谷 敏, 馮菲菲, 甘雪晴, 李 霜, 孫雄山△, 楊大春,△
(1西南交通大學醫(yī)學院,四川成都610031;2西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科,四川成都610083)
心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是全球范圍內(nèi)第一位致死、致殘原因[1]。冠狀動脈、頸動脈和其他外周動脈粥樣硬化作為常見的血管疾病,經(jīng)皮介入治療是重要的干預(yù)手段。血管再狹窄是血管介入治療的主要并發(fā)癥,會導(dǎo)致嚴重心血管不良事件,同時也限制了支架的效用[2]。在血管再狹窄的發(fā)生發(fā)展過程中,首先是血管內(nèi)皮受到機械性損傷,隨后活化的血小板和炎癥細胞聚集在受損區(qū)域并分泌多種細胞因子,如血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)和白細胞介素6等,這些生長因子和炎癥介質(zhì)會促進血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)增殖和遷移,從而導(dǎo)致新生內(nèi)膜增生和再狹窄[3]。目前,血管再狹窄的分子調(diào)控機制主要包括磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋 白 激 酶B(protein kinase B,PKB/AKT)等[4],但針對這些機制的防治措施仍不能完全遏制再狹窄的發(fā)生。因此,揭示再狹窄的潛在機制和尋找新的治療靶點是亟待解決的問題。
Ⅲ型磷脂酰肌醇3-磷酸5-激酶(phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase type III,PIKfyve)是一種進化上相對保守的脂質(zhì)激酶,可以催化其相應(yīng)的底物合成磷脂酰肌醇5-磷酸(phosphatidylinositol 5-phosphate,PtdIns5P)和磷脂酰肌醇3,5-二磷酸(phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate,PtdIns3,5P2)[5]。PIKfyve在哺乳動物心臟、血管、腦、骨骼肌和脂肪等組織表達豐富,最近多項研究顯示PIKfyve 在血管鈣化和心肌肥厚等心血管疾病中也發(fā)揮重要作用[6-7]。VSMC作為血管壁的主要構(gòu)分,其在病理刺激下過度增殖和遷移在血管內(nèi)膜增生和再狹窄中發(fā)揮重要作用[8]。有研究表明,抑制PIKfyve可以降低肝癌細胞、淋巴瘤細胞、成纖維細胞等的增殖和遷移[9-11],但是PIKfyve 在VSMC 增殖、遷移及血管內(nèi)膜增生中的作用目前并不清楚。本實驗使用PDGF-BB 干預(yù)VSMC誘導(dǎo)體外增殖和遷移,并且構(gòu)建小鼠頸動脈內(nèi)皮損傷模型[12],探討PIKfyve 對VSMC 增殖和遷移及血管內(nèi)膜增生的影響,以期為血管再狹窄的治療提供參考資料。
1.1 動物和細胞 8~10 周齡SPF 級C57BL/6J 雄性野生型小鼠50只,體重25 g左右,購自成都達碩生物有限公司,許可證號:SCXK(川)2020-030。日夜規(guī)律光照各12 h,自由攝入水和食物,飼養(yǎng)室內(nèi)保持恒溫22~25℃。使用酶消化分離法從8~10 周小鼠胸主動脈中分離出VSMC。
1.2 主要試劑 DMEM 高糖培養(yǎng)液及0.25%胰蛋白酶(HyClone);胎牛血清(Gibco);HE 染色試劑盒(Solarbio);RNA 提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR(TaKaRa);qPCR 引物由成都擎科偉業(yè)生物技術(shù)有限公司合成;PIKfyve 抑制劑YM201636(MCE);PIKfyve 抗體(Santa Cruz);PIKfyvesiRNA 由廣州銳博生物公司合成;GAPDH、核糖體蛋白S6(ribosomal protein S6,S6)、磷酸化(phospho,p)-S6Ser235/236、4E 結(jié) 合 蛋 白1(4E-binding protein 1,4EBP1)和p-4EBP1Thr37/46抗體(Cell Signaling Technology);Ki-67抗體(Bioss);山羊抗兔Ⅱ抗和山羊抗鼠Ⅱ抗(Solarbio);PDGF-BB(PeproTech);ECL 發(fā)光液(Millipore);重組人胰島素(Solarbio)。
2.1 小鼠VSMC 的培養(yǎng)及分組 用酶消化分離法從8~10 周小鼠胸主動脈中分離出VSMC,用含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)液培養(yǎng),置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育。隨后每2 d 更換培養(yǎng)液,待細胞生長融合至約90%時,用0.25%胰酶消化后按照1∶2 或1∶3 傳代培養(yǎng)。選擇處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗。用PDGF-BB 干預(yù)VSMC 誘導(dǎo)體外的增殖和遷移,用PIKfyve特異性siRNA 敲減PIKfyve的表達,用PIKfyve 抑制劑YM201636 抑制PIKfyve 活性,用胰島素激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)的活性。為觀察敲減PIKfyve表達對VSMC 增殖和遷移的影響,將VSMC 分為DMSO+siCon 組、PDGF-BB+siCon 組、DMSO+siPIKfyve 組和PDGF-BB+siPIKfyve組,各組在成功轉(zhuǎn)染對照siRNA 載體或者PIKfyvesiRNA 后加入PDGF-BB(30 μg/L)或者DMSO 干預(yù)24 h。為觀察抑制PIKfyve 活性對VSMC 增殖和遷移的 影 響,將VSMC 分 為DMSO 組、PDGF-BB 組、YM201636 組和PDGF-BB+YM201636 組,按 分組加入YM201636(1 μmol/L)或DMSO 預(yù)孵育12 h,再加入PDGF-BB 或DMSO 共孵育24 h。為進一步研究PIKfyve 通過影響mTORC1 活性調(diào)控VSMC 增殖和遷移,在敲減PIKfyve表達或抑制其活性的基礎(chǔ)上,加入胰島素(5 mg/L)孵育24 h。
2.2 細胞PIKfyvesiRNA 轉(zhuǎn)染 將細胞懸液鋪于孔板中,細胞生長至大約40%時候按照試劑使用說明用Lipofectamine 2000 作為轉(zhuǎn)染試劑以50 nmol/L 濃度進行PIKfyvesiRNA 或?qū)φ蛰d體轉(zhuǎn)染,每組設(shè)3 個復(fù)孔。PIKfyvesiRNA序列:5"-GUUGUCAAUGGCUUUGUUU-3"和5"-AAACAAAGCCAUUGACAAC-3"[6]。
2.3 Ki-67免疫熒光染色檢測細胞增殖 在24孔板中放入爬片,加入細胞懸液,按前述分組干預(yù)完成后倒掉培養(yǎng)液,用PBS浸洗爬片3次,4%多聚甲醛固定30 min 以上,PBS 洗3 次,0.3%~0.5%的TritonX-100室溫通透15 min,PBS 洗3 次,吸水紙吸干,山羊血清室溫封閉30 min,吸水紙吸掉封閉液,每張玻片滴加足量的Ⅰ抗并放入濕盒中4℃過夜。之后PBS洗滌3次,滴加稀釋好的熒光Ⅱ抗(此后在暗室操作),濕盒37℃孵育1 h,滴加DAPI復(fù)染核5 min,PBS洗掉多余的DAPI,吸水紙吸干液體后用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,在熒光顯微鏡下采集圖像。
2.4 劃痕實驗檢測細胞遷移 用記號筆在6 孔板背后均勻地劃橫線,大約每隔0.5~1 cm一道,每孔有5 條橫線穿過。于6 孔板中鋪細胞,待細胞鋪滿后用無菌10 μL 吸頭垂直于橫線劃一條痕。用PBS 洗細胞3 次,洗去多余懸浮細胞,拍攝0 h 照片。加入無血清培養(yǎng)液,按實驗要求進行干預(yù),放入孵育箱中培養(yǎng),24 h后在光學顯微鏡下拍照。
2.5 qPCR 檢測PIKfyve mRNA 表達水平 用RNA提取試劑盒,并根據(jù)說明書提取VSMC 的總RNA。標準化各組RNA 濃度,反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后進行擴增,以GAPDH 為內(nèi)參照,用2-ΔΔCt法計算PIKfyv 的相對表達量。PIKfyv 的上游引物序列為5"-ATGGCCACAGATGACAAGAGTTCC-3",下游引物序列為5"-CAGACTGTGTTCTTGAAGGG-3"[6];GAPDH 的 上 游引物序列為5"-AATGGATTTGGACGCATTGGT-3",下游引物序列為5"-TTTGCACTGGTACGTGTTGAT-3"。
2.6 Western blot 檢測細胞PIKfyve 表達和反映mTORC1 活性的靶分子S6(Ser235/236)和4EBP1(Thr37/46)的磷酸化水平 提取血管或VSMC 蛋白,按照蛋白提取試劑盒說明書進行。測定蛋白濃度,取蛋白樣品行SDS-PAGE 分離,然后轉(zhuǎn)至PVDF 膜上,5%脫脂奶粉或胎牛血清中室溫封閉1 h。加入相 應(yīng) 的Ⅰ抗(PIKfyve、S6、p-S6Ser235/236、4EBP1、p-4EBP1Thr37/46和GAPDH 抗體,均按1∶1 000 稀釋),于4℃過夜孵育。次日TBST洗膜后再用Ⅱ抗(1∶10 000)常溫孵育1 h。再次TBST 洗膜后使用ECL 發(fā)光液顯色,用ImageJ軟件分析結(jié)果。
2.7 動物分組及小鼠頸動脈內(nèi)皮損傷模型的建立 為觀察PIKfyve 在血管內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜增生中的作用,將20 只野生型小鼠隨機分為假手術(shù)組、頸動脈內(nèi)皮損傷組、YM201636(PIKfyve 活性抑制劑)組和頸動脈內(nèi)皮損傷+YM201636 組,每組5 只。小鼠頸動脈內(nèi)皮損傷模型的建立:按照參考文獻[12],小鼠稱重后用0.3%的戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射以麻醉小鼠,固定在手術(shù)臺上;頸部皮膚脫毛并用碘伏消毒,在頸部正中切開1 cm左右小口,分離小鼠左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈,用血管夾暫時夾閉頸總動脈近心端和頸內(nèi)動脈,結(jié)扎頸外動脈遠心端,用0.38 mm 粗糙導(dǎo)絲從頸外動脈近心端插入頸總動脈,來回旋轉(zhuǎn)通過3 次以損傷血管內(nèi)皮,迅速取出導(dǎo)絲,結(jié)扎頸外動脈穿刺段,松開血管夾恢復(fù)血流,縫合小鼠頸部切口。假手術(shù)組小鼠與模型組小鼠操作相同但不用導(dǎo)絲損傷頸動脈內(nèi)皮。術(shù)后按分組腹腔注射生理鹽水或YM201636(2 mg·kg-1·d-1),持續(xù)15 d。28 d 后,處死小鼠,取出頸總動脈,用4%多聚甲醛固定,以備后續(xù)使用。
2.8 HE 染色 取材,固定,石蠟包埋,切片。用二甲苯脫蠟,經(jīng)各級乙醇及水洗,蘇木素染色5 min,自來水沖洗。鹽酸乙醇分化2~10 s,自來水沖洗2 min,伊紅染色30 s~2 min,自來水沖掉多余染液,約10 s,晾干,中性樹膠封片、鏡檢、采圖。
采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析;兩組之間的比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
qPCR 和Western blot 結(jié) 果 顯 示,與DMSO 組 相比,PDGF-BB 組VSMC 中PIKfyve 的mRNA 表達增加(P<0.01),蛋白水平亦顯著升高(P<0.01),見圖1。
Figure 1. The mRNA and protein levels of PIKfyve were increased in mouse VSMC treated by PDGF-BB. A:the mRNA expression of PIKfyve was detected by qPCR;B:the protein expression of PIKfyve was determined by Western blot. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs DMSO group.圖1 PDGF-BB 增加 了小 鼠VSMC 中PIKfyve 的mRNA 和蛋白表達水平
Ki-67 免疫熒光染色結(jié)果顯示,PDGF-BB 處理后VSMC中Ki-67陽性細胞率增加(P<0.01);與DMSO+siCon 組相比,無論是否經(jīng)過PDGF-BB 處理,敲減PIKfyve表達均顯著降低Ki-67 陽性細胞率(P<0.01);在敲減PIKfyve的前提下,DMSO 和PDGF-BB處理VSMC 的Ki-67 陽性細胞率無顯著差異,見圖2A。劃痕實驗結(jié)果顯示,與DMSO+siCon 組相比,PDGF-BB 使VSMC 劃痕愈合速度增快(P<0.01),敲減PIKfyve使劃痕愈合速度減慢(P<0.01);與PDGFBB+siCon 組相比,PDGF-BB+siPIKfyve 組劃痕愈合速度也顯著減慢(P<0.01);在敲減PIKfyve 的前提下,DMSO 和PDGF-BB 處理VSMC 的劃痕愈合速度無顯著差異,見圖2B。
Ki-67 免疫熒光染色結(jié)果顯示,與DMSO 組相比,PDGF-BB 增 加Ki-67 陽 性 細 胞率(P<0.01),YM201636 組Ki-67 陽性細胞率顯著降低(P<0.01);與PDGF-BB 組相比,PDGF-BB+YM201636 組的Ki-67 陽性細胞率也顯著降低(P<0.01);YM201636 組與PDGF-BB+YM201636 組的Ki-67 陽性細胞率無顯著差異,見圖3A。劃痕實驗結(jié)果顯示,與DMSO 組相比,PDGF-BB 組劃痕愈合速度增快(P<0.01),YM201636 組 劃 痕 愈 合 速 度 減 慢(P<0.01);與PDGF-BB 組相比,PDGF-BB+YM201636 組劃痕愈合速度也顯著減慢(P<0.01);YM201636 組和PDGFBB+YM201636 組劃痕愈合速度無顯著差異,見圖3B。
S6(Ser235/236)和4EBP1(Thr37/46)的磷酸化是反映mTORC1 活性的下游靶分子。與DMSO+si-Con 組相比,PDGF-BB 處理使VSMC 的p-S6Ser235/236和p-4EBP1Thr37/46蛋白水平顯著增加(P<0.05),而敲減PIKfyve使p-S6Ser235/236和p-4EBP1Thr37/46蛋白水平顯著降低(P<0.05);與DMSO+siPIKfyve 組相比,在敲減PIKfyve的基礎(chǔ)上再進行PDGF-BB 干預(yù),也不能增加p-S6Ser235/236和p-4EBP1Thr37/46蛋 白 水 平,見 圖4。與PDGF-BB+siPIKfyve 組相比,胰島素的加入增加了p-S6Ser235/236和p-4EBP1Thr37/46蛋白水平,表明胰島素恢復(fù)了mTORC1 活性,見圖5A;而在利用胰島素恢復(fù)mTORC1 活 性 后,敲 減PIKfyve對PDGF-BB 處 理 后Ki-67 陽性細胞率上升和劃痕愈合速率增快的抑制作用消失,見圖5B、C。
Western blot 結(jié)果顯示,與DMSO 組相比,PDGF-BB 組VSMC 的p-S6Ser235/236和p-4EBP1Thr37/46蛋白水平增加(P<0.05),YM201636 組p-S6Ser235/236和p-4EBP1Thr37/46蛋白水平降低(P<0.05);與PDGF-BB 組相 比,PDGF-BB+YM201636 組 p-S6Ser235/236和 p-4EBP1Thr37/46蛋 白 水 平 也 顯 著 降 低(P<0.01);YM201636 組與PDGF-BB+YM201636 組無顯著差異,見圖6A。而在利用胰島素恢復(fù)mTORC1 活性后,PIKfyve 失活對PDGF-BB 處理后Ki-67 陽性細胞率上升和劃痕愈合速率增快的抑制作用消失,見圖6B、C。
Figure 2. PIKfyve knockdown suppressed PDGF-BB-induced proliferation and migration of mouse VSMC. A:the proliferation of the cells was detected by Ki-67 staining;B:the migration of the cells was detected by scratch test. Scale bar=50 μm. Mean±SD. n=5. **P<0.01 vs DMSO+siCon group;##P<0.01 vs PDGF-BB+siCon group.圖2 敲減PIKfyve表達抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的小鼠VSMC增殖和遷移
Western blot 檢測小鼠頸動脈PIKfyve 表達水平,與假手術(shù)組相比,頸動脈內(nèi)皮損傷組PIKfyve 的表達顯著增加(P<0.01),見圖7A。HE 染色結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,頸動脈內(nèi)皮損傷組內(nèi)膜增生明顯,內(nèi)膜/中膜面積比值增高(P<0.01);與假手術(shù)組相比,假手術(shù)+YM201636 組管腔狹窄程度和內(nèi)膜/中膜面積比值無顯著差異;與頸動脈內(nèi)皮損傷組相比,頸動脈內(nèi)皮損傷+YM201636 組頸動脈管腔狹窄程度減輕,內(nèi)膜/中膜面積比值顯著降低(P<0.01),見圖7B。
血管經(jīng)皮介入治療是一種廣泛應(yīng)用于動脈粥樣硬化相關(guān)疾病如冠心病的治療策略,然而,血管再狹窄已成為限制其臨床療效的嚴重并發(fā)癥。血管再狹窄的起始步驟是支架等機械性損傷血管內(nèi)皮[8],隨后,活化的血小板和炎癥細胞聚集在受損區(qū)域并分泌多種細胞因子,如PDGF、白細胞介素6、白細胞介素1β 等[13]。這些生長因子和炎癥介質(zhì)會促進VSMC從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)樵鲋承?,其特征是增殖、遷移增加,從而導(dǎo)致新生內(nèi)膜增生和再狹窄[3,14]。VSMC 的增殖和遷移是防治血管再狹窄的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究使用PDGF-BB 模擬小鼠血管受損后釋放的PDGF的作用,以誘導(dǎo)體外的增殖和遷移,探討PIKfyve 對VSMC增殖和遷移的作用及其機制。
Figure 4. PIKfyve knockdown reduced the activity of mTORC1 in mouse VSMC. The protein levels of p-S6,S6,p-4EBP1 and 4EBP1 were determined by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05,**P<0.01 vs DMSO+siCon group;##P<0.01 vs PDGF-BB+si-Con group.圖4 敲減PIKfyve表達降低了小鼠VSMC中mTORC1活性
Figure 5. Activation of mTORC1 by insulin reversed the inhibitory effect of PIKfyve knockdown on proliferation and migration of mouse VSMC exposed to PDGF-BB. A:insulin restored the activity of mTORC1(n=3);B:activation of mTORC1 by insulin reversed the inhibitory effect of PIKfyve knockdown on proliferation of VSMC(n=5);C:insulin reversed the inhibitory effect of PIKfyve knockdown on migration of VSMC(n=5). Scale bar=50 μm. Mean±SD. *P<0.05,**P<0.01 vs PDGFBB+siCon group;##P<0.01 vs PDGF-BB+siPIKfyve group.圖5 胰島素激活mTORC1逆轉(zhuǎn)了敲減PIKfyve對PDGF-BB誘導(dǎo)的小鼠VSMC增殖和遷移的抑制作用
PIKfyve 是一種相對保守的脂質(zhì)激酶,其主要生理功能為糖代謝調(diào)控、抑制肥胖、內(nèi)體運輸和調(diào)節(jié)自噬等[15-17]。既往研究顯示PIKfyve 在心臟、脂肪、血管和骨骼肌等組織中豐富表達[17]。Tronchere 等[6]的研究結(jié)果表明,PIKfyve 的抑制通過sirtuin-3 依賴性途徑減輕心肌細胞線粒體活性氧產(chǎn)生并減少細胞凋亡,在高脂致肥胖小鼠模型中,PIKfyve 的抑制減輕心肌肥大并改善心臟功能。Cao 等[7]使用螢光素酶實驗鑒定PIKfyve為微小RNA(microRNA,miR)-32-5p的靶基因,并認為PIKfyve 通過抑制BV2細胞中腫瘤壞死因子α 的產(chǎn)生進而減輕血管的鈣化。上述研究表明PIKfyve 在心臟和血管中發(fā)揮重要作用,但PIKfyve 在機械性損傷后血管內(nèi)膜增生中的作用及機制尚未明確。研究表明,抑制PIKfyve 可以降低多種細胞如肝癌細胞、淋巴瘤細胞、成纖維細胞等的增殖和遷移[9-11],但其在VSMC 增殖和遷移中是否發(fā)揮調(diào)控作用并不清楚。本研究顯示PIKfyve 在PDGFBB 處理后的VSMC 中表達增加,而降低PIKfyve 活性或敲減PIKfyve表達,均可以抑制PDGF-BB 誘導(dǎo)的VSMC 增殖和遷移。這說明PIKfyve 表達上調(diào)可以促進VSMC 的增殖和遷移過程,但是其調(diào)控VSMC 增殖和遷移的機制目前暫不清楚。
Figure 6. PIKfyve inactivation inhibited the proliferation and migration of mouse VSMC via reducing mTORC1 activity. A:PIKfyve inactivation reduced the activity of mTORC1 in VSMC(n=3);B:activation of mTORC1 by insulin reversed the effect of PIKfyve inactivation on proliferation of VSMC(n=5);C:insulin reversed the effect of PIKfyve inactivation on migration of VSMC(n=5). Scale bar=50 μm. Mean±SD. *P<0.05 vs DMSO group;##P<0.01 vs PDGF-BB group;△△P<0.01 vs PDGFBB+YM201636 group.圖6 PIKfyve失活通過降低mTORC1活性抑制小鼠VSMC增殖和遷移
Figure 7. Inhibition of PIKfyve activity decreased neointimal hyperplasia after mouse vascular endothelial injury. A:the protein expression of PIKfyve was determined by Western blot(n=3);B:the vascular intima/media ratio was measured by HE staining(n=5). Scale bar=50 μm. Mean±SD. **P<0.01 vs sham group;##P<0.01 vs sham+saline group;△△P<0.01 vs injured+saline group.圖7 抑制PIKfyve活性能減輕小鼠血管內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜增生
mTORC1 是一種蛋白激酶復(fù)合物,在控制細胞生長、增殖、遷移、新陳代謝等生物學過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]。結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物(tuberous sclerosis complex,TSC)1/2 異二聚體是mTORC1 上游的關(guān)鍵負性調(diào)控因子,它作為GTP 酶的激活蛋白,可使下游的腦Ras 同源蛋白(Ras homolog enriched in brain,Rheb)處于與GTP 解離的失活狀態(tài),從而抑制mTORC1[19]。Sun等[12]的研究表明,PDGF-BB促進了mTORC1 的活化,利用VSMC 特異性的TSC1基因敲除激活mTORC1 后,促進了VSMC 異常增殖、遷移及血管內(nèi)皮機械性損傷后的內(nèi)膜增生。但PIKfyve 是否通過影響mTORC1參與VSMC增殖、遷移調(diào)控并不清楚。因此,我們進一步在VSMC 中研究了PIKfyve對mTORC1 活性的影響。S6(Ser235/236)和4EBP1(Thr37/46)的磷酸化是反映mTORC1 活性的兩個下游核心指標[18]。我們的體外實驗表明,敲減PIKfyve表達或者抑制PIKfyve 活性均能降低S6 和4EBP1 的磷酸化水平。既往研究也支持PIKfyve 正向調(diào)控mTORC1 活性,在3T3-L1 脂肪細胞中,敲減PIKfyve表達降低了p-S6 和p-4EBP1 水平[20]。既往研究表明,胰島素通過PI3K/Akt 通路激活mTORC1 的活性[19]。在本研究中胰島素的干預(yù)逆轉(zhuǎn)了敲減PIKfyve表達后降低的S6 和4EBP1 的磷酸化水平,表明胰島素激活了mTORC1 活性,而利用胰島素恢復(fù)mTORC1 活性后,敲減PIKfyve表達或者抑制PIKfyve活性對VSMC 增殖和遷移的抑制作用消失。據(jù)此推論,PIKfyve 可能通過誘導(dǎo)mTORC1 活化來促進VSMC的增殖和遷移。
為了進一步研究PIKfyve 在血管內(nèi)膜增生中發(fā)揮的作用,本研究采用機械性損傷血管內(nèi)皮法構(gòu)建了小鼠頸總動脈內(nèi)皮損傷模型。結(jié)果顯示,PIKfyve在頸總動脈內(nèi)皮損傷后表達增加,提示PIKfyve 可能在內(nèi)膜增生中發(fā)揮促進作用。PIKfyve 活性抑制劑的使用可以減輕血管損傷后的內(nèi)膜增生和管腔狹窄程度,說明PIKfyve 誘導(dǎo)小鼠血管損傷后內(nèi)膜增生。但是PIKfyve 在血管再狹窄中的作用機制仍有較多未知。本項工作主要集中于體外實驗研究,在體內(nèi)的機制研究仍需進一步探討。
綜上所述,PIKfyve 可通過誘導(dǎo)mTORC1 活化來促進小鼠VSMC 的增殖和遷移,表明抑制PIKfyve 表達或活性可能是防治血管再狹窄的新靶點。本研究為血管再狹窄的防治提供了參考資料。