許少祺，劉浩地，李 雪，吳青松，張友民*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，長(zhǎng)春130118；2.松原市哈達(dá)山水利樞紐工程管理服務(wù)中心，吉林 松原138000）

山野豌豆（Vicia amoena）與大葉野豌豆（V.pseudo-orobus）隸屬豆科（Fabaceae）蝶形花亞科（Papilionatae）野豌豆族（Trib.Vicieae）野豌豆屬（Vicia），為多年生草本，植物資源豐富，耐瘠薄，再生力強(qiáng)，在農(nóng)業(yè)上不僅多用作優(yōu)良牧草和改土肥田作物，且可作為蜜源、草坪與水土保持植物，是珍貴的藥用植物，同時(shí)由于其花色艷麗，花期較長(zhǎng)，亦可作園林觀賞植物，在我國(guó)農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[1-2]。世界野豌豆屬植物約有200余種，我國(guó)現(xiàn)有40余種，主要分布于華北、西北、西南和東北地區(qū)，多生長(zhǎng)于山坡、草甸、灌叢或林緣等環(huán)境中，因其具有產(chǎn)量高、生育期短和種子粗蛋白含量高等特點(diǎn)，廣受科研人員重視，應(yīng)用前景廣闊[3]。近年來(lái)，針對(duì)該屬植物研究多集中于分類學(xué)[4]、分子[5]、生理[6]和化學(xué)[7]等方面，但對(duì)其葉片解剖結(jié)構(gòu)研究較少，關(guān)于其葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)與生態(tài)適應(yīng)性關(guān)系研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

葉片作為植物直接接受光照器官，其外部形態(tài)特征及內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)因環(huán)境改變表現(xiàn)差異。形態(tài)特征作為植物分類主要標(biāo)準(zhǔn)和依據(jù)發(fā)揮不可代替作用，研究葉片解剖結(jié)構(gòu)與環(huán)境適應(yīng)性是保護(hù)該植物基礎(chǔ)，具有重要意義[8]。葉片表皮氣孔是影響植物光合、呼吸及蒸騰作用主要因素，常用氣孔密度與指數(shù)等變化分析環(huán)境對(duì)植物生長(zhǎng)影響[9]。因此，本文以山野豌豆和大葉野豌豆葉片為供試材料，運(yùn)用掃描電鏡技術(shù)、植紋鑒定技術(shù)和石蠟切片法，系統(tǒng)研究其形態(tài)結(jié)構(gòu)與解剖學(xué)，深入探究其演化關(guān)系及抗旱性、抗蟲(chóng)性與抗寒性，為更好保護(hù)野豌豆屬植物資源、人工選育和園林應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況與試驗(yàn)材料

供試材料采自長(zhǎng)春市凈月潭林緣（43°66′N，125°48′E，海拔高度約300 m）。試驗(yàn)地屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年均氣溫4.8℃，最高溫度39.5℃，最低溫度-39.8℃，年均日照時(shí)數(shù)2 688 h，年均降水量522～615 mm，無(wú)霜期140 d。選取長(zhǎng)勢(shì)良好山野豌豆和大葉野豌豆自頂端葉片下數(shù)第五片成熟葉片為樣品，沿主脈將葉片剪成長(zhǎng)方形（0.5 cm×1.0 cm），放入FAA固定液中保存。

1.2 方法

1.2.1 掃描電鏡技術(shù)

將葉片放入101A-1ET電熱鼓風(fēng)干燥箱60℃條件下干燥36 h后裁成正方形（0.5 cm×0.5 cm），使用雙面膠將葉片下表皮朝上粘于樣品臺(tái)，后用ETD-2000離子濺射儀導(dǎo)電處理，濺射鍍膜厚7～8 nm，在Shimadzux-550掃描電子顯微鏡下觀察并拍照[4]。

1.2.2 植紋鑒定技術(shù)

使用表皮撕取法制取植紋并鑒定[10]。分別撕取葉片上下表皮，平放于載玻片上，使用刀片輕輕刮去殘留葉肉細(xì)胞，滴入固綠，1/2無(wú)水乙醇＋1/2二甲苯溶液沖洗，中性樹(shù)膠封片，放入35℃恒溫箱中保存，在Motic Panthera i生物顯微鏡下觀察，Motic Imags Plus 3.0 ML拍照與測(cè)量。

1.2.3 石蠟切片法

使用常規(guī)石蠟切片法切片，切片厚度12μm，番紅—固綠復(fù)染，中性樹(shù)膠封片，制成永久封片，放入35℃恒溫箱中保存[11]。所得樣片用Motic Panthera i生物顯微鏡觀察，Motic Imags Plus 3.0 ML拍照和測(cè)量。

1.3 數(shù)據(jù)測(cè)量與分析

本文術(shù)語(yǔ)依據(jù)Dilcher[12]和陸靜梅[10]研究。由于兩種野豌豆氣孔主要分布于下表皮，因此本文相關(guān)數(shù)據(jù)為測(cè)量下表皮數(shù)值。每個(gè)樣片相同倍數(shù)下隨機(jī)取10個(gè)完整視野下測(cè)量，Excel 2019計(jì)算，SPSS 20.0相關(guān)分析，并計(jì)算以下參數(shù)：

氣孔長(zhǎng)寬比=氣孔長(zhǎng)度/氣孔寬度；

氣孔指數(shù)（%，SI）=氣孔數(shù)/（氣孔數(shù)＋表皮細(xì)胞數(shù)）×100%；

氣孔密度（SD）=氣孔數(shù)/視野面積；

柵海比=柵欄薄壁組織厚度/海綿薄壁組織厚度；

細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度（%，CTR）=（柵欄薄壁組織厚度/葉片厚度）×100%；

細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度（%，SR）=（海綿薄壁組織厚度/葉片厚度）×100%；

葉脈突起度（%，VPD）=（主脈直徑/葉片厚度）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 表皮特征

山野豌豆和大葉野豌豆葉片下表皮氣孔突出，角質(zhì)層紋飾存在差異。其中，山野豌豆角質(zhì)層紋飾為線狀、顆粒狀，無(wú)表皮毛；大葉野豌豆角質(zhì)層紋飾為線狀、脊?fàn)?，具單?xì)胞表皮毛。掃描電鏡照片見(jiàn)圖1。

圖1 兩種野豌豆屬植物葉片下表皮特征Fig.1 Characteristics of leaf lower epidermis of two Vicia species under scanning electron microscope

2.2 植紋鑒定

2.2.1 植紋特征

如圖2所示，兩種野豌豆葉片表皮植紋特征為：上、下表皮均有氣孔，但主要分布于下表皮，為無(wú)規(guī)則橢圓形，僅有保衛(wèi)細(xì)胞，無(wú)副衛(wèi)細(xì)胞，在腎形保衛(wèi)細(xì)胞周圍環(huán)繞不規(guī)則表皮細(xì)胞。由表1可知，山野豌豆氣孔長(zhǎng)度和寬度，保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度、寬度、周長(zhǎng)和面積以及表皮細(xì)胞周長(zhǎng)和面積均明顯大于大葉野豌豆，氣孔長(zhǎng)寬比為4.09，氣孔指數(shù)為31.55%，氣孔密度為110.55個(gè)·mm-2，表皮細(xì)胞垂周壁類型為：淺波狀、C型；大葉野豌豆氣孔長(zhǎng)寬比為4.37，氣孔指數(shù)與氣孔密度較大，分別高達(dá)34.67%和169.98個(gè)·mm-2，表皮細(xì)胞垂周壁類型為深波狀、F型。

表1 兩種野豌豆屬植物葉片下表皮植紋特征Table 1 Characteristics of leaf lower epidermal plant print of two Vicia species

圖2 兩種野豌豆屬植物葉片下表皮植紋特征Fig.2 Characteristics of leaf lower epidermal plant print of two Vicia species under biological microscope

2.2.2 植紋特征相關(guān)分析

如表2和3所示，使用Pearson相關(guān)系數(shù)分別分析山野豌豆和大葉野豌豆葉片下表皮植紋特征6個(gè)參數(shù)：保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度（GL）、保衛(wèi)細(xì)胞寬度（GW）、保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)（GP）、保衛(wèi)細(xì)胞面積（GA）、表皮細(xì)胞周長(zhǎng)（EP）、表皮細(xì)胞面積（EA）多變量相關(guān)性發(fā)現(xiàn)：兩種野豌豆部分植紋特征間關(guān)聯(lián)方向與關(guān)聯(lián)程度存在差異。

其中，山野豌豆表皮細(xì)胞周長(zhǎng)和表皮細(xì)胞面積間相關(guān)系數(shù)r=0.938μm，差異極顯著，即具有極顯著線性正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）；大葉野豌豆氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)和保衛(wèi)細(xì)胞面積間相關(guān)系數(shù)r=0.953μm，差異極顯著，即具有極顯著線性正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），表皮細(xì)胞周長(zhǎng)和表皮細(xì)胞面積間相關(guān)系數(shù)r=0.651μm，差異顯著，即具有顯著線性正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。

表2 山野豌豆葉片下表皮植紋特征相關(guān)分析Table 2 Correlation analysis of leaf lower epidermal plant print characteristics of V.amoena

表3 大葉野豌豆葉片下表皮植紋特征相關(guān)分析Table 3 Correlation analysis of leaf lower epidermal plant print characteristics of V.pseudo-orobus

2.3 葉肉解剖結(jié)構(gòu)特征

在葉片橫切面上，山野豌豆和大葉野豌豆葉片均由表皮、葉肉和葉脈三部分組成，其中，葉肉薄壁組織分化為柵欄薄壁組織和海綿薄壁組織，為典型異面型葉。兩種野豌豆葉片上、下表皮均由單層細(xì)胞組成且外被角質(zhì)層，上表皮細(xì)胞長(zhǎng)柱形，下表皮細(xì)胞近球形；表皮細(xì)胞大小不一、排列緊密；柵欄薄壁組織由1層長(zhǎng)柱形薄壁細(xì)胞構(gòu)成。山野豌豆葉片上下表皮、柵欄薄壁組織與海綿薄壁組織中有較多后含物，表皮細(xì)胞較薄，柵欄薄壁組織較薄，排列稀疏，海綿薄壁組織略薄，胞間隙明顯，柵海比為1.17，細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度高于大葉野豌豆，為34.81%；大葉野豌豆葉片、角質(zhì)層和表皮細(xì)胞較厚，柵欄薄壁組織與海綿薄壁組織中偶見(jiàn)后含物，柵欄薄壁組織發(fā)達(dá)，排列緊密，海綿薄壁組織較厚，胞間隙較小，柵海比和細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度分別高達(dá)1.38和45.38%，均明顯大于山野豌豆（見(jiàn)圖3，表4）。

表4 兩種野豌豆屬植物葉片解剖結(jié)構(gòu)特征Table 4 Characteristics of leaf anatomical structure of two Vicia species

圖3 兩種野豌豆屬植物葉片解剖結(jié)構(gòu)Fig.3 Leaf anatomical structure of two Vicia species under biological microscope

2.4 主脈解剖結(jié)構(gòu)特征

在生物顯微鏡下，山野豌豆和大葉野豌豆葉片主脈發(fā)達(dá)，由機(jī)械組織、基本組織和維管束組成，在下表皮呈圓弧狀隆起；維管束個(gè)數(shù)均為1，由位于近軸面近心形初生木質(zhì)部和遠(yuǎn)軸面半環(huán)狀初生韌皮部組成，維管束鞘呈環(huán)狀，山野豌豆葉片主脈維管束鞘較明顯。

由表4可知，山野豌豆葉脈突起度為281.17%，大葉野豌豆葉片主脈和維管束直徑分別為528.41和301.97μm，均明顯大于山野豌豆，導(dǎo)管和篩管直徑也較大，葉脈突起度高達(dá)387.17%（見(jiàn)表4，圖4）。

圖4 兩種野豌豆屬植物主脈解剖結(jié)構(gòu)特征Fig.4 Main vein anatomical structure of two Vicia species under biological microscope

3 討論與結(jié)論

植物外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)與其生存環(huán)境關(guān)系緊密，山野豌豆和大葉野豌豆可在山坡、草甸、林緣等瘠薄環(huán)境中維持正常生長(zhǎng)，是因其對(duì)該生境具有一定適應(yīng)能力。本文研究的兩種野豌豆因隸屬于同一科屬，在葉表皮、葉肉和主脈方面結(jié)構(gòu)特征既有相似之處，亦存在不同。

3.1 演化關(guān)系及其抗旱性、抗蟲(chóng)性

植紋是植物表觀紋理，具有獨(dú)特性與排他性，因此植物葉片表觀結(jié)構(gòu)可作為植紋鑒定依據(jù)[10]。吳葉等認(rèn)為，植物葉表皮微形態(tài)特征可為屬內(nèi)種分類和系統(tǒng)演化提供理論依據(jù)[13]。葉表皮氣孔與植物光合作用密切相關(guān)，密集氣孔有助于植物體與外界氣體交換，進(jìn)而促進(jìn)光合效應(yīng)[14]。陸嘉惠等研究表明，葉表皮細(xì)胞垂周壁式樣演化趨勢(shì)為平直-弓形到淺波狀，再到深波狀；氣孔密度和氣孔指數(shù)可映射植物對(duì)干旱環(huán)境適應(yīng)性，二者呈正相關(guān)，二者值越大，植物抗旱能力越強(qiáng)[15]。趙重陽(yáng)等認(rèn)為氣孔長(zhǎng)寬比值反映氣孔形態(tài)特征，同屬不同種間比值大的有進(jìn)化表現(xiàn)，可作為判斷植物種間進(jìn)化程度依據(jù)[16]。本研究結(jié)果表明，在兩種野豌豆葉片表觀結(jié)構(gòu)中，氣孔類型均為無(wú)規(guī)則型，但表皮細(xì)胞垂周壁鑲嵌類型不同，山野豌豆和大葉野豌豆垂周壁式樣分別為淺波狀和深波狀，表現(xiàn)為C型和F型，且大葉野豌豆氣孔密度、氣孔指數(shù)和氣孔長(zhǎng)寬比均較大，此種間差異可作為鑒定野豌豆屬植物依據(jù)之一。由此推斷，山野豌豆葉片表現(xiàn)較原始，大葉野豌豆葉片表現(xiàn)較進(jìn)化，抗旱性較強(qiáng)，這也與雒宏佳等研究結(jié)果一致[17]。同時(shí)分析二者葉片表皮植紋特征參數(shù)相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，兩種野豌豆部分植紋特征間關(guān)聯(lián)方向與關(guān)聯(lián)程度不同，將表觀結(jié)構(gòu)特征量化是對(duì)傳統(tǒng)植物分類方法的補(bǔ)充與完善。

植物葉片上下表皮細(xì)胞外壁被角質(zhì)層，增強(qiáng)不透水性，可防止植物體內(nèi)水分過(guò)分蒸騰，角質(zhì)層還具有機(jī)械支撐作用，避免植株在水分供應(yīng)不足時(shí)立即萎蔫，提高機(jī)體對(duì)炎熱干旱環(huán)境耐受能力，同時(shí)折光性較強(qiáng)，可防止紫外線對(duì)植物造成光化學(xué)傷害，表皮細(xì)胞和角質(zhì)層越厚，抗旱性越強(qiáng)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，兩種野豌豆葉片表皮細(xì)胞排列緊密而整齊，可減少體內(nèi)水分蒸騰，葉片上下表皮均被角質(zhì)層，且氣孔主要分布在下表皮，是對(duì)強(qiáng)光和缺水環(huán)境長(zhǎng)期適應(yīng)結(jié)果。其中，山野豌豆葉片角質(zhì)層略??；大葉野豌豆表皮細(xì)胞和角質(zhì)層較厚，兩種野豌豆均具有一定抗旱能力，但綜合比較，大葉野豌豆更適應(yīng)干旱強(qiáng)光環(huán)境，抗旱能力較強(qiáng)。

劉一華認(rèn)為表皮毛作為天然物理屏障，可有效預(yù)防蟲(chóng)害、食草動(dòng)物傷害和寄生植物危害[19]。趙延霞研究表明，葉片下表皮細(xì)胞越厚，組織結(jié)構(gòu)緊密度越大，抗蟲(chóng)性越強(qiáng)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，山野豌豆下表皮無(wú)毛，表皮細(xì)胞較?。淮笕~野豌豆下表皮具單細(xì)胞表皮毛，表皮細(xì)胞較厚，組織結(jié)構(gòu)緊密度較大，推測(cè)其抗蟲(chóng)性強(qiáng)于山野豌豆。

3.2 葉肉結(jié)構(gòu)及其抗旱性、抗寒性

葉肉是葉片光合作用主要部位，在葉肉薄壁組織中，柵欄薄壁組織和海綿薄壁組織厚度差異直接影響葉綠體分布和光合作用效率，二者分化程度可間接反映環(huán)境中水分狀態(tài)及光照變化，柵海比越大，植物抗旱能力越強(qiáng)，反之則弱[21]。對(duì)兩種野豌豆葉片橫切發(fā)現(xiàn)，二者葉肉中后含物使其表現(xiàn)出耐旱特征[22]。郭學(xué)民等認(rèn)為，柵海比、細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度與抗寒性呈正相關(guān)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度與抗寒性呈負(fù)相關(guān)[23]。山野豌豆較薄的柵欄薄壁組織及疏松的海綿薄壁組織，對(duì)較弱光照或中生、濕生環(huán)境適應(yīng)，耐陰性較強(qiáng)；大葉野豌豆較厚葉片、發(fā)達(dá)柵欄薄壁組織、排列緊密海綿薄壁組織、較厚角質(zhì)層和下表皮單細(xì)胞表皮毛，且因其柵海比和細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度較大，細(xì)胞機(jī)構(gòu)疏松度較小，推測(cè)其抗旱性與抗寒性較強(qiáng)。

3.3 主脈結(jié)構(gòu)及其抗旱性、抗寒性

主脈在葉片中發(fā)揮支持與輸導(dǎo)作用，主脈及其維管束發(fā)達(dá)程度直接影響水分的輸導(dǎo)效率，反映植物抗旱性[24]。維管束鞘也有助于水分傳輸，可增強(qiáng)光合作用，抵御不良環(huán)境因子脅迫[25]。研究認(rèn)為，葉脈突起度與抗寒性呈正相關(guān)，即葉脈突起度越大，葉脈維管組織加快物質(zhì)運(yùn)輸能力，補(bǔ)償更多失水，植物抗寒性越強(qiáng)[26-27]。本研究發(fā)現(xiàn)，兩種野豌豆葉片主脈維管束發(fā)達(dá)，薄壁組織和多層厚角組織有助于貯藏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與水分，提高葉片支撐力，適應(yīng)瘠薄環(huán)境，增強(qiáng)自身抵抗惡劣環(huán)境能力。其中，山野豌豆維管束鞘明顯，說(shuō)明其具有抵抗干旱脅迫能力；但大葉野豌豆主脈及維管束較發(fā)達(dá)，可顯著提高其輸水效率，說(shuō)明其更適應(yīng)干燥環(huán)境，且由于其葉脈突起度較大，說(shuō)明其具有抗寒特征，推測(cè)其抗寒性較強(qiáng)。

綜上所述，山野豌豆葉片表現(xiàn)較原始；耐陰性較強(qiáng)。大葉野豌豆葉片表現(xiàn)較進(jìn)化；抗旱性、抗蟲(chóng)性與抗寒性較強(qiáng)。兩種野豌豆屬植物經(jīng)強(qiáng)日照輻射、干旱貧瘠和寒冷等環(huán)境長(zhǎng)期作用，其葉片形成一系列適應(yīng)結(jié)構(gòu)特征。因此，對(duì)研究植物葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)及其生態(tài)適應(yīng)性評(píng)價(jià)具有重要價(jià)值，將山野豌豆和大葉野豌豆作為園林植物，根據(jù)二者生態(tài)適應(yīng)性將其種植于不同環(huán)境，應(yīng)用前景十分廣闊。