王海珊 鄒 平# 葉敬旴 包本濤 楊常亮 畢曉伊 王 潔

(1.云南大學生態(tài)與環(huán)境學院，云南 昆明 650091；2.云南大學國際河流與生態(tài)安全研究院，云南 昆明 650091；3.云南省高原山地生態(tài)與退化環(huán)境修復重點實驗室，云南 昆明 650091；4.云南省國際河流與跨境生態(tài)安全重點實驗室，云南 昆明 650091)

大量污染物進入水體，分解代謝消耗溶解氧，導致水體厭氧或缺氧，產生H2S、NH3等氣體，同時形成FeS、MnS等黑色物質，從而形成黑臭水體[1]。黑臭水體不僅影響城市景觀，且對人體健康存在危害[2-3]。黑臭水體的治理方法主要有物理法、化學法及生物法。近年來，生物法由于具有處理量大、成本低、無二次污染等[4]諸多優(yōu)點被廣泛應用于黑臭水體的治理。生物法主要包括微生物強化法、植物吸收法等。

微生物強化法是一種通過投加菌劑、促生劑等手段，使水體中微生物的多樣性及生物量迅速提高，形成一定的菌群規(guī)模[5]，從而強化微生物對污染物降解作用的方法。投加菌劑是黑臭水體治理中極為常用的微生物強化法，目前主要集中于土著菌劑及工程菌劑兩大類型的研究。如楊文娟[6]利用目標黑臭水體富集培養(yǎng)光合菌劑及反硝化菌后制成土著菌劑，用于凈化黑臭水體后，TN、TP、COD去除率分別達到55.30%、42.68%、57.67%。莊景等[7]運用工程菌劑處理無錫市滸溪河水體，其對氨氮、TP、COD去除率分別達到58.00%、56.00%、43.00%。

土著菌劑及工程菌劑均是通過人為手段篩選并富集培養(yǎng)某些具有較強污染物降解特性的功能菌群后，按一定比例配制而成的菌劑。兩種菌劑菌種來源不同，對黑臭水體的適應性、凈化效果等也可能產生差異。但目前對于兩大類型菌劑對黑臭水體適應性、凈化效率及機制的比較研究尚少。故本研究以云南省昆明市晉寧區(qū)晉城百花街東干河為目標黑臭水體，選用土著菌劑及工程菌劑代表各1種進行黑臭水體凈化實驗，并進行高通量測序分析兩種菌劑凈化黑臭水體后的微生物群落結構，比較兩種菌劑對黑臭水體的適應性、凈化效率差異，并從微生物的角度分析差異產生的原因，從而對兩種菌劑對黑臭水體的凈化機制進行初步探討，為黑臭水體治理工作中更科學地選用菌劑提供一定的理論指導。

1 材料與方法

1.1 微生物菌劑

利用東干河黑臭水分別富集培養(yǎng)硝化菌、酵母菌、光合菌、放線菌，培養(yǎng)期間每天監(jiān)測4種菌的生長狀態(tài)，當達到對數生長期時，參照前期研究結果，迅速按3∶3∶3∶4的體積比混勻[8]125，配制成土著菌劑A(本實驗室自主研發(fā))，為保證微生物保持較高活性，避免微生物進入衰亡期影響實驗結果，土著菌劑A需現配現用。工程菌劑B為某環(huán)保公司生產的工程菌劑，其主要組成菌種為植物源枯草芽孢桿菌屬(Bacillussubtilis)、梭菌(Clostridium)、乳酸菌(Lactobacillus)、厭氧繩菌(Anaerolinea)等。

1.2 實驗樣品

實驗所需水樣和底泥取自云南省昆明市晉寧區(qū)晉城百花街東干河，該河道流速較低，且常年黑臭，河道周圍有較多居民居住，并分散著各種中小企業(yè)，是典型的鄉(xiāng)鎮(zhèn)復合型污染河道。將該黑臭河道的水樣及底泥混勻靜置2 h后，測定黑臭水體背景值，結果見表1。

表1 黑臭水體背景值Table 1 Black-odorous water background values

1.3 實驗方法

1.3.1 確定工程菌劑的最佳投加量

兩種菌劑對黑臭水體的凈化實驗均需在最佳投加量下進行。由前期實驗可知，土著菌劑A最佳投加量為50 ml/L[8]127。工程菌劑B最佳投加量通過單因素實驗得到：投加量依次設置為0.1、0.5、1.0、5.0、25.0 g/L；實驗在搖瓶機(ZHWY-2102C)中進行，溫度為25 ℃，轉速為120 r/min；每天定時取樣，分別測定1個實驗周期內(實驗周期的時間長短依據指標去除率而定，當指標去除率穩(wěn)定時，則實驗結束，所有實驗均如此)氨氮、TP和COD的去除率；每個實驗重復操作3次。

1.3.2 不同菌劑在最佳投加量狀態(tài)下對黑臭水體的凈化效果

本實驗設置3個實驗組，分別按最佳投加量加入土著菌劑A及工程菌劑B，空白組不加菌劑。實驗在搖瓶機中進行，溫度為25 ℃，轉速為120 r/min。每天定時取樣，分別測定1個實驗周期內氨氮、TP和COD的去除率，比較3個實驗組對氨氮、TP和COD去除率的差異，并探究產生差異的原因。

1.4 水質指標測定方法

實驗過程中，每天定時取上清液，將其放入離心機(Allegra X-30R)中(8 000 r/min，-4 ℃)離心5 min，取上清液測定TP、COD、氨氮。TP、COD、氨氮分別采用鉬酸銨分光光度法、重鉻酸鉀法、納氏試劑分光光度法測定[9]。

1.5 微生物群落結構多樣性分析方法

本實驗通過高通量測序分析細菌、真菌群落結構多樣性，以期從細菌、真菌角度理解不同菌劑對黑臭水體凈化效率產生差異的原因。凈化實驗結束后，分別取3個實驗組泥水混合物各50 mL，放入離心機(12 000 r/min，-4 ℃)離心10 min，收集離心沉淀物并做好標記，-80 ℃保存，送至上海某生物醫(yī)藥科技有限公司進行高通量測序。3個實驗組樣品使用該生物醫(yī)藥科技有限公司的DNA提取試劑盒進行DNA提取，在確定提取的DNA樣品滿足上機測序的用量需求后，用通用引物515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’)和907R(5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’)擴增細菌16S rDNA的V4～V5區(qū)。用引物ITS1F(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和ITS2R (5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)擴增真菌ITS的ITS1區(qū)。擴增結束后對聚合酶鏈式反應(PCR)產物進行純化，純化后的產物通過MiSeq平臺完成測序。預處理過程中各參數的設置詳見參考文獻[10]。

1.6 數據分析方法

數據采用Origin 8.0軟件及I-Sanger云平臺分析。

2 結果與討論

2.1 不同菌劑對黑臭水體的凈化效率

2.1.1 工程菌劑B的最佳投加量

不同投加量下工程菌劑B對黑臭水體的凈化效果見圖1，當投加量為5.0 g/L時，工程菌劑B對黑臭水體中氨氮、TP、COD的去除率最大，分別達到55.32%、75.57%、45.92%。在一個實驗周期內，隨著工程菌劑B投加量的增加，其對黑臭水體中氨氮、TP、COD去除率大體呈先升高后降低趨勢。這可能是因為菌劑投加量過大時，培養(yǎng)體系的養(yǎng)分有限，微生物之間存在激烈的生存競爭，經過較短時間的生長繁殖后，菌群迅速進入衰亡期，大量微生物死亡，凈化能力下降。

圖1 不同投加量下的去除率Fig.1 Removal efficiency under different dosages

2.1.2 兩種菌劑對黑臭水體的凈化效率

由圖2可知，1個實驗周期內，空白、工程菌劑B、土著菌劑A的氨氮去除率分別為25.32%、51.32%、92.39%，TP去除率分別為71.05%、72.57%、89.29%，COD去除率分別為9.52%、43.92%、62.93%。3個實驗組對3個指標的去除率表現為土著菌劑A>工程菌劑B>空白。相較于空白，菌劑對氨氮、TP、COD的去除率均有不同程度的提升，這說明投加菌劑對于強化黑臭水體污染物去除是必要的，這也是目前其被廣泛應用于黑臭水體治理的原因。

圖2 不同菌劑處理下的去除率Fig.2 Removal efficiency under different microbial agent treatments

在實驗初期土著菌劑A對TP、COD就有較高的去除率，而工程菌劑B對其去除率較低。6 d時，土著菌劑A對氨氮、TP、COD的去除率與工程菌劑B相比分別高41.07百分點、16.72百分點、19.01百分點，凈化效果明顯優(yōu)于工程菌劑B。這可能是因為土著菌劑A的菌種來自于目標黑臭水體，其世代生存于目標黑臭水體中，已完成馴化及演替過程，對目標黑臭水體具有極強的適應性及耐受性，能在短時間內快速適應黑臭水體的極端惡劣環(huán)境，快速降解污染物，故在實驗初期即呈現出較高的去除率，且一直處于領先狀態(tài)。工程菌劑B的菌種并非來自于目標黑臭水體，當其投入目標黑臭水體中時，微生物需要適應新的環(huán)境，其生長繁殖有一個較長的延遲期，故在實驗初期呈現出較低的污染物去除率，隨著實驗時間的延長，微生物逐漸適應新的生存環(huán)境，逐漸發(fā)揮凈化作用，污染物去除率也逐漸提高，但其去除率在有效時間內始終低于土著菌劑A。

綜上所述，土著菌劑A對黑臭水體適應性更高，可在短時間內迅速降解污染物。工程菌劑B延遲期較長，需要適應一定時間，污染物去除率才逐漸提高，但去除率始終低于土著菌劑A。因此，土著菌劑A應用于黑臭水體的凈化，可縮短黑臭水體的修復周期。

2.2 不同菌劑處理下微生物群落結構比較分析

2.2.1 不同菌劑對微生物多樣性的影響

系統(tǒng)中微生物的多樣性及生物量與系統(tǒng)的凈化效率、穩(wěn)定性等相關，本實驗測定了各實驗組樣品的Alpha 多樣性，結果見表2。由表2中 Coverage指數可知，3個樣品的覆蓋率基本無差異，覆蓋率均超過99%，說明本次測序深度足夠反映樣品中細菌的真實情況。由Chao1指數和Ace指數可知，細菌群落豐富度表現為工程菌劑B>空白>土著菌劑A。由Shannon指數和Simpson指數可知，細菌群落多樣性表現為工程菌劑B>空白>土著菌劑A。

表2 細菌Alpha多樣性指數Table 2 Bacterial Alpha diversity index

土著菌劑A的細菌群落多樣性最低，但其對污染物去除率卻最高，說明不是所有微生物具有污染物去除作用，土著菌劑A處理可能使具有污染物降解特性的優(yōu)勢功能微生物菌群發(fā)生群聚，強化功能微生物對污染物的降解，從而使土著菌劑A對黑臭水體凈化效果較佳。

工程菌劑B中細菌群落多樣性及豐富度最高，與空白有一些差異但差異較小，提示工程菌劑B可能引入了少量新的微生物，由于工程菌劑B中的微生物對目標黑臭水體的適應性較差而未能在實驗期內大量增長，也就未能發(fā)揮較強的凈化作用，所以其凈化效率不如土著菌劑A。

由表3中Coverage指數可知，3個實驗組樣品的覆蓋率差異不大，覆蓋率均在97%以上，說明本次測序深度足夠反映樣品中真菌的真實情況。由Chao1指數和Ace指數可知，真菌群落豐富度表現為空白>工程菌劑B>土著菌劑A。由Shannon指數和Simpson指數可知，土著菌劑A與工程菌劑B的真菌群落多樣性相似且高于空白。這說明兩種菌劑處理下真菌群落多樣性均有一定提高。土著菌劑A對黑臭水體的凈化效率顯著高于工程菌劑B，這說明后者的真菌微生物由于對目標黑臭水體的適應性較差未發(fā)生較強的凈化作用。

表3 真菌Alpha多樣性指數Table 3 Fungus Alpha diversity index

綜上所述，土著菌劑A可使具有污染物降解特性的優(yōu)勢功能微生物群落發(fā)生群聚，強化功能微生物對污染物的降解作用；工程菌劑B可使細菌群落多樣性及豐富度提高，但由于對目標黑臭水體的適應性較差而細菌未能大量增長。土著菌劑A、工程菌劑B均可使真菌多樣性提高，但前者由于對目標黑臭水體具有較強的適應性而有較高的凈化效率。

2.2.2 不同菌劑對微生物群落結構的影響

為進一步理解各實驗組對黑臭水體凈化效果產生差異的原因，從門水平及屬水平分析各實驗組的微生物群落結構。

細菌在門水平上的相對豐度見圖3(a)。工程菌劑B中優(yōu)勢物種為變形菌門(62.66%)、厚壁菌門(16.24%)、放線菌門(10.29%)、擬桿菌門(6.29%)；土著菌劑A中優(yōu)勢物種為變形菌門(68.94%)、厚壁菌門(14.56%)、擬桿菌門(7.58%)、放線菌門(7.09%)；這些微生物已被認定為污水處理系統(tǒng)中常見的優(yōu)勢物種[11-13]，在污水處理中發(fā)揮著重要作用。與工程菌劑B相比，土著菌劑A中的變形菌門、擬桿菌門相對豐度均有所提高。變形菌門具有脫氮除磷降解有機物的能力[14]；擬桿菌門在產酸階段起重要作用，其所含的某些菌屬具備降解碳水化合物、COD的能力[15]。這可能是土著菌劑A凈化效果較好的原因之一。

真菌在門水平上的相對豐度見圖3(b)。工程菌劑B中優(yōu)勢物種為子囊菌門(68.83%)、擔子菌門(22.43%)、羅茲菌門(4.47%)、被孢霉菌門(4.22%)；土著菌劑A中優(yōu)勢物種為子囊菌門(66.90%)、擔子菌門(27.03%)、羅茲菌門(3.40%)、毛霉菌門(2.16%)；這些微生物已被認定為污水處理中主要的真菌[16-17]。工程菌劑B與土著菌劑A中子囊菌門相對豐度均在66%以上。資料顯示，子囊菌門是真菌中最大的類群，其對纖維素及木質素具有降解能力[18]；與工程菌劑B相比，土著菌劑A中擔子菌門相對豐度提高，其對復雜的碳水化合物的降解起著重要作用，可以通過酶促反應來降解木質素[19-20]；毛霉菌門為土著菌劑A獨有的優(yōu)勢物種，相對豐度達到2.16%，其具有較強的蛋白質降解能力。這也可能是土著菌劑A對黑臭水體凈化效果較佳的原因。

圖3 門水平的優(yōu)勢物種相對豐度Fig.3 Relative abundance of dominant microorganism in phylum level

細菌在屬水平上的相對豐度排名前20的物種見表4。工程菌劑B中優(yōu)勢菌屬為熱單胞菌、短波單胞菌、苯基桿菌、寡養(yǎng)單胞菌、梭菌屬、Chryseomicrobium、unclassifiedRhodobacteraceae、氨基桿菌、白色桿菌、擬桿菌屬等；土著菌劑A中優(yōu)勢菌屬為寡養(yǎng)單胞菌、短波單胞菌、微小桿菌、谷氨酸桿菌、明串珠菌、unclassifiedRhodobacteraceae等。與工程菌劑B相比，土著菌劑A中寡養(yǎng)單胞菌相對豐度高出28.01百分點。資料顯示，寡養(yǎng)單胞菌為好氧菌，屬于變形菌門，可用于廢水處理及水體修復。呂志堂等[21]研究發(fā)現寡養(yǎng)單胞菌具有較高的脫氮除磷效率。胡起靖等[22]從福州某印染廠污水處理池的活性污泥中篩選分離得到寡養(yǎng)單胞菌，其具有較強脫色能力，脫色效率最高可達95.70%；此外，短波單胞菌、微小桿菌、谷氨酸桿菌、明串珠菌在土著菌劑A中的相對豐度也明顯高于工程菌劑B。文獻顯示，短波單胞菌具備降解二甲雙胍和吸附鎘的能力；微小桿菌為兼性厭氧菌[23]，能在NaCl為0～12%(質量分數)的條件下生長，具有耐鹽性[24]，在高鹽度皮革廢水中，對COD的去除率高達90.00%[25]；谷氨酸桿菌對鄰苯二甲酸二丁酯的11 h降解率高達99.90%[26]；明串珠菌具備拮抗致病菌、高產酸及抗氧化能力。這些也是土著菌劑A對黑臭水體凈化效果較好的原因。

表4 屬水平的細菌相對豐度Table 4 Relative abundance of bacteria in genus level %

真菌在屬水平上的相對豐度排名前20的物種見表5。工程菌劑B中優(yōu)勢菌屬為Apiotrichum、unclassifiedAscomycota、曲霉菌、青霉菌、Wallemia、Arthrographis、unclassifiedMortierellales、支頂孢屬、unclassifiedRozellomycota、unclassifiedSordariomycetes、念珠菌等；土著菌劑A中優(yōu)勢菌屬為Apiotrichum、Wallemia、unclassifiedAscomycota、曲霉菌、青霉菌、念珠菌、unclassifiedSordariomycetes、unclassifiedPleosporales、Talaromyces、Acaulium等。與工程菌劑B相比，土著菌劑A中Apiotrichum、Wallemia、曲霉菌、念珠菌、unclassifiedSordariomycetes、Talaromyces、unclassifiedPleosporales相對豐度較高。Apiotrichum、unclassifiedPleosporales在污水處理中的作用機制尚未有資料報道，因此其作用機制需進一步研究。據文獻報道，Wallemia是污水中常見的真菌[27]，具有耐鹽性；曲霉菌具備降解芳香族化合物、殺蟲劑、除草劑阿特拉津及COD的能力[28]；念珠菌具備降解有機物及降低橄欖油廠廢水毒性的能力[29]，在最適生長條件下，其對COD去除率可達84.10%[30]；Sordariomycetes可將 NO2還原為 N2O，促進了氮的去除[31]；Talaromyces對污水具有較好的凈化作用，如FANG等[32]采用Talaromyces處理養(yǎng)豬廢水時，COD、TP、氨氮去除率分別可達52.1%、21.5%、18.6%。這些也可能是土著菌劑A對黑臭水體污染物凈化效果較佳的原因。

表5 屬水平的真菌相對豐度Table 5 Relative abundance of fungus in genus level %

目前對于污水處理過程中真菌作用的機制研究尚少，很多真菌的具體功能尚不清楚[33]。然而，大量研究表明，真菌在污水處理中表現出極大的多樣性，起著重要作用[34]。真菌在去除有毒化合物、提高脂質積累、改善生物轉化[35-36]等方面具有重要作用，且其對重金屬的抗性作用強于細菌[37]。因此對于污水處理過程中真菌的作用機制的研究具有重要意義，未來應擴大并深入開展真菌相關的研究。

3 結 論

(1) 對目標黑臭水體中氨氮、TP、COD的去除效果土著菌劑A優(yōu)于工程菌劑B。

(2) 土著菌劑A可使具有污染物降解特性的功能微生物菌群發(fā)生群聚，強化功能微生物對污染物的降解；工程菌劑B可使細菌群落多樣性及豐富度提高，但由于其對目標黑臭水體的適應性較差而凈化作用較弱。

(3) 不同菌劑處理下，微生物群落結構具有顯著差異。共有的優(yōu)勢物種相對豐度存在明顯差異；細菌和真菌優(yōu)勢菌屬及其相對豐度也不同。