線(xiàn)，其中互作分?jǐn)?shù)最高的為IKBKB-NFKBIA、CASP7-CASP8、CASP8-CASP3、NCOA2-AR四條連線(xiàn)，互作評(píng)分均為0.99。

圖4 骨碎補(bǔ)-骨折PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶基因

柱狀圖清晰顯示節(jié)點(diǎn)連線(xiàn)多少，自下至上節(jié)點(diǎn)連線(xiàn)依次減少，其中IL-6(白介素-6)最多，有39條連線(xiàn)，其次是EGFR(epidermal growth factor receptor，表皮生長(zhǎng)因子受體)和VEGFA(vascular endothelial growth factor A，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A)，均為33條。

2.6 GO功能富集圖

共同基因共得到73種功能富集，部分核心基因功能富集結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖中得知，功能富集程度最高的分別為類(lèi)固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity，8個(gè)基因)、核受體活性(nuclear receptor activity，7個(gè)基因)、轉(zhuǎn)錄因子活性(transcription factor activity)、類(lèi)固醇結(jié)合(steroid binding，7個(gè)基因)、參與凋亡過(guò)程的半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性(cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process，7個(gè)基因)。因此骨碎補(bǔ)在治療骨折類(lèi)疾病時(shí)，可能是14種有效成分作用于55個(gè)共同靶基因通過(guò)調(diào)控上述受體活性發(fā)揮作用。

注：該圖左列為基因名稱(chēng)，數(shù)字表示與鄰近節(jié)點(diǎn)的連線(xiàn)多少。

注：左列為對(duì)應(yīng)的GO號(hào)；數(shù)字代表基因富集數(shù)目；P值表示富集程度高低，P值越小、顏色越深，表示富集程度越高。

2.7 KEGG通路富集分析

共得到101條KEGG通路，取部分通路作圖，結(jié)果見(jiàn)圖7、圖8。由圖中得知，通路富集程度最高的分別為前列腺癌(Prostate cancer)、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、EB病毒感染(Epstein-Barr virus infection)等通路。因此骨碎補(bǔ)在治療骨折類(lèi)疾病時(shí)，可能是14種有效成分作用于55個(gè)共同靶基因通過(guò)上述通路對(duì)73種受體活性發(fā)揮調(diào)控作用。

圖8是標(biāo)注節(jié)點(diǎn)后的通路圖，其中每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)蛋白、酶或基因，箭頭代表上下游之間的作用關(guān)系，紅色標(biāo)注的節(jié)點(diǎn)表示出現(xiàn)在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，未進(jìn)行標(biāo)注的節(jié)點(diǎn)表示未曾出現(xiàn)在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中。

3 討論

在中醫(yī)理論中，腎藏精、主骨、生髓，腎精盛衰決定骨骼的生長(zhǎng)速度，因此在治療骨折類(lèi)疾病時(shí)，當(dāng)以補(bǔ)腎強(qiáng)骨為要，而骨碎補(bǔ)為補(bǔ)腎強(qiáng)骨要藥，在臨床有很多骨碎補(bǔ)促進(jìn)骨折愈合的報(bào)道[13-14]。在筆者前期研究中[15]，也證實(shí)了骨碎補(bǔ)的提取物骨碎補(bǔ)總黃酮能促進(jìn)大鼠誘導(dǎo)膜中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)的表達(dá)，而VEGF能促進(jìn)微小血管增生，BMP-2誘導(dǎo)成骨能力強(qiáng)，VEGF和BMP-2表達(dá)的增加可加速促進(jìn)骨折愈合。骨折愈合通常經(jīng)歷三個(gè)階段：炎癥階段、修復(fù)階段、細(xì)胞重塑階段。骨骼損傷后會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng)、形成血腫，隨后到達(dá)修復(fù)階段形成軟骨愈傷組織、礦化，最后經(jīng)過(guò)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的作用進(jìn)行重塑，恢復(fù)骨骼結(jié)構(gòu)[16-18]。

注：左列表示通路名稱(chēng)；下行數(shù)字表示通路上基因富集數(shù)目；P表示富集程度，其中P越小、顏色越深表示富集程度越高。

注：左上角為通路名稱(chēng)Prostate cancer，該通路中共有13個(gè)不同基因富集。

本研究結(jié)果表明，骨碎補(bǔ)在治療骨折類(lèi)疾病時(shí)共有14個(gè)有效活性成分，其中鄰近節(jié)點(diǎn)連線(xiàn)最多的是山奈酚和木犀草素。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，山奈酚不僅能誘導(dǎo)細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的耐受作用[19]，而且具有抗癌、抗心血管疾病、抗炎、抗糖尿病、促進(jìn)骨折愈合、抗血小板聚集等作用[20]。促進(jìn)骨折愈合的作用中，山奈酚能改善細(xì)胞活力，通過(guò)提高堿性磷酸酶(ALP)的活性促進(jìn)成骨基因的表達(dá)，通過(guò)誘導(dǎo)自噬進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化、增殖、礦化[21]，同時(shí)具有抑制破骨細(xì)胞骨吸收的作用[22]。木犀草素具有抗腫瘤[23]、抗炎[24]、抗衰老[25]等作用。尚丹等[26]研究發(fā)現(xiàn)木犀草素能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化、礦化；Quan He等[27]也發(fā)現(xiàn)木犀草素能促進(jìn)人體成骨細(xì)胞的分化；Lucía等[28]證實(shí)木犀草素能通過(guò)促進(jìn)ALP的合成進(jìn)而有利于成骨細(xì)胞的分化。Kim等[29]證實(shí)木犀草素可抑制破骨細(xì)胞的分化和成熟破骨細(xì)胞的吸收活性。OB最高的圣草素能通過(guò)抑制NFATc1活性抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的形成和骨吸收[30]；而DL最大的環(huán)木菠蘿烯酮尚缺乏有效研究。因此骨碎補(bǔ)促進(jìn)骨折愈合是山奈酚、木犀草素等多種有效成分共同發(fā)揮作用的結(jié)果。

在PPI網(wǎng)絡(luò)中，骨碎補(bǔ)活性成分-骨折對(duì)應(yīng)的共同靶基因IL-6、EGFR、VEGFA是連線(xiàn)最多的節(jié)點(diǎn)。其中IL-6可刺激淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞進(jìn)入骨折部位，對(duì)于骨折的愈合起著重要作用[31]。EGFR及其信號(hào)通路對(duì)調(diào)控成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞增殖、分化具有重要的生物學(xué)作用[32]。高水平的VEGFA有助于促進(jìn)骨折愈合及功能恢復(fù)[33]。因此骨碎補(bǔ)促進(jìn)骨折愈合是IL-6、EGFR、VEGFA等多核心基因共同調(diào)節(jié)的結(jié)果。

在GO功能富集中，富集程度最高的分別為類(lèi)固醇激素受體活性、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性等。類(lèi)固醇激素受體是包括雌激素受體、雄激素受體、糖皮質(zhì)激素受體在內(nèi)的一類(lèi)受體[34]。雌激素和雄激素在骨形成中不可或缺，研究表明[35]，雌激素能通過(guò)調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性，對(duì)骨量和骨骼強(qiáng)度的調(diào)節(jié)產(chǎn)生關(guān)鍵作用。也有研究[36-37]表明雌激素通過(guò)延長(zhǎng)成骨細(xì)胞的壽命和縮短破骨細(xì)胞的壽命發(fā)揮作用，且雌激素的缺乏會(huì)影響骨折早期的炎癥反應(yīng)和骨折的愈合。雄激素能通過(guò)影響成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞的表達(dá)，骨轉(zhuǎn)換標(biāo)記、骨小梁的變化等多方面因素影響骨生長(zhǎng)、骨形態(tài)以及骨重建，對(duì)骨骼生長(zhǎng)發(fā)育和維持骨量發(fā)揮著重要作用[38]。糖皮質(zhì)激素不僅對(duì)炎癥性骨科疾病有治療作用，而且能通過(guò)影響骨髓細(xì)胞、破骨細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞的功能對(duì)骨折患者發(fā)揮治療作用[16，39]。核受體是包含雌激素、雄激素、糖皮質(zhì)激素在內(nèi)的超家族，同樣對(duì)骨折的愈合發(fā)揮調(diào)控作用[40]。

KEGG通路富集的結(jié)果顯示，富集程度最高的為前列腺癌通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化通路、TNF信號(hào)通路等。每條通路中都包含多個(gè)共同靶基因，以富集程度最高的前列腺癌通路為例，其中有13個(gè)骨碎補(bǔ)活性成分-骨折共同對(duì)應(yīng)的靶基因，這些基因?qū)?yīng)的功能富集包含類(lèi)固醇激素受體活性、核受體活性等在內(nèi)的多種功能活性。在標(biāo)注節(jié)點(diǎn)通路圖中可以發(fā)現(xiàn)，前列腺癌通路中包含PI3K-Akt、Apotosis、p53、MAPK等信號(hào)通路；流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化通路包括MAPK、NF-κB、PI3K-Akt等信號(hào)通路；TNF通路包括MAPK、PI3K-Akt、Apotosis、NF-κB等信號(hào)通路。MAPK、PI3K-Akt、NF-κB等信號(hào)通路均能參與炎癥反應(yīng)階段，有效控制促炎性細(xì)胞因子的釋放[41]，MAPK也能參與調(diào)控成骨細(xì)胞的凋亡[42]；PI3K-Akt活性的抑制進(jìn)一步影響成骨細(xì)胞的增殖[43]；NF-κB與細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)分化等密切相關(guān)[44]，也參與成骨細(xì)胞的分化及基因的表達(dá)[45]。

綜上所述，在骨碎補(bǔ)治療骨折的過(guò)程中，通過(guò)山奈酚、木犀草素等有效成分作用于IL6、EGFR、VEGFA等共同靶基因，通過(guò)前列腺癌通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化通路、TNF等信號(hào)通路調(diào)控類(lèi)固醇激素受體、核受體、轉(zhuǎn)錄因子等受體活性發(fā)揮作用。本研究從微觀水平上揭示了骨碎補(bǔ)促進(jìn)骨折愈合的機(jī)理，這也符合中醫(yī)理論中的整體觀念。中藥治療疾病中是多成分、多靶點(diǎn)共同發(fā)揮作用，經(jīng)過(guò)人體機(jī)能統(tǒng)一調(diào)控的結(jié)果。