張展松， 陳 亮， 何少茹△， 劉玉梅， 姚植業(yè)， 馮博文

[1廣東省心血管病研究所，2廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學科學院），廣東廣州510080]

細胞膜片技術[1]（cell sheet technology，CST）是近年來組織工程領域與再生研究領域應用的細胞培養(yǎng)新技術，其可作為干細胞應用的載體，并且結(jié)合生物材料擁有成骨和血管化能力；完整地保留了細胞自分泌的細胞外基質(zhì)、細胞-細胞間連接蛋白、細胞表面相關分子受體以及細胞間離子通道，避免了細胞消化酶對細胞活性的影響[2]；具備良好的組織相容性，促進組織器官完全修復；具有一定的強度和操作性，其可通過對折、疊加等方式構建出理想的膜片厚度；有良好的各向分化能力，已被廣泛應用于血管、心臟組織、皮膚、骨組織以及牙周組織等組織工程研究與再生醫(yī)學領域。細胞膜片可通過溫敏培養(yǎng)皿或抗壞血酸誘導成膜后機械剝離獲得，我們前期研究顯示，抗壞血酸（ascorbic acid，AA）誘導成膜更簡單[3]。研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子β3（transforming growth factor-β3，TGF-β3）參與了軟骨細胞增殖、分化、肥大和終末分化，能有效促進II 型膠原（collagen type II，Col II）和蛋白聚糖（proteoglycan，PG）等軟骨基質(zhì)形成[4-5]。但目前國內(nèi)外關于組織工程領域中運用TGF-β3誘導細胞膜片軟骨化少有研究。

因此，本研究于體外分離、培養(yǎng)髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSMCs），經(jīng)抗壞血酸誘導后于體外構建干細胞膜片（stem cell sheet，SCS），探索TGF-β3 誘導骨髓間充質(zhì)干細胞膜片成軟骨分化的可行性。

材料和方法

1 動物

出生2 個月的新西蘭大白兔，不限雌雄，體重1.5～2.0 kg，選購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號為SCXK（粵）2011-0015。

2 主要試劑

兔干細胞培養(yǎng)基及軟骨誘導培養(yǎng)基、血清和TGF-β3（Cyagen）；α-MEM 培養(yǎng)基和澳洲胎牛血清（Gibco）；抗壞血酸AA（Sigma）；鼠抗兔Col II抗體（Novusbio）；蘇木素染液、番紅染液、伊紅染液、Masson麗春紅酸性染液、阿利新藍染液和甲苯胺藍染液（谷歌生物公司）；DAKA II 抗（K5007，Agilent）；RNAiso Plus RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR036A）和熒光定量試劑盒（DRR420A）購自TaKaRa。

3 主要方法

3.1 抗壞血酸誘導BMMSCs 構建干細胞膜片（SCS） 無菌操作臺獲取BMMSCs，放到細胞培養(yǎng)箱，取第3 代的BMMSCs，經(jīng)傳代操作后接種到6 孔板中并調(diào)整細胞密度為1×109/L；待細胞貼壁后PBS輕輕沖洗2 次，更改為等量的AA 誘導培養(yǎng)基（α-MEM 培養(yǎng)基+10%FBS+20 mg/L AA）；每天鏡下觀察對比細胞形態(tài)及培養(yǎng)板中的大體改變，每3 d 換液1次，干預14 d。

3.2 SCS 誘導軟骨分化 取培養(yǎng)板中干預14 天后的SCS，棄去AA 誘導培養(yǎng)基，PBS 徹底沖洗；實驗組添加等量的TGF-β3 軟骨分化培養(yǎng)基，并設置為CSCS 組；對照組繼續(xù)加入相同量的AA 誘導培養(yǎng)基，并設置為SCS 組；每天鏡下觀察對比細胞形態(tài)及培養(yǎng)板中的大體改變，每3 d換液1次，干預14 d。

3.3 石蠟切片、HE 染色與Masson 染色 將成軟骨誘導分化構建的CSCS 與抗壞血酸構的SCS 經(jīng)固定、脫水、透明、包埋修塊、切片攤片、烤片等制備成石蠟切片，行HE染色、Masson染色與阿利新藍染色。

HE 染色：將制備好的石蠟片，放置到二甲苯中脫蠟，而后于乙醇中浸泡，以去除二甲苯，最后于蒸餾水中洗去乙醇至水，石蠟片滴加蘇木素染液染色5 min，1%鹽酸乙醇分化30 s，1%堿性氨溶液中返藍30 s，待著色滿意后滴加伊紅染液染色1～3 min，再次經(jīng)過梯度乙醇與二甲苯脫水透明，中性樹膠封片，做好相關標記。

Masson 染色：將制備好的石蠟片，放置到二甲苯中脫蠟，而后于乙醇中浸泡，以去除二甲苯，最后于蒸餾水中洗去酒精至水，石蠟片滴加蘇木素染液染色5 min，1%鹽酸乙醇分化30 s，Masson 麗春紅酸性染液染色5 min，2%冰醋酸浸洗30 s，1%磷鉬酸分化3～5 min，苯胺藍染液染色5 min，0.2%冰醋酸浸洗30 s，顯微鏡下觀察染液的染色效果；再次經(jīng)過梯度乙醇與二甲苯脫水透明，樹膠封片，做好相關標記。

阿利新藍染色：將制備好的石蠟片，放置到二甲苯中脫蠟，而后于乙醇中浸泡，以去除二甲苯，最后于蒸餾水中洗去酒精至水，阿利新藍酸化液3 min，Alcian 藍染色液染色30 min ，根據(jù)著色效果復染5 min，再次經(jīng)過梯度乙醇與二甲苯脫水透明，樹膠封片，做好相關標記。

聯(lián)合AA 與TGF-β3 構建CSCS 的Col II 染色：膜片進行包埋后制備成石蠟切片，置于蛋白酶K（20 mg/L），于37℃中進行抗原的修復30 min，PBS 洗滌，滴加50 μL H2O2-甲醇封閉液于組織石蠟片上，滴入適當比例的抗Col II 抗體于組織切片上并完全覆蓋組織。濕盒內(nèi)4℃孵育過夜，組織切片上添加人HRP標注的抗鼠的Ⅱ抗（需完全浸潤組織），25℃反應50 min，組織石蠟片上添加即時配好的DAB 反應液（需完全覆蓋組織），陽性反應為棕黃色，鏡下觀察DAB顯色效果以把控顯色時間，并終DAB液，蘇木素染液染色，1% HCl 分化，堿性氨溶液中返藍，清水沖，脫水透明，標本封片。

3.4 RT-qPCR 檢 測CSCS 與SCS 中Col II 與PG 的mRNA 表達 獲取實驗組和對照組膜片，RNAiso Plus 提取細胞RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，RT-qPCR 檢測軟骨化相關基因的表達。引物序列見表1（由Ta-KaRa 設計）。PCR 由熒光定量PCR 儀自動采集目的基因與內(nèi)參基因的Ct值。實驗組和對照組組間的目的基因相對表達量（即實驗組目的基因相對表達量相對于對照組的倍數(shù)）用2-ΔΔCt表示。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

4 統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計軟件SPSS 20.0進行分析。數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，兩組間比較使用兩獨立樣本t檢驗，當P＜0.05為差異有統(tǒng)計學上的意義。

結(jié)果

1 BMMSCs 成膜后經(jīng)成軟骨誘導分化的鏡下及整體結(jié)構改變

BMMSCs 接種培養(yǎng)后，顯微鏡下可見細胞貼壁生長，呈梭形或不規(guī)則形。2 d 時可見細胞生長密集，細胞密度達到90%以上。經(jīng)抗壞血酸干預14 d后，鏡下可見BMMSCs 生長良好，細胞密度進一步增大，細胞間隙難以辨別。成軟骨誘導分化14 d后，鏡下間充質(zhì)干細胞生長良好（圖1）。大體上，BMMSCs經(jīng)抗壞血酸干預后行成軟骨誘導分化，可用鑷子鉗夾起“膜片”狀結(jié)構，可卷縮成團再展開成膜（圖2）。

Figure 1. Microscope of bone marrow mesenchymal stem cells chondrogenic differentiation after cell sheet formation（×100）. A：the microscopic image showed that the cells were adherent and grew in a spindle or irregular shape；B：cells grew densely at 2 d；C：after 14 d of ascorbic acid intervention，the cell density further increased and the intercellular space was difficult to distinguish；D：after 14 d of cartilage-induced differentiation，the cells grew well under microscope.圖1 骨髓間充質(zhì)干細胞成膜后經(jīng)成軟骨誘導分化的鏡下觀察

Figure 2. The overall structure of bone marrow mesenchymal stem cell sheet after chondrogenic differentiation. After the bone marrow mesenchymal stem cell sheetwas induced to differentiate into cartilage，the "sheet"structure was clamped with forceps，which could be rolled into a mass and expanded into a sheet.圖2 骨髓間充質(zhì)干細胞膜片成軟骨誘導分化后的整體結(jié)構

2 HE染色及Masson染色

HE 染色可見CSCS 的細胞質(zhì)及細胞外基質(zhì)成分均被染成粉紅色，其胞核為藍色，細胞間呈分層狀排列結(jié)構（圖3A）。Masson染色，CSCS的胞核染成藍黑色，其細胞質(zhì)染成粉紅色，周圍包繞著大量染成藍色的膠原成分（圖3B）。SCS 組的HE 染色及Masson 染色大致同CSCS組（圖4）。

Figure 3. The microscopic imagesof chondrogenic SCS under HE and Masson staining（×400）. In HE staining，the cytoplasm and extracellular matrix components of CSCS werestained pink and their nuclei wereblue；the cells werearranged hierarchically；in Masson staining，the nucleus of CSCS was stained blue-black，and its cytoplasm was stained pink，surrounded by a large amount of collagen stained blue.圖3 CSCS的HE染色及Masson染色結(jié)果

Figure 4. The microscopic images of SCS under HE and Masson staining（×400）.圖4 SCS的HE染色及Masson染色結(jié)果

3 CSCS與SCS的阿利新藍染色觀察

CSCS 經(jīng)成軟骨誘導分化14 d 后，在阿利新藍染色中，胞核呈紅色，細胞質(zhì)及細胞外基質(zhì)呈藍色（圖5A）；SCS 對照組在阿利新藍染色中，胞核為紅色，其余成分被染成淺藍色或近乎無色（圖5B）。

Figure 5. The microscopic imagesof chondrogenic SCS and SCS under Alcian blue staining（ ×400）. A：after the CSCS was induced to differentiate into cartilage，the nucleus was red，the cytoplasm and extracellular matrix were blue；B：the nucleus of the SCS was red，and the remaining components were stained light blue or almost colorless.圖5 CSCS與SCS的阿利新藍染色結(jié)果

4 CSCS 與SCS 的軟骨化標志物Col II 的免疫組化染色觀察

骨髓間充質(zhì)干細胞膜片經(jīng)由成軟骨誘導分化培養(yǎng)基誘導14 d 后，對Col II 染色，陽性表達Ⅱ型膠原的CSCS 胞漿為棕黃色，其細胞核呈藍黑色（圖6A）；未經(jīng)誘導的SCS 無表達，胞漿呈無色，細胞核呈藍黑色（圖6B）。

Figure 6. Immunohistochemicalevalation in collagen II of chondrogenic SCS and SCS（×400）.A：in the cartilage-related marker collagen II with immunohistochemical staining，the CSCSpositively expressed type II collagen：the cytoplasm of SCSC was brown-yellow and the nuclei were blue-black；B：no expression of collagen II in uninduced SCS group was observed.圖6 CSCS與SCS的collagen II的免疫組化染色結(jié)果

5 CSCS 與SCS 的軟骨化相關基因的RT-qPCR 檢測結(jié)果

與SCS 組（對照組）相比，CSCS 組（實驗組）經(jīng)成軟骨誘導分化后，Col II 和PG 的mRNA 表達均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），見圖7。

討論

細胞膜片技術是近年來組織工程領域的細胞培養(yǎng)新技術，1993 年Okano 等[6]采用溫度敏感性材料多聚N-異丙基丙烯酰胺（polyN-isopropylacrylamide，PIPAAm）制備成溫度敏感型培養(yǎng)皿，通過溫度變化，直接獲得細胞膜片。避免了胰蛋白酶的消化，完好保留細胞外基質(zhì)、細胞-細胞間連接蛋白、細胞表面相關分子受體及細胞間離子通道[2]。目前，細胞膜片的制備方法很多，包括溫敏培養(yǎng)系統(tǒng)、光反應系統(tǒng)、電反應系統(tǒng)以及機械方法，但都存在一些缺點，如溫敏系統(tǒng)培養(yǎng)的細胞膜片可能會影響細胞的聚合與分化。Guo 等[7]通過添加抗壞血酸來促進細胞外基質(zhì)分泌，快速穩(wěn)定地獲取骨髓間充質(zhì)干細胞片。與其他方法相比，此法具有更簡便、低廉等特性。Wei等[8]研究發(fā)現(xiàn)抗壞血酸能提高端粒酶的活性，促進骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖，于體外很好地構建了骨髓間充質(zhì)干細胞片，可以為基于細胞的組織再生提供簡單且實用的方法。并且，在臨床應用中，細胞膜片已經(jīng)被成功地應用到角膜、心臟等組織的修復中[9-10]。本研究中，在抗壞血酸的作用下，兔骨髓間充質(zhì)干細胞出現(xiàn)生長活躍現(xiàn)象，鏡下可觀察到細胞生長致密。在大體上可見骨髓間充質(zhì)干細胞形成半透明地薄層膜狀結(jié)構，且無需消化酶的作用，即可將細胞膜片完整地從培養(yǎng)板中取下來，組織學染色中可見細胞外包繞著大量染成藍色的膠原成分，能獲取到有生物活性的外基質(zhì)成分。

Figure 7. The mRNA expression of chondrogenic differentiation related genes in CSCS and SCS. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖7 CSCS與SCS的軟骨化相關基因的mRNA表達

轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）是一個廣泛的生長因子家族，可調(diào)節(jié)不同組織中的細胞增殖，分化，凋亡和遷移[11]。TGF-β 可以通過激活細胞外信號Smad2/3 信號通路影響軟骨細胞和MSC 增殖和分化，并誘導細胞外基質(zhì)的表達[4，12]。TGF-β3 在軟骨結(jié)構分化和代謝中起到重要的作用[5]。軟骨組織主要是由細胞外基質(zhì)和包繞在其中的軟骨細胞組成，細胞外基質(zhì)蛋白的合成及相關基因的表達是正常軟骨細胞的一大特征[13]。軟骨細胞合成的細胞外基質(zhì)主要為Col II 和PG，且在固體基質(zhì)內(nèi)，50%～75%是膠原和15%～30%是PG[14]。Ravindran 等[15]研 究團 隊 將 人 骨髓 來 源 的MSC 和PEG 微球構建3D 共聚集系統(tǒng)，在TGF-β3 誘導后促進BMSCs 中軟骨形成基因如Col II 和PG 的表達。Diekman 等[16]在藻酸鹽珠或軟骨衍生的基質(zhì)中將TGF-β3 作為軟骨誘導因子，發(fā)現(xiàn)與前者相同的結(jié)論。因此，可以通過鑒定細胞外基質(zhì)的成分來驗證軟骨細胞。研究表明，未經(jīng)誘導的正常BMSCs 表達Col I，幾乎沒有表達Col II 和PG[17-18]。本研究采用阿利新藍染色、Col II 免疫組化染色和RT-qPCR 鑒定顯示細胞外基質(zhì)中Col II 和PG 高表達，表明TGF-β3 可成功誘導干細胞膜片向軟骨分化。

細胞膜片技術在軟骨分化方面的研究亦有報道。由于細胞膜片完好的保留細胞外基質(zhì)，具備良好的組織相容性和屏障功能，且能夠為軟骨再生提供生長因子，同時又能在體內(nèi)免受分解代謝因子的影響，保護再生軟骨組織，不少研究者認為軟骨細胞膜片能夠很好地修復半層軟骨缺損[18-19]。Kaneshiro等[19]研究表明將多層軟骨細胞膜片疊加在一起修復兔關節(jié)軟骨半層缺損，術后經(jīng)PCR 檢測層狀軟骨細胞片能夠保持軟骨表型，高表達Col II 和PG，經(jīng)番紅染色和甲苯胺藍染色，提示軟骨缺損修復良好。Sekine 等[20]研究團隊將人子宮內(nèi)膜腺體來源的干細胞膜片疊成細胞密集的3D 組織，在高細胞密度和缺氧環(huán)境下向軟骨方向分化，通過軟骨特異性標記物Col II 免疫組織化學染色，組織內(nèi)PG 含量檢測來驗證成軟骨分化能力，研究結(jié)果顯示間充質(zhì)干細胞能夠迅速向軟骨方向分化。

本研究中，在形成的膜片中添加TGF-β3 誘導干細胞膜片成軟骨分化，通過阿利新藍染色、Col II 免疫組化染色和RT-qPCR 鑒定細胞的Col II和PG 的表達，在mRNA 和蛋白水平驗證細胞膜片的成軟骨分化能力，結(jié)果顯示高表達軟骨化相關基因Col II 和PG，軟骨特異性染色標志物Col II免疫組織化學染色和阿利新藍染色呈陽性，在基因水平和分子水平上呈現(xiàn)一致，證實體外經(jīng)TGF-β3 可成功誘導干細胞膜片向軟骨分化。

綜上所述，在抗壞血酸的作用下，兔骨髓間充質(zhì)干細胞出現(xiàn)生長活躍現(xiàn)象，分泌了大量的膠原細胞外基質(zhì)成分，形成了干細胞膜片。在TGF-β3 的作用下，軟骨特異性染色標志物Col II免疫組織化學染色和阿利新藍染色呈陽性，膜片整體高表達軟骨化相關基因Col II 和PG，在體外成功地誘導軟骨分化構建出軟骨細胞膜片，并且能完整地獲取軟骨誘導后的細胞及包繞其的細胞外基質(zhì)結(jié)構，對組織工程學中的研究具有重大意義。本研究使用抗壞血酸和TGF-β3，兩種因子之間是否存在聯(lián)系并沒深入探究，仍有待進一步闡明。