陳二林，李喜香*，吳國(guó)泰，馬慧萍，潘從澤，李 翔

(1.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 73000；3.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四O醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，現(xiàn)已成為嚴(yán)重危害老年人身心健康的常見(jiàn)病、多發(fā)病之一，至今西醫(yī)臨床尚缺乏特異性有效治療藥物，因此從中藥中尋找和開(kāi)發(fā)具有腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的藥物用于防治AD具有十分重要的意義[1-3]。研究表明，β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積是誘發(fā)AD的核心環(huán)節(jié)[4]。淀粉樣斑塊是一種不溶水的準(zhǔn)晶體沉積，其主要成分為Aβ肽，由跨膜淀粉樣前體蛋白斷裂形成。Aβ沉積后具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，導(dǎo)致產(chǎn)生老年斑(SPs)、神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs)以及炎癥反應(yīng)，致使神經(jīng)元變性凋亡，從而誘發(fā)AD[5-8]。

補(bǔ)腦膏是甘肅省中醫(yī)院的醫(yī)院制劑 (甘藥制字Z04000828)，是在古方“佛手方 (當(dāng)歸、川芎)”的基礎(chǔ)上，合用黃芪、赤芍、補(bǔ)骨脂、枸杞、淫羊藿、龜板、水蛭、仙靈脾、益母草、仙茅、黃精、甘草制成[9]，具有益氣養(yǎng)血、填精補(bǔ)髓、化瘀通絡(luò)的功效，用于腦外傷性神經(jīng)損傷及后遺癥，腦炎、腦膜炎后遺癥，動(dòng)脈硬化性腦損害，腦、脊髓變性性疾病，弱智兒童及腦性癱瘓等疾病的治療，臨床應(yīng)用多年，療效確切[10-12]。在前期研究過(guò)程中，筆者將補(bǔ)腦膏劑改進(jìn)成軟膠囊，主要由補(bǔ)腦浸膏粉250 g、大豆油250 g、微粉硅膠5 g等組成[13]。補(bǔ)腦軟膠囊初步藥效學(xué)研究顯示，其對(duì)癡呆模型動(dòng)物的學(xué)習(xí)和記憶功能具有明顯的改善作用[14]。本研究利用Aβ1-42誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷，考察補(bǔ)腦軟膠囊對(duì)損傷細(xì)胞的保護(hù)作用，為補(bǔ)腦軟膠囊防治AD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 細(xì)胞株

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞株，來(lái)源于ATCC，購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.2 藥物與試劑

補(bǔ)腦軟膠囊(自制)；Aβ1-42(美國(guó)AnaSpec公司，批號(hào)：1855817)；多奈哌齊片(衛(wèi)材藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1703055)；特級(jí)胎牛血清FBS(德國(guó)PAN公司，批號(hào)ST170307)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Solarbio公司，批號(hào)：Hyclone003)；胰蛋白酶(北京賽諾浦生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：PB180218)；青霉素、鏈霉素混合液(碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：C0222)；細(xì)胞凋亡Hoechst33258染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：C1017)。

1.3 主要儀器

SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(北京瑞科中儀科技有限公司)；CKX41倒置熒光顯微鏡(北京瑞科中儀科技有限公司)； SpectraMax i3全自動(dòng)熒光酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular公司)；TG16-W微量高速臺(tái)式離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；01A-1電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司)；YXQ4-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實(shí)業(yè)有限醫(yī)療設(shè)備廠)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

SH-SY5Y細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合溶液的DMEM/F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞濃度為80%～90%后傳代，隔天換液1次，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期即可用于實(shí)驗(yàn)[15]。

2.2 藥物配制

稱(chēng)取補(bǔ)腦軟膠囊內(nèi)容物0.05 g，加4 mL PBS溶解，3 000 r/min離心10 min，取上清液，過(guò)濾除菌，取續(xù)濾液即得0.012 5 g/mL母液，用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋?zhuān)謩e配制成1.25 mg/mL、1.25×10-1mg/mL、1.25×10-2mg/mL、1.25×10-3mg/mL、1.25×10-4mg/mL、1.25×10-5mg/mL的藥液，備用。取Aβ1-42備用液，每支加入10 μL DMSO溶解至5 mmol/L，再加入490 μL PBS稀釋至100 μmol/L/4 ℃孵育24 h后，14 000 g×10 min離心，取上清液，4 ℃避光保存，備用。取1片鹽酸多奈哌齊稱(chēng)重，稱(chēng)取0.050 2 g(含1.8 mg多奈哌齊)，用1 mL DMSO溶解，3 000 r/min離心取上清液，PBS稀釋4倍，過(guò)濾除菌，取續(xù)濾液得0.45 mg/mL的母液，備用。

2.3 Aβ1-42適宜濃度選擇

將濃度為5×106個(gè)/mL的SH-SY5Y細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合率達(dá)70%～80%后換為無(wú)血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)4 h后，對(duì)照組加入無(wú)血清培養(yǎng)基，損傷組加入終濃度分別為10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L Aβ1-42溶液，每組3個(gè)復(fù)孔[15]。培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8孵育1 h，采用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度(OD)值。

2.4 補(bǔ)腦軟膠囊內(nèi)容物及多奈哌齊劑量選擇

將濃度為5× 106個(gè)/mL的SH-SY5Y細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合率達(dá)70%～80%后更換為無(wú)血清培養(yǎng)基[15]。培養(yǎng)4 h后，分別加入100 μL終濃度為1.25 mg/mL、1.25×10-1mg/mL、1.25×10-2mg/mL、1.25×10-3mg/mL、1.25×10-4mg/mL、1.25×10-5mg/mL的受試物藥液，每組3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置終濃度分別為0.004 5 mg/mL、0.002 5 mg/mL、0.001 mg/mL的多奈哌齊試驗(yàn)組，每組3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后更換無(wú)血清培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK-8孵育1 h，采用酶標(biāo)儀于450 nm處檢測(cè)吸光度(OD)值。

2.5 實(shí)驗(yàn)分組及處理

將細(xì)胞分為空白組、對(duì)照組、Aβ1-42模型組、多奈哌齊陽(yáng)性組與補(bǔ)腦軟膠囊內(nèi)容物高、中、低劑量給藥組?？瞻捉M加等量培養(yǎng)基，不接種細(xì)胞，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞以5× 106個(gè)/mL接種于96孔板，待細(xì)胞融合率為80%時(shí)，各組更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h，陽(yáng)性組更換為含多奈哌齊的無(wú)血清培養(yǎng)基，給藥組分別更換為含高、中、低劑量的補(bǔ)腦軟膠囊內(nèi)容物的無(wú)血清培養(yǎng)基。除對(duì)照組外，其余各組加入Aβ1-42溶液繼續(xù)孵育24 h。

2.6 對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞存活率的影響

按照“2.5”項(xiàng)下方法分組給藥，每組6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)至細(xì)胞融合率達(dá)80%后，置于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。更換培養(yǎng)基，每孔加入10 μL的CCK-8，37 ℃孵育1 h，采用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)定吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。

2.7 對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響

按照“2.5”項(xiàng)下方法分組給藥，培養(yǎng)至細(xì)胞融合率達(dá)80%后，加入新鮮配制的4%多聚甲醛0.5 mL，于37 ℃固定細(xì)胞15 min，PBS液洗2次，加5 mg/LHoechst33258染色液染色5 min，PBS液洗2次后，用抗熒光淬滅封片液(20 mmol/L檸檬酸，50 mmol/L磷酸氫二鈉，50%甘油，pH=5.5)封片后采用熒光顯微鏡觀察、拍片[16]。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)腦軟膠囊內(nèi)容物對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)的影響

顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)正常，折光性強(qiáng)，軸突清晰可見(jiàn)，貼壁狀態(tài)良好。模型組SH-SY5Y細(xì)胞折光度下降，突觸收縮，貼壁狀態(tài)不良，有許多細(xì)胞呈懸浮狀。補(bǔ)腦軟膠囊內(nèi)容物組SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)改善，細(xì)胞突觸結(jié)構(gòu)較完整，細(xì)胞貼壁狀態(tài)較好。見(jiàn)圖1。

圖1 各組 SH-SY5Y 細(xì)胞形態(tài)的改變

3.2 Aβ1-42適宜濃度篩選

如表1所示，隨著Aβ1-42濃度的提高，細(xì)胞存活率逐漸降低，且Aβ1-42損傷組細(xì)胞存活率與對(duì)照組均有顯著性差異(P<0.01)。說(shuō)明Aβ1-42(1 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)對(duì) SH-SY5Y細(xì)胞有明顯的損傷作用，其中Aβ1-4220 μmol/L誘導(dǎo)損傷適中，故選擇20 μmol/L Aβ1-42作為誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的最佳濃度。

表1 Aβ1-42濃度對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的影響

3.3 補(bǔ)腦軟膠囊內(nèi)容物及多奈哌齊劑量篩選

如表2所示，補(bǔ)腦軟膠囊內(nèi)容物在1.25×10-3～1.25×10-5mg/mL對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞毒性損傷較小，在1.25～1.25×10-2mg/mL對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞毒性損傷較大，因此選擇1.25×10-3～1.25×10-5mg/mL作為受試劑量。多奈哌齊陽(yáng)性組0.004 5 mg/mL對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞毒性損傷較大，0.002 5 mg/mL、0.001 0 mg/mL對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞毒性損傷較小，因此選擇0.002 5 mg/mL作為受試劑量。

表2 補(bǔ)腦軟膠囊內(nèi)容物對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的毒性

3.4 補(bǔ)腦軟膠囊內(nèi)容物對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

如表3所示，Aβ1-42損傷的SH-SY5Y細(xì)胞模型組吸光度明顯低于對(duì)照組，表明細(xì)胞受到了損傷或部分細(xì)胞已經(jīng)死亡。與模型組比較，補(bǔ)腦軟膠囊內(nèi)容物高劑量OD值低于模型組，補(bǔ)腦軟膠囊內(nèi)容物中劑量OD值高于模型組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；補(bǔ)腦軟膠囊內(nèi)容物低劑量OD值明顯高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比較，陽(yáng)性組吸光度值高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示補(bǔ)腦軟膠囊內(nèi)容物及多奈哌齊對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用。

3.5 補(bǔ)腦軟膠囊內(nèi)容物對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響

采用Hoechst33258染色觀察SH-SY5Y細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組細(xì)胞核呈現(xiàn)彌散均勻的淡藍(lán)色弱熒光，而Aβ1-42模型組SH-SY5Y細(xì)胞核出現(xiàn)固縮形態(tài)和顆粒狀熒光，給予高、中、低劑量(高：1.25×10-3mg/mL，中：1.25×10-4mg/mL，低：1.25×10-5mg/mL)補(bǔ)腦軟膠囊內(nèi)容物孵育后，細(xì)胞顆粒狀熒光及固縮形態(tài)明顯減少。見(jiàn)圖2。

4 討論

阿爾茨海默病( AD)嚴(yán)重影響人類(lèi)晚年的生活質(zhì)量，已經(jīng)成為當(dāng)今社會(huì)關(guān)注和科學(xué)研究的重點(diǎn)疾病之一。長(zhǎng)期以來(lái)，老年癡呆發(fā)病機(jī)制形成了多種假說(shuō)，β-淀粉樣蛋白( Aβ)學(xué)說(shuō)引起了眾多研究者的關(guān)注[17-18]。該假說(shuō)認(rèn)為Aβ在AD的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用。Aβ可誘發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，從而引起神經(jīng)細(xì)胞功能紊亂和死亡，最終導(dǎo)致AD的發(fā)生[16]。

圖2 Hoechst33258染色觀察細(xì)胞凋亡情況

本研究結(jié)果顯示，SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞采用Aβ1-42造模損傷后，與空白組比較，細(xì)胞折光度下降，突觸收縮，貼壁狀態(tài)不良，細(xì)胞存活率下降，顯示Aβ1-42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞AD體外模型構(gòu)建成功。補(bǔ)腦軟膠囊用藥組顯示細(xì)胞突觸結(jié)構(gòu)消失減少，細(xì)胞貼壁狀態(tài)明顯改善，細(xì)胞形態(tài)學(xué)顯示補(bǔ)腦軟膠囊對(duì)SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。利用Hoechst33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，對(duì)照組細(xì)胞核呈現(xiàn)均勻的弱熒光，Aβ1-42模型組細(xì)胞核出現(xiàn)固縮形態(tài)和顆粒狀熒光，補(bǔ)腦軟膠囊用藥組顯示細(xì)胞核顆粒狀熒光及固縮形態(tài)明顯減少，表明補(bǔ)腦軟膠囊可有效抑制Aβ1-42引起的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，對(duì)Aβ1-42損傷的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞具有明顯的修復(fù)和保護(hù)作用。