王忠江，王貴祥，王子越，鄭 宇，王麗麗，隋宇航

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院，哈爾濱150030）

微藻富含蛋白質(zhì)、油和多糖等有機(jī)物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、保健品、生物柴油、動物飼料和生物能源等方面[1-2]。隨著全球能源問題日益嚴(yán)峻，微藻和大型藻類生物質(zhì)作為滿足燃料需求的替代品已受到學(xué)者關(guān)注[3]。然而，為滿足微藻生長需求，培養(yǎng)過程需添加大量氮磷等化學(xué)藥品，高成本限制微藻產(chǎn)業(yè)化發(fā)展[4]。我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)在快速發(fā)展同時也產(chǎn)生大量以糞便為主的廢棄物。根據(jù)中國畜牧業(yè)統(tǒng)計年鑒、國家環(huán)保部及國家統(tǒng)計局?jǐn)?shù)據(jù)，2019年全國牛出欄數(shù)量為4 533萬頭，按照國家環(huán)?？偩滞扑]排泄系數(shù)，預(yù)計產(chǎn)生33 097萬t糞便和16 548萬t尿液，畜禽養(yǎng)殖廢水已成為國內(nèi)僅次于鋼鐵和煤炭第三大污染行業(yè)[5]。處理畜禽排泄廢水,凈化和保護(hù)水資源已刻不容緩。Garcia等研究報道，含有大量氮、磷等營養(yǎng)成分的畜禽養(yǎng)殖廢水可成為微藻培養(yǎng)潛在培養(yǎng)基質(zhì)[6]。

但畜禽養(yǎng)殖廢水作為微藻培養(yǎng)基質(zhì)仍存在問題。由于畜禽養(yǎng)殖廢水普遍存在濁度大、TSS過高、COD較大等問題，影響微藻培養(yǎng)過程光透過性，限制微藻生長。目前，利用廢水培養(yǎng)微藻前通常利用沉降、離心、絮凝等方式預(yù)處理廢水[7]，處理效果差處理成本高，限制微藻規(guī)?；囵B(yǎng)。秸稈是一種天然聚合物，富含具有吸附能力的纖維素，具有處理廢水潛質(zhì)。粉碎后秸稈可過濾廢水中雜質(zhì)，有效降低TSS、TN、COD等指標(biāo)[8]，目前利用秸稈過濾牛場廢水并用于微藻培養(yǎng)的系統(tǒng)性對比研究鮮有報道。

因此，本文針對以上問題，以秸稈過濾前后牛場廢水為原料，在添加比例為10%條件下，通過檢測培養(yǎng)過程中微藻干重以及微藻培養(yǎng)液中氨氮、總氮、總磷和COD指標(biāo)，系統(tǒng)研究不同光照周期條件下秸稈過濾后牛場廢水用于微藻培養(yǎng)可行性及適宜培養(yǎng)條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 牛場廢水預(yù)處理

試驗采用牛場廢水取自哈爾濱市后許家屯奶牛場，采用干清糞方式，廢水中化學(xué)需氧量和氨氮等含量較高。秸稈取自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物質(zhì)能源試驗室，粉碎后備用。將粉碎后玉米秸稈（粒徑10～40 mm）加入高50 cm，直徑10 cm濾柱中，工作高度30 cm，適當(dāng)壓實（容重為0.1184 g·cm-3），底部用紗布封閉，從濾柱上方加入未經(jīng)任何處理高濃度奶牛場廢水（未濾），使其與秸稈充分接觸，在濾柱下用燒杯收集過濾后廢水，儲存于4℃冰箱內(nèi)備用。秸稈過濾前后牛場廢水相關(guān)指標(biāo)如表1所示。

表1 牛場廢水特性Table 1 Characteristics of cattle farm wastewater

1.1.2 試驗藻種

試驗所用藻種為普通小球藻（Chlorella vulgaris）與肥壯蹄形藻（Kirchneriella obesa），均由中國科學(xué)院水生生物研究所提供，藻種編號為FACHB-8（8號藻種）和FACHB-2104（2104號藻種）。將微藻接入BG11培養(yǎng)基后于人工氣候培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（25±1）℃，光照強(qiáng)度2 500 lux，光暗比12 h∶12 h，通氣量1.0 L·min-1，空氣在進(jìn)入培養(yǎng)液前經(jīng)0.2μm濾膜過濾。

1.2 試驗方法及條件

采用牛場廢水和BG11培養(yǎng)基混合液培養(yǎng)微藻，牛場廢水添加量為10%[9]，試驗藥品均為分析純。利用OBY-Q600-SEI型人工氣候培養(yǎng)箱（常州歐邦電子有限公司）培養(yǎng)微藻，培養(yǎng)溫度（26±1）℃，光照強(qiáng)度4 000 lux，同時利用HG-180型旋渦式氣泵（購自臺灣亞士霸電機(jī)集團(tuán)有限公司）向微藻培養(yǎng)液通入空氣，通氣量1.5 L·min-1，空氣在進(jìn)入培養(yǎng)液前經(jīng)0.2μm濾膜過濾。

試驗容器為1 000 mL三角瓶，工作體積700 mL，將對數(shù)期藻種各70 mL分別加入培養(yǎng)液中，每組3個重復(fù)，展開批式培養(yǎng)，培養(yǎng)周期14 d，每天取樣測680 nm吸收波長下OD值和pH。每隔1 d取樣，利用3-30 K型高速離心機(jī)在10 000 r·min-1條件下離心，測定上清液中氨氮質(zhì)量濃度、總氮質(zhì)量濃度、總磷質(zhì)量濃度和COD值。

1.3 分析方法

生物量測定采用干重法。取小球藻藻液，將包含藻液樣品放入預(yù)先干燥至恒重離心管（質(zhì)量為M1）中，8 000 r·min-1離心機(jī)中離心10 min，去除上清液，將剩余樣品再次烘干至恒重（M2），得到微藻生物質(zhì)干重（m）。用紫外可見分光光度計測定其在680 nm吸收波長下OD值，確定所選微藻生物質(zhì)干重與OD680間線性關(guān)系，衡量小球藻在培養(yǎng)過程中相對生長量。式（1～2）分別為兩種微藻干重與OD680線性關(guān)系式：

干重（g·L-1）=0.2605 OD680+0.028（8號）

廢水濁度采用分光光度法測定680 nm下吸光度；pH使用pH計（雷磁PHS-25）測定；黏度使用NDJ-9S旋轉(zhuǎn)黏度計測定；TSS用重量法測定，參照GB11901-89《水質(zhì)懸浮物的測定》[10]；培養(yǎng)液COD值測定采用重鉻酸鹽法；總氮采用凱氏定氮法（Kjeldahl method）測定，所用儀器為K9860型全自動凱氏定氮儀（濟(jì)南海能儀器股份有限公司）；氨氮和總磷使用荷蘭SKALAR連續(xù)流動分析儀測定；均參照《水和水質(zhì)監(jiān)測分析方法》（第四版）[10]。采用Origin 2018處理數(shù)據(jù)，SPSS 22.0分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 微藻生長

不同光照周期條件下，微藻干重值曲線如圖1所示。

圖1 微藻生長曲線Fig.1 Growth curves of microalgae

由圖1可知，8號藻種可在秸稈過濾前后牛場廢水中較好生長，各試驗組干重值由試驗開始時0.043～0.048 g·L-1升至0.445～1.044 g·L-1，且已濾組干重積累情況均優(yōu)于未濾組，達(dá)極顯著（P＜0.01）。而2104號藻種在秸稈過濾前后牛場廢水中生長均較緩慢，各試驗組干重值由試驗開始時0.027～0.029 g·L-1升至0.096～0.248 g·L-1，試驗開始前5 d未表現(xiàn)明顯差異，從第6天開始，已過濾試驗組干重值明顯高于未過濾試驗組，達(dá)顯著（P＜0.05）。不同光照周期也對微藻生長產(chǎn)生顯著影響，兩種微藻隨光照時間延長生長良好，8號藻種在光照周期24 h∶0 h和18 h∶6 h時，干重值極顯著高于12 h∶12 h試驗組（P＜0.01）。光照周期12 h∶12 h試驗組表現(xiàn)更長適應(yīng)期，第6天開始生長，試驗結(jié)束時，干重值比24 h∶0 h試驗組低57.4%。2104號藻種在不同光照周期條件下生長較緩慢，試驗過程中表現(xiàn)較長適應(yīng)期，試驗結(jié)束時各試驗組干重值較低，光照周期對2104號藻種生長影響顯著（P＜0.05）。本試驗中，各組微藻生長趨勢符合生物學(xué)S型生長曲線，利用Origin 2018軟件擬合各試驗組微藻生長曲線，比較發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)可較好符合DoseResp函數(shù)模型，該函數(shù)分為bottom asymptote、hill slope、top asymptote 3個過程，在不同試驗條件下，各試驗組干重積累量與培養(yǎng)時間關(guān)系擬合度R2均高于0.9910，經(jīng)F檢驗，顯示顯著相關(guān)性（P＜0.01），各試驗組擬合后方程如表2所示。

表2 微藻生長曲線擬合方程Table 2 Fitting equations of microalgae growth curves

2.2 微藻培養(yǎng)液pH

不同光照周期條件下，微藻培養(yǎng)液pH變化如圖2所示。由圖2可知，8號藻種中3個光照周期試驗組差異較大，但變化趨勢相似，均呈先快速上升，之后逐漸趨于穩(wěn)定趨勢，其中，24 h∶0 h試驗組生長更好，pH在第6天時達(dá)到最高值9.41，略有下降，然后逐漸趨于平穩(wěn)。而2104號藻種pH變化趨勢一致，在試驗前4 d逐漸上升，各試驗組pH變化差異較小，第4天開始，各試驗組pH差異逐漸顯著（P＜0.05），之后逐漸趨于平穩(wěn)。已過濾試驗組pH在試驗結(jié)束時維持在8.79～9.21，未過濾試驗組pH在試驗結(jié)束時維持在8.53～9.01，差異達(dá)顯著（P＜0.05）。已濾組和未濾組pH均符合張丹等研究得出小球藻適宜生長在中性偏堿環(huán)境[11]。此外，各過濾試驗組中24 h∶0 h試驗組培養(yǎng)液pH在試驗過程中均極顯著高于18 h∶6 h和12 h∶12 h試驗組（P＜0.01），是由于24 h∶0 h試驗組微藻生長速率均優(yōu)于其他試驗組，對培養(yǎng)液中H+消耗更大，產(chǎn)生上述現(xiàn)象。

2.3 微藻培養(yǎng)液氨氮質(zhì)量濃度

不同光照周期條件下，微藻培養(yǎng)液中氨氮質(zhì)量濃度變化如圖3所示。由圖3可知，在試驗前期，各試驗組中氨氮質(zhì)量濃度快速下降，隨試驗開展，微藻生長速率減緩，氨氮消耗速度減緩。試驗結(jié)束時，8號藻種各試驗組氨氮質(zhì)量濃度由試驗開始時251～296 mg·L-1降至0～23 mg·L-1，2104號藻種各試驗組氨氮質(zhì)量濃度由試驗開始時253～297 mg·L-1降至2～41 mg·L-1。

由圖3還可知，8號藻種在光照周期24 h∶0 h試驗組中，氨氮去除率達(dá)到100%（已濾）和96.9%（未濾），而2104號藻種在光照周期24 h∶0 h試驗組中氨氮去除率達(dá)到99.2%（已濾）和93.7%（未濾），其他兩個光照周期條件下試驗組氨氮去除率為86.2%～94.5%，兩種微藻均在更長光照時間試驗組中氨氮去除率更高，達(dá)極顯著（P＜0.01），且兩種微藻在已過濾試驗組中氨氮去除效果均明顯優(yōu)于未過濾試驗組，差異達(dá)極顯著（P＜0.01）。結(jié)合微藻干重曲線圖可知，光照時間短試驗組中微藻干重值較低，但氨氮去除率也達(dá)到86.2%以上，可能是由于通氣對培養(yǎng)液中氨氮有一定脫除作用，產(chǎn)生這種現(xiàn)象。

圖2 pH變化Fig.2 Variation of pH

圖3 氨氮質(zhì)量濃度變化Fig.3 Variation of ammonia nitrogen concentration

2.4 微藻培養(yǎng)液總氮質(zhì)量濃度

不同光照周期下，微藻培養(yǎng)液中總氮質(zhì)量濃度變化見圖4?？芍?，兩種微藻在試驗過程中均可較好去除培養(yǎng)液中總氮，各試驗組中總氮質(zhì)量濃度下降趨勢一致，且與氨氮質(zhì)量濃度下降趨勢一致，是由于培養(yǎng)液中氨氮約占總氮含量90%。試驗過程中，已過濾試驗組和未過濾試驗組中總氮質(zhì)量濃度變化差異達(dá)極顯著（P＜0.01）。試驗結(jié)束時，8號藻種在各試驗組中總氮質(zhì)量濃度由試驗開始時305～342 mg·L-1降至13～53 mg·L-1，2104號藻種各試驗組中總氮質(zhì)量濃度由試驗初期301～411 mg·L-1降至21～51 mg·L-1，由此可知，兩種微藻在試驗過程中對總氮均有較好去除效果。此外，8號藻種在光照周期24 h∶0 h試驗組中生長情況最佳，總氮質(zhì)量濃度去除率也最高，達(dá)95.8%（已濾）和92.6%（未濾），而在12 h∶12 h試驗組中，藻種生長較緩慢，總氮質(zhì)量濃度去除率也較低，為85.2%（已濾）和84.5%（未濾），說明8號藻種在不同光照周期條件下總氮質(zhì)量濃度去除情況存在顯著差異（P＜0.05）。

2.5 微藻培養(yǎng)液總磷質(zhì)量濃度

不同光照周期條件下，微藻培養(yǎng)液中總磷質(zhì)量濃度變化如圖5所示。

圖4 總氮質(zhì)量濃度變化Fig.4 Variation of total nitrogen concentration

圖5 總磷質(zhì)量濃度變化Fig.5 Variation of total phosphorus concentration

由圖5可知，各試驗組總磷質(zhì)量濃度變化趨勢一致，即試驗開始時各組總磷質(zhì)量濃度迅速下降，后期（12～14 d）趨于平穩(wěn)，結(jié)合微藻干重曲線圖，微藻生長情況較好試驗組對培養(yǎng)液中總磷去除效果更好。試驗結(jié)束時，8號藻種各組中總磷質(zhì)量濃度由試驗開始時8.29～11.79 mg·L-1降至0.015～0.97 mg·L-1，2104號藻種各組總磷質(zhì)量濃度含量濃度由試驗開始時8.47～11.67 mg·L-1降至0.015～0.93 mg·L-1。

由圖5可知，未過濾試驗組中總磷質(zhì)量濃度在試驗開始時均高于已過濾試驗組，隨試驗進(jìn)程，已過濾試驗組中總磷質(zhì)量濃度下降速度更快，試驗結(jié)束時，已過濾試驗組總磷平均去除率達(dá)97.8%以上，且已過濾試驗組總磷去除率均顯著優(yōu)于未過濾試驗組（P＜0.05）。此外，8號藻種和2104號藻種均在光照周期24 h∶0 h試驗組中生長更好，對培養(yǎng)液中總磷去除效果也最好，去除率達(dá)99.8%，光照周期18 h∶6 h試驗組對培養(yǎng)液中總磷去除率為96.7%～98.9%，而光照周期12 h∶12 h試驗組中干重值相對較低，微藻生長較緩慢，培養(yǎng)液中總磷去除率為91.3%～92.7%，達(dá)極顯著（P＜0.01）。

2.6 微藻培養(yǎng)液COD值

不同光照周期條件下，微藻培養(yǎng)液中COD值變化如圖6所示。由圖6可知，各試驗組COD值變化趨勢一致，即在試驗前中期（前2～10 d）下降速度較快，試驗后期趨于穩(wěn)定。8號藻種各試驗組中COD值由試驗開始時965.27～1089.89 mg·L-1降至193.63～425.87 mg·L-1，2104號藻種各試驗組中COD值由試驗開始時968.17～1024.38 mg·L-1降至207.22～452.36 mg·L-1。由圖中還可知，未過濾試驗組中COD在試驗開始時略高于已過濾試驗組，隨著試驗進(jìn)程，已過濾試驗組中COD值下降速度更快，試驗結(jié)束時，已過濾試驗組COD值均明顯低于對應(yīng)未過濾試驗組，已過濾試驗組COD值去除率為61.6%～80.2%，而未過濾試驗組COD值去除率則為55.2%～74.6%，差異達(dá)極顯著（P＜0.01）。另外，兩種微藻在光照周期24 h∶0 h試驗組中COD去除率達(dá)73.1%～80.2%，而在光照周期18 h∶6 h和12 h∶12 h試驗組中COD去除率分別為63.3%～74.4%和55.2%～67.3%，結(jié)合微藻干重值曲線圖可知，微藻生長較緩慢試驗組中，COD值下降速度也較緩慢，試驗結(jié)束時COD去除率較低。

圖6 COD值變化Fig.6 Variation of COD

3 討論與結(jié)論

本文系統(tǒng)研究秸稈過濾預(yù)處理后牛場廢水用于微藻培養(yǎng)可行性和培養(yǎng)液中有機(jī)污染物去除情況。研究發(fā)現(xiàn)過濾后試驗組中兩種微藻生長情況均優(yōu)于對照組，采用秸稈過濾預(yù)處理方式顯著降低奶牛場廢水總懸浮固體和濁度，利于后續(xù)微藻生長，因處理成本低，可有效加快微藻培養(yǎng)與養(yǎng)殖廢水處理工業(yè)化進(jìn)程。由于牛場廢水濁度較大，光透過率低，微藻培養(yǎng)過程中對光照要求高[12]，所以光照時間較長試驗組微藻生長良好，與郭亞敏研究結(jié)果一致[13]。本研究8號小球藻生長情況優(yōu)于2104號肥壯蹄形藻，是由于小球藻具有更好氮磷去除能力，更易在污水中形成生長優(yōu)勢，與胡洪營等研究結(jié)果一致[14]。微藻培養(yǎng)過程中，溶液pH升高，與Prajapati等研究中發(fā)現(xiàn)pH由7.8升至9.2規(guī)律一致[15]，由于微藻在生長過程中光合作用消耗污水中CO2，促進(jìn)以下反應(yīng)向右進(jìn)行：HCO3－?CO2+OH－，導(dǎo)致溶液pH上升[16]，而藻細(xì)胞合成也需大量H+、HPO42-等，造成溶液中H+濃度降低，且堿性水質(zhì)環(huán)境也對有害菌起到一定消毒作用[13]，促進(jìn)微藻生長。兩種微藻在已過濾試驗組中氨氮去除效果均優(yōu)于未過濾試驗組，是由于藻類在生長過程中優(yōu)先利用溶液中氨態(tài)氮[17]，培養(yǎng)液中氨氮質(zhì)量濃度在試驗開始時便迅速下降，且氨態(tài)氮易揮發(fā)，通氣對培養(yǎng)液中氨氮也起到一定脫除作用[18]，各試驗組氨氮去除效果明顯。試驗組在試驗結(jié)束時總氮去除率均達(dá)到84.5%以上，均優(yōu)于王巖利用養(yǎng)殖場廢水培養(yǎng)小球藻、柵藻、6803號微藻時總氮去除率[19]，因本研究采用秸稈過濾預(yù)處理方式顯著降低奶牛場廢水總懸浮固體和濁度，過濾后廢水更利于后續(xù)微藻培養(yǎng)，微藻生長速率更高，對培養(yǎng)基質(zhì)中氮素消耗量也更大。由于磷為合成微藻細(xì)胞重要組成元素[20]，而培養(yǎng)液中磷主要以HPO42-形式存在，對培養(yǎng)液中總磷有效去除說明這兩種微藻均可利用溶液中磷元素，各試驗組總磷質(zhì)量濃度去除率均達(dá)91%以上，與Prajapati等在研究過程中總磷去除率相近[15]。在微藻培養(yǎng)過程中，微藻細(xì)胞與污水中細(xì)菌構(gòu)成藻菌共生體[21]，微藻光合作用時釋放O2可促進(jìn)污水中有機(jī)物分解，培養(yǎng)液中通入空氣還可增強(qiáng)未滅菌奶牛場廢水中好氧微生物活性，促進(jìn)微生物對培養(yǎng)液中有機(jī)物分解和利用[22]，使培養(yǎng)液中COD值降低，試驗結(jié)束時，各試驗組培養(yǎng)液中COD去除率相對較低，是因微藻細(xì)胞存在分解，與張紅紅研究結(jié)果一致[23]。在較長光照時間條件下，微藻生長更好，對培養(yǎng)液中COD去除效果更好，由于微藻以CO2為碳源光合作用同時，也利用培養(yǎng)液中各種有機(jī)化合物作為碳源異養(yǎng)生長，與王忠江等研究結(jié)果一致[24]。秸稈過濾預(yù)處理方式對場廢水相關(guān)指標(biāo)具體影響規(guī)律有待進(jìn)一步探究。

綜上，本文對比秸稈過濾前后牛場廢水培養(yǎng)微藻生長情況及有機(jī)污染物去除情況；系統(tǒng)研究光周期對微藻生長影響，光周期對微藻Chlorella vulgaris和Kirchneriella obesa在混合牛場廢水培養(yǎng)基質(zhì)中生長影響顯著，且前者適應(yīng)能力優(yōu)于后者；利用牛場廢水培養(yǎng)微藻，可顯著去除牛場廢水中氨氮、總氮、總磷和COD；利用DoseResp函數(shù)擬合微藻干重曲線得到不同試驗條件下微藻生長動力學(xué)方程（見表2）；為后續(xù)養(yǎng)牛場廢水規(guī)?；囵B(yǎng)微藻提供理論基礎(chǔ)和預(yù)測模型。