牛步月，劉 路，陳志華，姚迪文，狄生偉，王希彪

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030）

仔豬腹瀉嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)，并造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。隨著全球?qū)p少藥物和疫苗使用呼聲越來越高，通過抗病育種提高機(jī)體自然抗病力成為研究重點。

趨化因子（Chemokines）是一類由細(xì)胞分泌的蛋白，可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生定向遷移。C-X-C基序趨化因子10（C-X-C motif chemokine ligand 10,CXCL10）也稱為干擾素γ誘導(dǎo)蛋白10（Interferon gamma-induced protein 10,IP-10）或小誘導(dǎo)細(xì)胞因子B10（Small-inducible cytokine B10），蛋白大小為8.7 ku[1-2]。CXCL10由CD4+T細(xì) 胞、NK和NKT細(xì) 胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞等分泌[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，IFN（Interferon）、TNF-α（Tumor necrosis factor-α）等刺激物可誘導(dǎo)CXCL10分泌，放大炎癥級聯(lián)反應(yīng)[5]。

CXCL10是趨化因子CXCR3（C-X-C motif chemokine receptor 3）配體，研究發(fā)現(xiàn)CXCR3/CXCL10軸是促進(jìn)免疫細(xì)胞進(jìn)入炎癥組織的關(guān)鍵趨化因子軸之一，與炎癥性疾病，特別是腸道炎癥有強(qiáng)相關(guān)性[6-7]。炎癥性腸?。↖nflammatory bowel disease，IBD）是一種特發(fā)性腸道炎癥性疾病，會累及回腸、直腸、結(jié)腸，腸道黏膜免疫系統(tǒng)異常反應(yīng)，炎癥反應(yīng)在IBD發(fā)病中起主要作用。IBD主要包括潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）和克羅恩?。–rohn disease，CD）兩個獨(dú)立疾病。人類醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)CXCL10在健康人群結(jié)腸上皮細(xì)胞中呈組成性表達(dá)，但在UC和CD患者結(jié)腸上皮細(xì)胞中高度表達(dá)[8-9]；這種差異表達(dá)機(jī)制在于CXCL10通過與CXCR3受體結(jié)合，促進(jìn)Th1細(xì)胞分化并將其趨化到發(fā)生炎癥的結(jié)腸組織[10]。

豬病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)CXCL10在免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11-12]。研究者分別用高毒力和低毒力非洲豬瘟病毒分離株感染豬后，發(fā)現(xiàn)豬CXCL10 mRNA表達(dá)水平顯著增加，通過誘導(dǎo)細(xì)胞活化、趨化性和淋巴細(xì)胞向Th1表型致敏，而在不同病毒感染期間發(fā)揮重要作用，對于建立有效免疫反應(yīng)非常重要[13]。

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（EnterotoxigenicEscherichia coli，ETEC）是引起仔豬細(xì)菌性腹瀉主因。Zhou等使用F4ab、F4ac和F18ac 3種血清型ETEC感染IPEC-J2，發(fā)現(xiàn)F4ac和F18ac感 染IPEC-J2后，CXCL10基因表達(dá)量上調(diào)[14]。C型產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringenstype C，C.perfringenstype C）是引起仔豬腹瀉的另一種主要病原菌，其外毒素引起新生仔豬紅痢。Huang等利用C.perfringenstype C感染7日齡仔豬，根據(jù)仔豬糞便評分將感染豬分為抗性組和敏感組，經(jīng)高通量測序和熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)CXCL10基因在抗性組回腸組織表達(dá)量高于敏感組[15]。根據(jù)CXCL10基因在免疫應(yīng)答中重要作用，Huang等選擇CXCL10基因作為豬一般抗病力候選基因，研究豬CXCL10基因關(guān)鍵外顯子區(qū)域遺傳變異，發(fā)現(xiàn)3′UTR存在SNP c.407T＞C，性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)該SNP與淋巴細(xì)胞百分比、血細(xì)胞比容、平均紅細(xì)胞量等血液參數(shù)性狀顯著相關(guān)[16]。該位點對哺乳仔豬腹瀉和生長性狀的影響未見報道。

DNA元件百科全書（Encyclopedia of DNA elements,Encode）項目通過對人類基因組元件識別和注釋，發(fā)現(xiàn)與疾病等復(fù)雜性狀相關(guān)聯(lián)遺傳變異主要位于基因非編碼區(qū)域[17]。大量研究證實，基因5′調(diào)控區(qū)域在基因精準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)過程中發(fā)揮重要作用，目前關(guān)于豬CXCL10基因啟動子區(qū)域遺傳變異研究未見報道。鑒于此，本研究利用直接測序分析民豬和長白豬CXCL10基因5′側(cè)翼區(qū)域遺傳變異，建立針對遺傳變異的檢測技術(shù)，并在民豬和長白豬群體中展開5′側(cè)翼區(qū)域、3′UTR遺傳變異與哺乳仔豬腹瀉和生長性狀關(guān)聯(lián)分析，以期為豬育種工作提供新基因標(biāo)記和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗用基因組DNA為基礎(chǔ)科研平臺豬遺傳育種研究室保存的民豬和長白豬耳組織DNA。試驗豬群在相同條件下飼喂，35日齡斷奶。記錄哺乳仔豬初生重，3、7、14、21、28和35日齡體重，計算仔豬平均日增重[ADG=（35日齡斷奶重-初生重）/35]。仔豬在哺乳期間，觀察每日糞便性狀，根據(jù)糞便形狀確定哺乳仔豬腹瀉評分。具體評分標(biāo)準(zhǔn)如下：糞便外觀呈條狀或粒狀，為正常腹瀉，評分為0；糞便外觀呈軟便、成形，為輕度腹瀉，評分為1；糞便外觀呈稠狀糞水無分離現(xiàn)象、稀便，為中度腹瀉，評分為2；糞便外觀呈液體、不成形、糞水分離，黏液便或膿便，為重度腹瀉，評分為3[18]。記錄仔豬腹瀉評分，計算哺乳仔豬從出生至35日齡腹瀉評分總和。腹瀉指數(shù)=糞便狀況評分之和/供試驗仔豬總頭數(shù)。腹瀉指數(shù)越高，則試驗仔豬腹瀉越嚴(yán)重。

1.2 試驗試劑

DL2000 DNA Maker、DL5000 DNA Maker、PMD?18-T Vector Cloning Kit、NdeⅠ和MspⅠ限制性核酸內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司；Trans1-T1 Chemically Competent Cell、Trans DNA MakerⅠ均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自Axygen公司；2×TaqMaster Mix（Dye Plus）購自Vazyme公司；Agarose-Molecular Biology Grade購自Invitrogen公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

在NCBI和Ensemble數(shù)據(jù)庫查詢豬CXCL10基因。初步分析發(fā)現(xiàn)起始密碼子ATG位于第一外顯子，第一外顯子全長為121 bp。下載包含豬CXCL10基因起始密碼子ATG上游2 000 bp、第一外顯子和第一內(nèi)含子序列，以此序列為模板，利用Primer 5.0設(shè)計引物CXCL10-5′-F/R，用于擴(kuò)增5′側(cè)翼區(qū)域序列；設(shè)計引物CXCL10-1F/R用于在民豬和長白豬群體中檢測SNP rs337535939位點。按照文獻(xiàn)[16]合成引物CXCL10-2F/R用于CXCL10基因3′UTR區(qū)域SNP c.407T＞C位點檢測（見表1）。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 豬CXCL10基因引物Table 1 Primers used for porcine CXCL10 gene amplification

1.4 豬CXCL10基因5′側(cè)翼區(qū)遺傳變異和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分析

根據(jù)哺乳仔豬腹瀉記錄，分別選取嚴(yán)重腹瀉和健康未腹瀉民豬和長白仔豬各5頭，分別以這20頭豬基因組DNA為模板，利用引物CXCL10-5′-F和CXCL10-5′-R作CXCL10基因5′側(cè)翼區(qū)擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系總體系為20μL，包括10μL 2×TaqMaster Mix（Dye Plus），1μL基因組DNA，各0.8μL上下游引物，7.4μL滅菌水。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，57.7℃退火60 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。

PCR擴(kuò)增結(jié)束后，用濃度為1.5%瓊脂糖凝膠對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測。按照凝膠回收試劑盒說明書，作PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收和純化。純化后產(chǎn)物與PMD18-T連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆菌液經(jīng)PCR鑒定后，送至上海生工生物工程股份有限公司測序。

利用Clustal Omega在線軟件對10頭民豬和10頭長白豬測序結(jié)果作多重序列比對，分析尋找遺傳變異位點。使用在線軟件AnimalTFDB3（http://bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB/#!/tfbs_predict）預(yù)測CXCL10基因5′側(cè)翼區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，進(jìn)一步分析遺傳變異位點是否引起轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點改變。利用DNA Club軟件分析遺傳變異是否引起特異限制性內(nèi)切酶酶切位點變化。

1.5 PCR-RFLP檢測

利用引物CXCL10-1F/R作CXCL10基因5′側(cè)翼區(qū)域擴(kuò)增，取8.5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，0.5μLNdeⅠ限制性內(nèi)切酶，1μL Buffer構(gòu)成NdeⅠPCR-RFLP反應(yīng)體系。利用引物CXCL10-2F/R作CXCL10基因3′UTR擴(kuò)增，取8.5μL擴(kuò)增產(chǎn)物，0.5μLMspⅠ限制性內(nèi)切酶，1μL Buffer構(gòu)成MspⅠPCR-RFLP反應(yīng)體系。兩種混合體系均于37℃水浴5 h，之后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，根據(jù)圖像結(jié)果分析并判斷基因型。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用popgene 1.32分別計算兩個SNPs位點在民豬和長白豬群體中基因型頻率、等位基因頻率、觀測雜合度、期望雜合度和有效等位基因數(shù)。

采用SAS統(tǒng)計軟件（Version 9.4）一般線性模型中GLM程序分別作兩個SNPs位點與民豬和長白豬哺乳仔豬腹瀉評分和生長性狀表型值關(guān)聯(lián)分析，建立模型如下：

Yij表示仔豬腹瀉評分和生長性狀表型值，u表示群體均值，Gi表示基因型效應(yīng)，eij表示隨機(jī)殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬CXCL10基因多態(tài)性和性狀關(guān)聯(lián)分析

2.1.1 豬CXCL10基因5′調(diào)控區(qū)克隆

以豬基因組DNA為模板，設(shè)計引物對CXCL10基因5′調(diào)控區(qū)1 639 bp近端序列作PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測得到單一明亮條帶（見圖1），且條帶長度與預(yù)期結(jié)果1 639 bp相近。對PCR產(chǎn)物純化、克隆和測序，經(jīng)序列比對獲得1 639 bp片段，該片段包含1 477 bp ATG上游區(qū)域，121 bp外顯子1和101 bp內(nèi)含子1。

圖1 豬CXCL10基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Agarosegel photograph of CXCL10 in pig

2.1.2 豬CXCL10基因5′側(cè)翼區(qū)域遺傳變異和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分析

分別以嚴(yán)重腹瀉和健康未腹瀉民豬和長白仔豬基因組DNA為模板，利用引物CXCL10-5′-F/R作PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物分別回收、純化、克隆和測序。比對分析序列測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過PCR擴(kuò)增獲得1 639 bp豬CXCL10基因5′側(cè)翼區(qū)域存在15個遺傳變異，分別位于ATG上游-1341（C/T）、-1338（G/A）、-1040（A/G）、-1022（G/A）、-977（-/G）、-971（T/A）、-832（T/G）、-808（A/G）、-681（G/C）、-666（----/CCAA）、-552（T/A）、-551（-/G）、-462 bp（-/A/C）、-159（A/G）以及+6（C/T）。

利用AnimlTFDB3在線軟件對該序列預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，發(fā)現(xiàn)5個SNPs位點引起轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合能力改變（見表2），5個SNPs中rs346260249、rs337535939、rs339657065和rs331393857均 多 發(fā)于民豬群體，10頭測序民豬中有6頭在這11個位點發(fā)生堿基突變，而測序10頭長白豬中僅1頭在此位點處發(fā)生堿基突變（見表3）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)SNP rs337535939引起轉(zhuǎn)錄因子MLXIPL和NHLH1結(jié)合能力改變（見表2）。當(dāng)SNP rs337535939為G時，存在MLXIPL和NHLH1結(jié)合位點；當(dāng)SNP rs337535939為A時，MLXIPL結(jié)合位點消失，NHLH1結(jié)合能力下降（見表2）。結(jié)合民豬和長白豬測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，在10頭測序長白豬中，僅1頭為A等位基因；而在10頭參與測序民豬中，6頭為A等位基因；在10頭測序健康個體中，4頭民豬和1頭長白豬為A等位基因；10頭參與測序嚴(yán)重腹瀉個體中，2頭民豬為A等位基因（見圖2）。

SNP rs335118294和SNP rs339657065均引起轉(zhuǎn)錄因子EP300結(jié)合能力變化。當(dāng)SNP rs335118294和SNP rs339657065發(fā) 生AG突變時，EP300結(jié)合能力均下降（見表2）。結(jié)合民豬和長白豬測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，對于SNP rs335118294，10頭測序長白豬中，3頭為G等位基因；而在10頭參與測序民豬中，7頭為G等位基因；10頭測序健康個體中，3頭民豬和2頭長白豬為G等位基因；10頭參與測序嚴(yán)重腹瀉個體中，1頭長白豬和4頭民豬為G等位基因（見表3）。對于SNP rs339657065，10頭測序長白豬中，僅1頭為G等位基因；而在10頭參與測序民豬中，6頭為G等位基因；10頭測序健康個體中，4頭民豬和1頭長白豬為G等位基因；10頭參與測序嚴(yán)重腹瀉個體中，2頭民豬為G等位基因（見表3）。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，SNP rs337535939引起NdeⅠ酶切位點（CA|TATG）改變，當(dāng)SNP rs337535939為G等位基因時，存在NdeⅠ酶切位點；當(dāng)SNP rs337535939為A等位基因時，NdeⅠ酶切位點消失（見圖2）。

表2 豬CXCL10基因5'側(cè)翼區(qū)SNPs引起轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點變化Table 2 Changes of transcription factor binding sites caused by SNPs in the 5'flanking region of porcine CXCL10 gene

表3 民豬和長白豬CXCL10基因SNPs統(tǒng)計Table 3 Summary of SNPs in CXCL10 gene of Min and Landrace piglets

圖2 CXCL10基因5′側(cè)翼區(qū)中檢測到SNP rs337535939Fig.2 SNP rs337535939 in 5′flanking region of the CXCL10 gene

2.1.3 豬CXCL10基因PCR-RFLP分析

以民豬和長白豬基因組DNA為模板，利用引物CXCL10-2F/R作PCR擴(kuò)增獲得豬CXCL10基因包含SNP rs337535939位點共849 bp5′側(cè)翼區(qū)域片段，用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ對擴(kuò)增產(chǎn)物消化，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后產(chǎn)生3種基因型。分別是AA基因型（849 bp）、GG基因型（230、619 bp）和AG基因型（230、619、849 bp）（見圖3）。

對于報道的CXCL10基因3′UTR SNP位點c.407T＞C，以文獻(xiàn)[16]報道引物擴(kuò)增獲得497 bp片段，用限制性內(nèi)切酶MspⅠ對擴(kuò)增產(chǎn)物消化，瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)共存在3種基因型，分別是TT基因型（497 bp）、CC基因型（378、119 bp）和TC基因型（378、11、497 bp）（見圖4）。

圖3 CXCL10基因NdeⅠPCR-RFLP基因型分型結(jié)果Fig.3 NdeⅠPCR-RFLP genotyping results of CXCL10 gene

圖4 CXCL10基因SNP c.407T＞C MspⅠPCR-RFLP基因型分型結(jié)果Fig.4 SNP c.407T＞C MspⅠPCR-RFLP genotyping results of CXCL10 gene

2.1.4 豬CXCL10基因SNPs群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

在民豬和長白豬群體中分析CXCL10基因兩個SNPs基因型頻率、等位基因頻率、雜合度和多態(tài)信息含量等群體遺傳參數(shù)。如表4所示，SNP rs337535939在民豬群體中存在AA、AG和GG 3種基因型，基因型頻率分別為0.22、0.56和0.23；A等位基因頻率為0.49，觀測雜合度為0.56，該位點在長白豬群體中僅檢測到4個AA基因型個體，AA基因型頻率為0.02，A等位基因頻率為0.18，觀測雜合度為0.32。SNP c.407T＞C在民豬群體中存在TT、TC和CC 3種基因型，基因型頻率分別為0.17、0.61和0.21；T等位基因頻率為0.48，觀測雜合度為0.60，該位點在長白豬群體中僅檢測到4個TT基因型個體，TT基因型頻率為0.02，T等位基因頻率為0.12，觀測雜合度為0.20。觀測雜合度（Ho）=觀察得到雜和個體數(shù)/樣本個體數(shù)總數(shù)。SNP rs337535939和SNP c.407T＞C的期 望 雜合度（Expected heterozygosity，He）在民豬和長白豬中分別為0.50、0.30；0.50，0.21。這兩個SNPs在兩個群體中多態(tài)信息含量（Polymorphism information content，PIC）值分別為0.37、0.25；0.37、0.19。按照PIC多態(tài)評分標(biāo)準(zhǔn)（PIC＞0.5為高度多態(tài),0.25＜PIC＜0.5為中度多態(tài)，PIC＜0.25為低度多態(tài)），本研究新鑒定SNP rs337535939和報道SNP c.407T＞C在民豬群體中均為中度多態(tài)，而在長白豬群體中為低度多態(tài)。

表4 CXCL10基因SNPs在民豬和長白豬群體中群體遺傳參數(shù)Table 4 Population genetic parameters of SNPs of the CXCL10 gene in Min and Landrace piglets

2.1.5豬CXCL10基因SNPs與哺乳仔豬腹瀉和生長性狀關(guān)聯(lián)分析

性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，CXCL10基因SNP rs337535939與民豬仔豬7、14、21、28、35日齡體重以及日增重相關(guān)（見表5）；與長白仔豬腹瀉指數(shù)、14、28、35日齡體重和日增重相關(guān)（見表5）。在民豬群體中，SNP rs337535939各種基因型個體抗腹瀉能力差異不顯著；GG基因型仔豬35日齡斷奶重和日增重分別比AA基因型個體高0.75 kg和30 g（P＜0.05）。在長白豬群體中，GG型仔豬抗腹瀉能力與AA型差異不顯著，顯著低于AG雜合子個體（P＜0.05）；GG基因型個體35日齡斷奶重和日增重分別比AA基因型個體高3.36 kg和0.08 kg（P＜0.05）。

CXCL10基因3′UTR區(qū)域SNP c.407T＞C與民豬和長白仔豬腹瀉和生長性狀均無相關(guān)性。在長白豬群體中TT、TC和CC日增重分別為140、190和200 g，TT基因型個體與CC基因型個體日增重相差60 g。在民豬和長白豬群體中，與TT基因型個體比較，CC型個體具有較低腹瀉指數(shù)、較高35日齡斷奶重和日增重（見表6）。

表5 CXCL10基因SNP rs337535939與民豬和長白仔豬腹瀉指數(shù)和生長性狀關(guān)聯(lián)分析Table 5 Association analysis of CXCL10 gene SNP rs337535939 with diarrhea index and performance traits in Min and Landrace piglets

表6 CXCL10基因c.407T＞C與民豬和長白仔豬腹瀉指數(shù)和生長性狀關(guān)聯(lián)分析Table 6 Association analysis of CXCL10 gene SNP c.407T＞C with diarrhea index and performance traits in Min and Landrace piglets

3 討論

本研究通過直接測序在CXCL10基因5'側(cè)翼區(qū)域鑒定出13個SNPs，其中g(shù).71696440以及2個插入突變?yōu)樾掳l(fā)現(xiàn)，其他10個SNPs在Ensembl的SNPs數(shù)據(jù)庫中已標(biāo)注。對這些遺傳變異位點分析轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，發(fā)現(xiàn)SNP rs337535939由G到A堿基突變引起轉(zhuǎn)錄因子MLXIPL（MLX interacting protein like，MLXIPL）結(jié)合位點變化。MLXIPL也稱為碳水化合物反應(yīng)性元素結(jié)合蛋白（Carbohydrate-responsive element-binding protein，ChREBP）[19]，該基因編碼Myc/Max/Mad超家族的基本螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)MLXIPL可直接激活多個參與糖酵解和脂肪合成基因表達(dá)，調(diào)控糖代謝和脂肪酸合成[20]。

轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點變化可能影響基因轉(zhuǎn)錄效率并最終導(dǎo)致表型性狀改變，因此本試驗深入分析SNP rs337535939。通過序列比對分析發(fā)現(xiàn)該SNP多發(fā)于民豬群體；10頭測序長白豬中，僅1頭為A等位基因；而10頭參與測序民豬中，6頭為A等位基因。這表明民豬群體具有較高遺傳變異，長白豬經(jīng)長期人工選育后，在分子水平遺傳變異降低。

群體遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在民豬和長白豬群體中G（或C）等位基因頻率均高于A（或T）。性狀關(guān)聯(lián)分析證實，GG型民豬和長白仔豬35日齡體重和日增重（ADG）均高于AA型個體。GG型長白豬腹瀉指數(shù)低。民豬和長白豬群體研究表明，選育GG型個體（或淘汰AA型個體）可降低腹瀉發(fā)生，提高仔豬日增重。

民豬廣泛分布于東北地區(qū)，與引入品種相比較，具有抗逆性強(qiáng)、繁殖力高、耐粗飼、肉質(zhì)好等優(yōu)良特性。本研究發(fā)現(xiàn)長白豬SNP rs337535939G等位基因頻率高于民豬群體，在檢測長白豬群體中，僅有4個AA基因型個體。長白豬是著名引入品種，推測在長期人工選育過程中，具有高生長速度GG型個體得到選擇，而低斷奶重和日增重AA型個體被淘汰；民豬由于未經(jīng)嚴(yán)格人工選育，其群體中仍存在一定數(shù)量AA基因型個體。

仔豬出生時脂肪組織中脂肪沉積量較小，但在哺乳期脂肪快速沉積。近年研究表明，轉(zhuǎn)錄因子MLXIPL在豬脂肪和能量代謝中發(fā)揮作用。Zhang等發(fā)現(xiàn)葡萄糖可直接通過ChREBP誘導(dǎo)豬前脂肪細(xì)胞中脂肪生成和成脂基因表達(dá)[21]；高糖條件下，MLXIPL在豬皮下前脂肪細(xì)胞表達(dá)量高于肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞[22]。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)MLXIPL可與GG型個體CXCL10基因啟動子區(qū)域結(jié)合，性狀關(guān)聯(lián)分析表明GG型個體具有高抗腹瀉能力、斷奶重和日增重。MLXIPL是否通過SNP rs337535939影響CXCL10基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，進(jìn)而影響哺乳仔豬抗病能力和生長性狀，有待后期深入研究。

人類醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)CXCL10啟動子區(qū)域SNPs（-135G＞A[rs56061981]和-1447A＞G[rs4508917]）影響血漿CXCL10基因表達(dá)水平，與腦型瘧疾等疾病易感性相關(guān)[23]。本研究在豬CXCL10啟動子區(qū)域預(yù)測到STAT、EP300等多種促炎性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，其中預(yù)測EP300結(jié)合區(qū)域存在兩個SNP（rs335118294和rs339657065）。EP300可作為一種組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶，通過染色質(zhì)重塑調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞增殖和分化過程中發(fā)揮表觀調(diào)控作用。陳夢等研究發(fā)現(xiàn)EP300高表達(dá)可通過調(diào)節(jié)H3K27ac修飾，促進(jìn)CXCL10基因表達(dá)，影響小鼠腸道炎癥發(fā)生發(fā)展[24]。下一步可深入研究SNPrs335118294和rs339657065功能，分析EP300是否通過組蛋白修飾調(diào)控豬CXCL10基因表達(dá)參與仔豬腹瀉遺傳調(diào)控。

Huang等分析CXCL10基因SNP c.407T＞C與不同品種豬血紅蛋白濃度相關(guān)性時，發(fā)現(xiàn)該SNP與20日齡仔豬血液中淋巴細(xì)胞百分率、80日齡生長豬血細(xì)胞比容和平均紅細(xì)胞量顯著相關(guān)（P＜0.05）；與80日齡生長豬血液中血紅蛋白濃度極顯著相關(guān)（P＜0.01），而紅細(xì)胞在免疫反應(yīng)中起作用，表明該SNP對免疫反應(yīng)有影響[16]。本研究通過性狀關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)SNP c.407T＞C與民豬和長白仔豬腹瀉和生長性狀均無相關(guān)性（P＞0.05），但在長白豬群體中TT、TC和CC日增重分別為140、190和200 g，TT基因型個體與CC基因型個體日增重相差60 g。性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果不顯著極有可能因為試驗群體不夠大。該結(jié)果表明利用該標(biāo)記對免疫性狀選擇，不影響哺乳仔豬抗腹瀉能力，可能對生長性能存在影響。

4 結(jié)論

本研究在豬CXCL10基因啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)15個SNP位點，轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測發(fā)現(xiàn)其中SNP rs337535939引起MLXIPL轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點改變，建立針對該SNP位點NdeⅠPCR-RFLP分型技術(shù)。性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)豬SNP rs337535939位點影響民豬和長白豬斷奶重和日增重，影響長白豬仔豬腹瀉；SNP c.407T＞C對民豬和長白豬抗腹瀉能力和斷奶重等經(jīng)濟(jì)性狀無負(fù)面影響。