朱智德 王慶高 韓景波 竇維華 蔣志雄 陳 煒,3

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)博物館，南寧市 530001，電子郵箱：gxzhuzhide@163.com；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管科，南寧市 530023；3 廣西中醫(yī)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實驗室， 南寧市 530200)

病毒性心肌炎是指由病毒感染引起的局限性或彌漫性心肌炎性病變，是目前各種原因引起的心肌炎中發(fā)病率最高的類型之一[1]。柯薩奇病毒B3型(Coxsackie virus B3，CVB3)是病毒性心肌炎的主要致病因素[2]。近年研究顯示，替代活化途徑的巨噬細(xì)胞又稱M2型巨噬細(xì)胞，在巨噬細(xì)胞所致的急性炎癥過程中起重要的負(fù)向調(diào)控作用[3-4]。M2型巨噬細(xì)胞在急性感染時期可以減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而阻止急性炎性損害[5-6]。綠原酸又名咖啡鞣酸，是由咖啡酸與奎尼酸合成的縮酚酸，屬于苯丙素類化合物?，F(xiàn)研究已發(fā)現(xiàn)綠原酸具有心血管保護(hù)、抗誘變及抗癌、抗菌及抗病毒、降脂、抗白血病、免疫調(diào)節(jié)、降糖等多種藥理學(xué)活性，但綠原酸是否能通過調(diào)控巨噬細(xì)胞活化，起到控制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)干擾素分泌的作用，仍有待探索。本研究擬通過探索綠原酸對CVB3介導(dǎo)的RAW 264.7小鼠巨噬細(xì)胞活化途徑的影響，明確綠原酸激活M2巨噬細(xì)胞活化的機(jī)制，為進(jìn)一步開發(fā)有效治療急性病毒性心肌炎的藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑 RAW 264.7小鼠巨噬細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。杜氏改良依格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified eagle medium,DMEM)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸細(xì)胞消化液、青/鏈霉素細(xì)胞培養(yǎng)添加劑等細(xì)胞培養(yǎng)用試劑均購自美國Gibco公司(批號：11965092、10010023、12483020、25200072、15240062)，綠原酸(批號：C3878)等生化試劑均購自美國Sigma公司，β-肌動蛋白(β-actin)(批號：ab8227)，信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(signal transducer and activator of transcription,STAT)6及Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor 4,KLF4)抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG H&L(二抗)均購自英國Abcam公司(批號：ab32520、ab215036、ab6721)，F(xiàn)izz1、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β,TGF-β)及血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)的酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒購自江蘇酶免實業(yè)有限公司(批號：MM-0837M1、MM-45041M1、MM-0070M1)，細(xì)胞計數(shù)(cell count kit 8，CCK-8)檢測試劑盒(批號：CA1210)、RNA提取試劑(批號：R1100)、反轉(zhuǎn)錄試劑(批號：RP1100)、PCR擴(kuò)增試劑(批號：SR1110)均購自中國Solarbio公司，RIPA蛋白提取試劑(批號：R0010)、ECL電化學(xué)發(fā)光試劑盒(批號：PE0010)等免疫印跡實驗所使用相關(guān)試劑及耗材均購自中國Solarbio公司。CVB3購自北納生物(批號：BNCC170424)。PCR檢測所用引物由上海生工合成。

1.2 細(xì)胞活力檢測 將RAW 264.7細(xì)胞置于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每2 d換液一次，取對數(shù)生長期RAW 264.7細(xì)胞，消化后將細(xì)胞接種于96孔板中，接種密度為5×103個/孔，加入不同濃度(0、12.5、25、50、100、200、400、600、800、1 000 μg/mL)綠原酸，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)2 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于酶標(biāo)儀上讀取A450的A值，依照公式計算各組細(xì)胞活力：細(xì)胞活力(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)]×100%。

1.3 細(xì)胞分組及干預(yù) 將RAW 264.7細(xì)胞置于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每2 d換液一次，細(xì)胞生長至對數(shù)期后將細(xì)胞鋪至12孔板，待細(xì)胞匯合度至75%時進(jìn)行后續(xù)干預(yù)操作。將細(xì)胞分為空白對照組、CVB3刺激組、CVB3刺激+綠原酸低劑量組、CVB3刺激+綠原酸中劑量組、CVB3刺激+綠原酸高劑量組。其中，CVB3感染劑量為107TCID50/L，藥物干預(yù)組細(xì)胞經(jīng)CVB3干預(yù)24 h后再根據(jù)分組給予藥物干預(yù)；綠原酸粉末溶于二甲基亞砜，儲液濃度為10 mg/mL，按照實驗濃度要求每組添加相應(yīng)濃度綠原酸，其中低劑量、中劑量、高劑量分別為25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL。空白對照組加入1%二甲基亞砜作為溶劑對照。藥物干預(yù)期間將細(xì)胞置于37℃，5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)，培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞上清液及細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗，實驗重復(fù)3次。

1.4 實時PCR檢測 干預(yù)72 h后，收集各組細(xì)胞，按照RNA提取試劑盒說明書提取各組細(xì)胞總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR體系配比，反應(yīng)體系：2×SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL，Primer F(10 μM) 1μL，上下游引物(10 μM)各1 μL，cDNA 2μL，ddH2O 8.5 μL。于ABI 7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)(熱啟動95℃，10 min；變性95℃，10 s；退火/延伸60℃，35 s，共40個循環(huán)；溶解曲線分析)。獲得實驗數(shù)據(jù)，以β-肌動蛋白(β-actin)基因為內(nèi)參，經(jīng)2-ΔΔCt法計算各基因相對表達(dá)量。引物序列如下：β-actin上游引物5′-CCACCATGTACCCAGGCATT，下游引物5′-CGGACTCATCGTACTCCTGC-3′；白細(xì)胞介素13 α1受體(interleukin 13 receptor α1,IL-13Rα1)上游引物5′-ACTATTGGAGCACGGCACAA-3′，下游引物5′-TCCCAGCTGCAAGCTGATAC-3′；白細(xì)胞介素4α受體(interleukin 4 receptor α,IL-4Rα)上游引物5′-TCTACTATACGGCGCGTGTG-3′，下游引物5′-ATTCCCGTGAGCTCTCCTCA-3′；STAT6上游引物5′-GTGTGAAAGCCTGGTGGAAAT-3′，下游引物5′-GGACTTCATCCAGACGGCTT-3′；KLF4上游引物5′-CGATGAACTGACCAGGCACT-3′，下游引物5′-CCATGATTGTAGCGCTTGCC-3′。

1.5 免疫印跡實驗檢測 干預(yù)72 h后，收集各組細(xì)胞，依照RIPA蛋白提取試劑盒說明書操作步驟提取細(xì)胞總蛋白，并進(jìn)行變性處理。蛋白定量后進(jìn)行二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯膜上，經(jīng)8%脫脂奶粉在24℃下封閉2 h后，置于4℃條件下孵育一抗(STAT6、KLF4、β-actin稀釋比例分別為1 ∶1 000、1 ∶2 000、1 ∶5 000)12 h，經(jīng)PBST洗脫，再于37℃下孵育對應(yīng)二抗(稀釋比例1 ∶10 000)2 h，后使用ECL電化學(xué)發(fā)光試劑盒，于Tanon 5200多功能成像儀(上海天能)上進(jìn)行曝光成像。使用Image J軟件讀取各組光密度值，目的蛋白光密度值/內(nèi)參蛋白光密度值即為蛋白相對表達(dá)量。

1.6 ELISA檢測 干預(yù)72 h后，取細(xì)胞上清液，在4℃下經(jīng)3 000 r/min離心5 min后，根據(jù)Fizz1、TGF-β及PDGF的ELISA檢測試劑盒說明書，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線、空白對照及樣本檢測孔，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附及抗體結(jié)合、化學(xué)顯色等步驟，使用FilterMX F5型多功能酶標(biāo)儀(MD公司)在A450處讀取A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各組各指標(biāo)表達(dá)量，進(jìn)行作圖及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 使用GraphPad Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)制圖，SPSS 25.00軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 綠原酸對RAW 264.7細(xì)胞活性的影響 分別使用不同濃度綠原酸干預(yù)細(xì)胞后，RAW 264.7細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(median inhibition concentration,IC50)為285.2 μg/mL。在≤100 μg/mL的藥物濃度干預(yù)下，細(xì)胞可保持80%以上活力，藥物濃度>200 μg/mL時，細(xì)胞活力顯著降低，見圖1。

圖1 各濃度綠原酸干預(yù)下RAW 264.7細(xì)胞活性

2.2 綠原酸對RAW 264.7細(xì)胞分泌炎癥因子及生長因子的影響 與空白對照組相比，CVB3刺激組和CVB3刺激+綠原酸低劑量組細(xì)胞上清液中Fizz1相對表達(dá)量降低，TGF-β及PDGF相對表達(dá)量升高(均P<0.05)，CVB3刺激+綠原酸中劑量組細(xì)胞上清液中TGF-β相對表達(dá)量亦升高(P<0.05)，但CVB3刺激+綠原酸高劑量組各因子相對表達(dá)量與空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。與CVB3刺激組相比，CVB3刺激+綠原酸中劑量組、CVB3刺激+綠原酸高劑量組細(xì)胞上清液中Fizz1相對表達(dá)量升高，且CVB3刺激+綠原酸高劑量組細(xì)胞上清液中TGF-β及PDGF相對表達(dá)量降低(均P<0.05)。見表1。

表1 5組RAW 264.7細(xì)胞上清液Fizz1、TGF-β及PDGF相對表達(dá)量對比(x±s)

2.3 綠原酸對RAW264.7細(xì)胞替代途徑活化相關(guān)因子mRNA及蛋白表達(dá)的影響 與空白對照組相比，CVB3刺激組和CVB3刺激+綠原酸低劑量組的IL-13Rα1、IL-4Rα、STAT6、KLF4 mRNA以及STAT6、KLF4蛋白的相對表達(dá)水平均降低(均P<0.05)，CVB3刺激+綠原酸中劑量組IL-13Rα1、STAT6、KLF4 mRNA以及KLF4蛋白的相對表達(dá)水平亦降低(均P<0.05)。與CVB3刺激組相比，CVB3刺激+綠原酸中劑量組和CVB3刺激+綠原酸高劑量組IL-13Rα1、IL-4Rα、STAT6、KLF4 mRNA以及STAT6、KLF4蛋白的相對表達(dá)水平均升高(均P<0.05)，其中除IL-13Rα1 mRNA以及KLF4蛋白的相對表達(dá)水平外，CVB3刺激+綠原酸高劑量組其他因子mRNA及STAT6蛋白的相對表達(dá)水平與空白對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表2和圖2。

表2 5組RAW 264.7細(xì)胞相關(guān)因子mRNA及蛋白表達(dá)水平的對比(x±s)

圖2 5組RAW 264.7細(xì)胞STAT6及KLF4蛋白表達(dá)情況

3 討 論

病毒性心肌炎臨床表現(xiàn)不一，嚴(yán)重者出現(xiàn)進(jìn)行性心臟擴(kuò)大、心力衰竭等情況，8%～12%的患者會出現(xiàn)猝死[7]，疾病譜的復(fù)雜性使其診斷和治療成為臨床上的一大難點(diǎn)。病毒感染引起心肌炎的機(jī)制尚不十分明確，目前普遍認(rèn)為主要的機(jī)制為病毒直接損害心肌以及病毒感染后機(jī)體自身的免疫反應(yīng)引起損傷，與機(jī)體的過度炎癥反應(yīng)關(guān)系密切[8]。病毒進(jìn)入心肌細(xì)胞后，進(jìn)行復(fù)制的同時表達(dá)病毒蛋白并釋放病毒顆粒，而巨噬細(xì)胞吞噬病毒顆粒，釋放相關(guān)因子并提呈抗原，啟動體液及細(xì)胞免疫，在局部釋放出炎性因子(如腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素、干擾素等)，故其在清除病毒的同時也加劇心肌的炎癥反應(yīng)[9]。這種紊亂可能會導(dǎo)致持續(xù)性心肌損傷，從而使病情進(jìn)一步惡化[10]。因此，在病毒性心肌炎的急性進(jìn)展過程中，控制過強(qiáng)的炎癥反應(yīng)，是避免心臟組織進(jìn)行性損害、降低急性期死亡率的一種可行性手段。使用免疫球蛋白和免疫抑制劑等免疫調(diào)節(jié)劑治療病毒性心肌炎是目前主流的方法[11-12]，但存在價格昂貴、貨源不穩(wěn)定、藥理作用機(jī)制不明確等缺點(diǎn)[13]。因此，臨床迫切需要一種在病毒性心肌炎急性期控制過強(qiáng)免疫反應(yīng)，但又不會明顯抑制機(jī)體免疫功能的藥物。

巨噬細(xì)胞可被極化為兩個亞群，分別為經(jīng)典途徑活化的巨噬細(xì)胞(M1型巨噬細(xì)胞)和替代途徑活化的巨噬細(xì)胞(M2型巨噬細(xì)胞)[3]，其中M1型巨噬細(xì)胞和經(jīng)典的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，而M2型巨噬細(xì)胞在急性感染時期能減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而阻止急性炎性損害[4]。因此，如果在病毒感染的早期采用有效的方法調(diào)控M2型巨噬細(xì)胞，則將能有效控制急性病毒性心肌炎患者心功能的進(jìn)行性惡化[14-15]。巨噬細(xì)胞表面的IL-4Rα/IL-13Rα1復(fù)合體可與IL-13結(jié)合，啟動巨噬細(xì)胞替代活化途徑，促進(jìn)其下游STAT6表達(dá)，抑制STAT1活性，避免巨噬細(xì)胞向經(jīng)典途徑活化，并誘導(dǎo)生成KLF-4等細(xì)胞因子，協(xié)同抑制NF-κB p50/p65復(fù)合體生成，并促進(jìn)Fizz1表達(dá)及膠原沉積，從而阻止過強(qiáng)的炎癥反應(yīng)產(chǎn)生[16-17]。本研究中，RAW 264.7小鼠巨噬細(xì)胞經(jīng)CVB3刺激后，細(xì)胞上清液中Fizz1表達(dá)降低而TGF-β、PDGF表達(dá)升高，且IL-13Rα1、IL-4Rα、STAT6、KLF4 mRNA以及STAT6、KLF4蛋白的相對表達(dá)水平均降低，這表明RAW 264.7細(xì)胞呈向M2型分化的趨勢。

綠原酸廣泛存在于植物中，以金銀花、杜仲中的含量較高，具有廣泛的藥理作用。本研究結(jié)果表明，在體外培養(yǎng)RAW 264.7細(xì)胞過程中添加綠原酸，藥物濃度≤100 μg/mL時細(xì)胞活力無顯著降低現(xiàn)象，因此后續(xù)實驗的藥物干預(yù)濃度均未超過100 μg/mL。經(jīng)高劑量綠原酸干預(yù)后，與CVB3刺激組比較，RAW 264.7細(xì)胞上清液中Fizz1相對表達(dá)量升高而TGF-β及PDGF相對表達(dá)量降低(P<0.05)，且這些細(xì)胞因子表達(dá)量與空白對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；此外，替代途徑活化相關(guān)因子mRNA及蛋白表達(dá)水平均較CVB3刺激組升高(P<0.05)，其中IL-4Rα、STAT6、KLF4 mRNA以及STAT6蛋白與空白對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。這表明高劑量綠原酸可抑制經(jīng)典炎癥活化途徑，使得RAW 264.7細(xì)胞向M2型分化，并可抑制巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子。然而，經(jīng)低劑量的綠原酸干預(yù)后RAW 264.7細(xì)胞中的外泌細(xì)胞因子和替代途徑活化相關(guān)因子的表達(dá)并無明顯變化，而經(jīng)中劑量的綠原酸干預(yù)后RAW 264.7細(xì)胞中的大部分上述因子的表達(dá)有所改善，但未達(dá)到空白對照組水平，因此100 μg/mL的高劑量綠原酸干預(yù)效果較好。

綜上所述，在體外培養(yǎng)RAW 264.7細(xì)胞的過程中，100 μg/mL的高劑量綠原酸可逆轉(zhuǎn)由CVB3介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M2型分化，并抑制炎癥因子的分泌，從而降低炎癥水平。因此推測，綠原酸可抑制病毒性心肌炎引發(fā)的體內(nèi)炎癥反應(yīng)惡性循環(huán)，達(dá)到阻斷過強(qiáng)炎癥反應(yīng)的目的，有望成為抑制病毒性心肌炎急性期免疫反應(yīng)的臨床藥物。