張 曦，王秀雪，鄒春蕾

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，沈陽110161）

辣椒疫?。≒hytophthora blight）是由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsiciLeonian）侵染的土傳性病害，自首次在美國發(fā)現(xiàn)以來，已在全球多個(gè)國家和地區(qū)辣椒種植區(qū)發(fā)生，成為威脅全球辣椒生產(chǎn)主要病害[1-3]，如何防控成為辣椒生產(chǎn)亟待解決的問題。目前，辣椒疫病防控主要從栽培管理、化學(xué)防治和種植抗病品種等方面開展[4-5]，由于灌溉使辣椒疫霉菌在土壤中轉(zhuǎn)移，疫病一旦發(fā)生較難根除[6]，加之疫霉菌繁殖能力高，對殺菌劑不敏感，同時(shí)長期使用化學(xué)藥物加重環(huán)境污染，因此種植抗病品種是防治辣椒疫病最經(jīng)濟(jì)且有效措施。

目前，辣椒疫病抗源主要包括CM334、PI201234和Perennial，已利用這些抗源材料找到部分辣椒抗疫病基因QTL。Thabuis等利用3種抗疫病材料將主效抗性基因定位于5號染色體，Phyto5.1和Phyto5.2兩個(gè)位點(diǎn)可解釋超過60%表型變異[7]；Bonnet等利用CM334和‘Yolo Wonder’構(gòu)建重組自交系群體將Pc-5.1和Pc-5.2兩個(gè)主效QTL位點(diǎn)定位在5號染色體上[8]；Minamiyama等以CM334為親本構(gòu)建定位群體，使用辣椒疫霉菌不同生理小種和不同接菌濃度將主要抗性QTL位點(diǎn)定位在5號染色體上[9-11]；Mallard等將已報(bào)道定位到辣椒遺傳圖譜中QTL位點(diǎn)作元分析，整合到辣椒第5號染色體3個(gè)抗性QTL位點(diǎn)，分別為MetaPc5.1、MetaPc5.2和MetaPc5.3，其中MetaPc5.1對疫病抗性貢獻(xiàn)率最高[12]；Wang等利用辣椒疫霉菌2號生理小種對以PI201234為親本構(gòu)建的F2分離群體作遺傳分析，將抗性基因定位在辣椒5號染色體1.08 Mb區(qū)域內(nèi)（Chr05:29,097,205-30,177,879）[13]；而Xu等以CM334和NMCA10399為親本構(gòu)建定位群體將PhR10基因定位在10號染色體長臂末端2.57 Mb范圍內(nèi)，找到一個(gè)新辣椒抗疫病基因位點(diǎn)[14]；Muhammad等結(jié)合GWAS對構(gòu)建的RIL群體測序，在辣椒5號染色體3個(gè)QTL位點(diǎn)分別找到15、20、28個(gè)辣椒抗疫病候選基因[15]。另外，利用同源克隆方法也發(fā)掘部分辣椒抗疫病相關(guān)基因，如病程相關(guān)蛋白（CaPR1、CAPR4）、防 御 相 關(guān) 基 因（CaChi3、CaODC1、CaOSM1、CaCYP450A、CaPOD）等，為揭示辣椒抗疫病分子機(jī)理提供理論依據(jù)。

由于不同抗源對疫病抗病性不同，加之辣椒疫霉菌生理小種選擇和病原菌接菌條件等因素影響，辣椒抗疫病基因定位研究較復(fù)雜，研究結(jié)果存在差異。通過調(diào)查遼寧省辣椒生產(chǎn)情況，張里等明確遼寧省辣椒疫霉菌優(yōu)勢小種為3號生理小種[16]，抗3號生理小種辣椒抗源材料對1號和2號生理小種也具有抗性，同時(shí)3號生理小種也是廣東、重慶、山西、內(nèi)蒙古、青海等省優(yōu)勢小種[17-19]。針對辣椒生產(chǎn)上遇到的實(shí)際問題，課題組利用接菌鑒定和高代自交結(jié)合方式獲得對辣椒疫霉菌3號生理小種完全免疫品系ZCM334。

本研究以ZCM334作為抗源，構(gòu)建辣椒抗疫病基因定位群體，選取BC1F1抗、感疫病分離群體分別構(gòu)建極端性狀混池測序，采用SLAF-BSA開展辣椒抗疫病基因初步定位，為繼續(xù)挖掘辣椒抗疫病基因奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為培育辣椒抗疫病新品種提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 植物材料與群體構(gòu)建

前期對亞蔬-世界蔬菜中心高抗疫病材料CM334接菌鑒定，多代自交后獲得對辣椒疫霉菌3號生理小種免疫的高代自交系材料ZCM334，該材料對辣椒疫病表現(xiàn)完全免疫，本研究以免疫材料ZCM334為父本，以感病品種Early Calwonder為母本，雜交獲得F1代后，自交得到F2代，同時(shí)F1代與感病母本Early Calwonder回交得到BC1F1代。利用得到的各世代群體作抗病性鑒定和遺傳分析，其中BC1F1代作為辣椒抗疫病基因初步定位群體用于SLAF-BSA測序。

1.2 辣椒疫霉菌培養(yǎng)與接菌方法

本研究采用辣椒疫霉菌3號生理小種ZY14由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所園藝病害研究室劉長遠(yuǎn)研究員提供。首先對ZY14復(fù)壯和擴(kuò)繁后，轉(zhuǎn)至V8培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)7 d；待菌絲長滿培養(yǎng)皿后，將培養(yǎng)基切成2 cm3小塊，轉(zhuǎn)移至無菌水中浸泡3 d；產(chǎn)孢后置于10℃培養(yǎng)箱中1 h促進(jìn)孢子釋放，24℃環(huán)境條件下30 min后使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子濃度，加無菌水稀釋辣椒疫霉菌孢子濃度至2 000個(gè)孢子·mL-1。

將種植于穴盤、長至4～6片真葉辣椒植株轉(zhuǎn)移至人工氣候室內(nèi)，采用灌根接菌法對辣椒植株接菌，用注射器在每個(gè)植株根部土壤中注入5 mL游動(dòng)孢子懸浮液，接種后保持環(huán)境溫度為25～28℃，土壤相對濕度＞90%。

1.3 辣椒抗疫病性狀鑒定和遺傳分析

對免疫親本ZCM334、感病親本Early Calwonder、正反交F1代、回交BC1F1代和F2代群體接菌鑒定，以感病親本Early Calwonder為對照，在感病對照全部發(fā)病時(shí)調(diào)查各世代群體感病植株個(gè)數(shù)，感病植株發(fā)病癥狀為植株根莖部變黑并發(fā)生縊縮、植株萎蔫，與感病親本表現(xiàn)一致，根據(jù)調(diào)查結(jié)果對辣椒抗疫病性狀作遺傳分析。

1.4 混池構(gòu)建與DNA提取

為確保所有植株全部接菌成功，并保證準(zhǔn)確篩選出抗、感植株用于構(gòu)建極端性狀混池，本研究采用二次接菌，首先在感病對照全部發(fā)病時(shí)對感病個(gè)體取樣，從中選取100個(gè)單株構(gòu)建極端感病混池，接下來將剩余未表現(xiàn)發(fā)病癥狀植株個(gè)體第2次接菌，同樣設(shè)置抗、感病對照，在第2次接菌10 d后對仍表現(xiàn)抗病個(gè)體取樣，從中選取100個(gè)單株構(gòu)建極端抗病混池。采用CTAB法分別提取兩個(gè)混池各單株，利用Nanodrop 2000測定DNA濃度等量混合。免疫親本ZCM334、感病親本Early Calwonder、抗病池和感病池共計(jì)4個(gè)樣品送交北京百邁客生物科技有限公司作SLAF-seq測序。

1.5 SLAF文庫構(gòu)建及測序數(shù)據(jù)分析

選擇已測序完成辣椒CM334基因組（2 753.50 Mb）為參考基因組，根據(jù)選定最適酶切方案，對檢測合格各樣品基因組DNA分別酶切。對得到酶切片段（SLAF標(biāo)簽）3′端加A處理、連接Dual-index4測序接頭、PCR擴(kuò)增、純化、混樣、切膠選取目的片段，文庫質(zhì)檢合格后用Illumina HiSeqTM2500測序。利用Dual-index對測序得到原始數(shù)據(jù)作識別，得到各樣品reads。過濾掉測序reads接頭后，通過將reads與參考基因組比對，在親本和混池中開發(fā)SLAF標(biāo)簽，尋找在親本中存在多態(tài)性SLAF標(biāo)簽和有reads覆蓋區(qū)域SNP。SNP檢測主要使用GATK軟件工具包實(shí)現(xiàn)。

1.6 辣椒抗疫病基因初步定位

將測序得到的SNP作關(guān)聯(lián)分析，獲得與性狀緊密關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，并根據(jù)關(guān)聯(lián)閾值確定候選區(qū)域，使用BLAST軟件對候選區(qū)域內(nèi)基因分別與NR、SwissProt、GO、COG、KEGG數(shù)據(jù)庫比對，作基因功能注釋和生物通路富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZCM334抗辣椒疫病遺傳分析

對各世代群體植株灌根接菌后發(fā)現(xiàn)，感病對照在接菌后第5天全部發(fā)病，因此將接菌后第5天作為調(diào)查植株抗病性時(shí)間點(diǎn)；在此時(shí)間點(diǎn)統(tǒng)計(jì)各世代材料發(fā)病情況，結(jié)果表明，免疫親本ZCM334對辣椒疫霉菌3號生理小種完全免疫，而感病親本Early Calwonder則全部發(fā)病死亡（見圖1）；F1植株全部抗病，表明ZCM334對辣椒疫病抗性由1對顯性基因控制；調(diào)查BC1F1群體中抗病植株685株，感病植株643株；F2株系抗病植株441株，感病植株162株。經(jīng)卡平方檢驗(yàn)可知，BC1F1分離群體符合1∶1分離比例（χ2=1.27＜χ20.05=3.84），而F2群體也同樣符合3∶1分離比（χ2=1.02＜χ20.05=3.84）（見表1），說明ZCM334對辣椒疫病抗性由一對主效基因控制。

圖1 各世代群體接菌5 d時(shí)發(fā)病情況Fig.1 Incidence of the populations on the 5th day after inoculation

表1 辣椒抗、感疫病親本和各世代群體遺傳分析Table 1 Genetic analysis of resistant parent,susceptible parent and populations in pepper

2.2 辣椒抗疫病基因初步定位分析

通過SLAF-seq技術(shù)對抗病父本（P）、感病母本（M）、抗病混池（aa）和感病混池（ab）測序，共開發(fā)SLAF標(biāo)簽153 471個(gè)，其中父本和母本標(biāo)簽數(shù)分別為140 533和141 870個(gè)，測序平均深度為35.06x；抗病混池和感病混池分別為153 454和153 067個(gè)，混池測序平均深度為131.78x（見表2）。使用GATK軟件工具包實(shí)現(xiàn)SNP檢測，共得到638 011個(gè)SNP，在SNP-index關(guān)聯(lián)分析前，先對638 011個(gè)SNP位點(diǎn)過濾，過濾掉307個(gè)有多重突變SNP位點(diǎn)，391 435個(gè)混池間一致SNP位點(diǎn)，155 816個(gè)混池中read支持度小于4位點(diǎn)，27 838個(gè)親本中不存在SNP位點(diǎn)，最終獲得62 615個(gè)高質(zhì)量可信SNP位點(diǎn)。采用SNPNUM方法對△SNP-index擬合，取每個(gè)SNP附近200個(gè)SNP的△SNP-index中值作為該位點(diǎn)擬合后關(guān)聯(lián)值。經(jīng)SNP-index關(guān)聯(lián)分析確定目標(biāo)基因候選區(qū)域在辣椒第5號染色體5.1 Mb范圍內(nèi)（Chr05:161627379-166 731 706），共26個(gè)候選基因。

2.3 候選基因功能注釋分析

使用BLAST軟件對關(guān)聯(lián)區(qū)域內(nèi)候選基因分別在NR數(shù)據(jù)庫、Swissprot數(shù)據(jù)庫、GO數(shù)據(jù)庫、KEGG數(shù)據(jù)庫和COG數(shù)據(jù)庫注釋，這些基因與細(xì)胞壁過氧化物酶、LRR受體、抗真菌蛋白、抗病蛋白、脅迫誘導(dǎo)蛋白等有關(guān)（見表3）。

表2 樣品測序數(shù)據(jù)評估與SLAF標(biāo)簽統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of sample sequencing data assessment and SLAF tag

表3 定位區(qū)域內(nèi)基因注釋信息Table 3 Gene annotation in positioning area

3 討論

近年來，多數(shù)研究者對辣椒疫病抗病性鑒定采用病情分級方法[13,20]，而本試驗(yàn)在對辣椒接菌過程中發(fā)現(xiàn)，僅植株出現(xiàn)發(fā)病癥狀，無論是根莖部變黑出現(xiàn)縊縮，還是葉片萎蔫脫落，均出現(xiàn)死亡[21]，因此本研究僅將抗病性分為抗病和感病兩種情況，而不作病情分級分析，目的是為得到極抗和極感材料用于目標(biāo)基因初步定位。

目前育種家通過研究辣椒疫病3種抗源發(fā)現(xiàn)，不同抗源材料對疫病抗性遺傳規(guī)律不同，如CM334對辣椒疫霉菌抗性由兩個(gè)非連鎖隱性基因控制[22]，或是由3個(gè)等位抗性基因控制[23]，也有研究認(rèn)為是由一個(gè)顯性基因和一個(gè)隱性上位基因控制[24]，或存在兩個(gè)獨(dú)立顯性基因[25]；PI201234抗性是由一個(gè)顯性基因[26]或一個(gè)顯性基因加上修飾基因控制[27]；而Perennial抗性則是由存在加性效應(yīng)和上位效應(yīng)多個(gè)基因控制[28]。

本研究采用ZCM334為抗源，該材料以CM334為親本，經(jīng)自交后接菌鑒定，保留抗疫病植株開展下一代自交純化，通過連續(xù)六代接菌、選擇和自交，最終獲得對辣椒疫霉菌3號生理小種完全免疫材料，比高抗材料CM334純合度更高。通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)F1群體全部抗病，說明ZCM334疫病抗性由顯性基因控制；同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)在接菌后感病對照全部發(fā)病時(shí)調(diào)查的BC1F1分離群體中抗、感植株分離比符合1∶1，而F2群體抗、感植株符合3∶1分離比，因此推斷在感病對照全部發(fā)病時(shí)，ZCM334對辣椒疫病抗性由一對主效基因控制，說明在辣椒疫霉菌侵染早期階段，ZCM334對辣椒疫霉菌3號生理小種抗性是由一對主效基因控制的顯性性狀。

通過SLAF-BSA測序?qū)⒑蜻x區(qū)域定位到辣椒第5號染色體5.1 Mb（161627379～166 731 706）范圍內(nèi)，這一區(qū)間與Mallard等整合到MetaPc5.2抗性位點(diǎn)（53 089 203～162 656 768）有部分重合[12]。對候選基因注釋發(fā)現(xiàn)，部分候選基因與細(xì)胞壁過氧化物酶相關(guān)，過氧化物酶是重要植物保護(hù)酶之一，在植物細(xì)胞壁合成過程中發(fā)揮重要作用，積極應(yīng)答抗生物和非生物脅迫等過程，當(dāng)植物被病菌侵染后，過氧化物酶通過誘導(dǎo)改變植物細(xì)胞壁等方式形成第一道物理屏障，對病原菌被動(dòng)防御起關(guān)鍵作用；還有一些類似于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的LRR受體屬于植物抗性蛋白（R蛋白），R蛋白感應(yīng)病原產(chǎn)生的激發(fā)子，從而觸發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)快速啟動(dòng)防衛(wèi)反應(yīng)，參與植物對病原菌主動(dòng)防御。后續(xù)將繼續(xù)深入研究該基因辣椒疫病抗性。

由于研究者所選用辣椒疫病抗源親本大多數(shù)為高抗材料，加之利用辣椒疫霉菌不同生理小種開展研究，使辣椒抗疫病基因（位點(diǎn)）定位結(jié)果不同。本研究所選用辣椒抗疫病材料ZCM334是對辣椒疫霉菌3號生理小種免疫的自交系，以此構(gòu)建基因定位群體可更準(zhǔn)確定位目標(biāo)基因。未來將進(jìn)一步在候選區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)SSR分子標(biāo)記，并在構(gòu)建BC1F2群體中篩選重組單株，縮小候選區(qū)間范圍，以期精細(xì)定位到辣椒抗疫病基因，為今后轉(zhuǎn)基因育種奠定良好基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究利用獲得辣椒疫病免疫材料ZCM334構(gòu)建各世代群體開展辣椒抗疫病遺傳分析發(fā)現(xiàn)，ZCM334對辣椒疫病抗性是由一對主效顯性基因控制，通過采用SLAF-BSA測序技術(shù)對構(gòu)建的BC1F1群體作混池測序，初步將辣椒抗疫病基因定位在辣椒第5號染色體5.1 Mb范圍內(nèi)，根據(jù)基因注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)與抗病相關(guān)基因用于后續(xù)研究。