亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        Wnt7a在兔腓腸肌急性鈍挫傷后修復(fù)過(guò)程中的作用

        2021-04-06 12:08:50李嫚嫚馬惠昇穆靜

        李嫚嫚 馬惠昇,2 穆靜

        骨骼肌是人體最大的組織,直接參與人體的各項(xiàng)生命活動(dòng)。而骨骼肌損傷在日常生活中也尤為常見(jiàn),其中90%的骨骼肌損傷是骨骼肌鈍挫傷,是由鈍器擊打或碰撞引起皮內(nèi)或皮下以及軟組織局部水腫、出血、肌纖維斷裂、溶解等為主要改變的閉合性損傷[1,2]。骨骼肌損傷后的修復(fù)質(zhì)量是由肌纖維再生和結(jié)締組織重塑的協(xié)調(diào)性決定的,瘢痕組織過(guò)度增生則會(huì)影響整個(gè)骨骼肌的收縮功能[3,4]。本研究通過(guò)建立日本大耳兔骨骼肌急性鈍挫傷模型,觀察損傷后不同時(shí)間點(diǎn)的腓腸肌組織形態(tài),初步分析以Wnt7a 為代表的非經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路表達(dá)水平的變化與骨骼肌鈍挫傷后修復(fù)的關(guān)系。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇6月齡日本大耳兔40 只, 體重1.75~2.20kg,雌雄各半,由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房,常規(guī)飼養(yǎng)。

        1.2 主要試劑和儀器主要試劑:4%多聚甲醛(上海尚寶生物科技公司);蘇木精-伊紅(HE)染液、Trizol、DEPC 水(北京索萊寶科技有限公司);異丙醇(天津市永大化學(xué)試劑有限公司);HiFiScript 快速去除基因組cDNA 第一條鏈合成試劑盒[康為世紀(jì)(Cat.NO.CW2582M)];UltraSYBR Mixture 熒光定量試劑盒[康為世紀(jì)(Cat.NO.CW0957H)]。

        主要儀器:臺(tái)式高壓蒸汽滅菌鍋、生物顯微鏡、圖像采集系統(tǒng)(Olympus)、低溫離心機(jī)、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(BioTek)、渦旋振蕩儀(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司)、熒光定量PCR 儀(Applied Biosystems)、生物分光光度計(jì)(Eppendorf)。

        1.3 骨骼肌急性鈍挫傷模型建立自制軟組織鈍挫傷重力砸傷器,砝碼(直徑7.0cm,長(zhǎng)10cm,質(zhì)量3kg),固定導(dǎo)管(直徑8.0cm,高50cm)。從50cm 處落下,重力29.4N,產(chǎn)生重力勢(shì)能14.7J。造模前用剃毛器將實(shí)驗(yàn)兔右腿內(nèi)側(cè)皮膚被毛剔除。水合氯醛麻醉后,將實(shí)驗(yàn)兔右后肢置于伸膝、踝背屈90°位置,打擊部位為右小腿內(nèi)側(cè)面(其皮下為腓腸肌中段,中心點(diǎn)在跟骨上約7cm 處),將導(dǎo)管垂直置于實(shí)驗(yàn)兔距腓腸肌受打擊中心表面50cm 高度,砝碼在導(dǎo)管上端,沿導(dǎo)管內(nèi)自由落體下落致一次性打擊傷并標(biāo)記。造模后通過(guò)大體觀察、觸診及病理學(xué)檢測(cè),腓腸肌有一定收縮功能障礙且無(wú)骨折,屬急性腓腸肌鈍挫傷模型。砸傷器由同一人操作,以保證打擊力度、損傷部位及程度的一致性。

        1.4 分組及取材40 只日本大耳兔適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周后,隨機(jī)選取5 只作為對(duì)照組,其余35 只制備腓腸肌急性鈍挫傷模型,然后隨機(jī)分為7 組(n=5),各組分別在造模后1d、2d、3d、4d、5d、7d、14d 取材。取材前,耳緣靜脈注射水合氯醛麻醉,解剖并分離左側(cè)腓腸肌,迅速將離體的腓腸肌放在干凈的濾紙上均分為2 份,一份置4%多聚甲醛中固定,以備石蠟包埋HE 染色;另一份置-80℃冰箱保存,以備RTPCR 檢測(cè)。

        1.5 腓腸肌組織HE 染色及病理學(xué)評(píng)價(jià)HE 染色光鏡觀察損傷骨骼肌形態(tài)學(xué)變化:將腓腸肌組織切成1cm×1cm×0.5cm 大小,用預(yù)冷的生理鹽水沖洗后放入標(biāo)記好的包埋盒中,骨骼肌經(jīng)4%多聚甲醛固定24h 后,石蠟包埋,于腓腸肌肌腹中段處橫切5μm 厚的連續(xù)薄片,切片脫蠟復(fù)水,蘇木精染色,1%鹽酸-酒精分化,伊紅染色,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片。

        1.6 RT-PCR 檢測(cè)Wnt7a mRNA 表達(dá)水平從-80℃冰箱取出各組家兔腓腸肌組織約30mg,研磨后加入1ml Trizol 離心管中,充分振蕩混勻,靜置5~10min;加入0.2ml 氯仿混勻15~30s,然后靜置3min;用高速離心機(jī)(4℃,12 000rpm 15min);取水相到新的EP 管中,加入0.5ml 異丙醇,混勻,冰浴10min;離心(4℃,12 000rpm 10min);傾倒上層液體,用75%冰乙醇沉淀(1ml),混勻;再次離心處理(4℃,12 000rpm 5min)并干燥。加入DEPC 處理水溶解RNA,測(cè)濃度,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄體系調(diào)整RNA 濃度并計(jì)算逆轉(zhuǎn)錄所需上樣量,而后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取1μlcDNA,0.6μl 上、下游引物以及10μl Mix 反應(yīng)液,并補(bǔ)水至25μl,構(gòu)建 RNA 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系,行定量PCR 擴(kuò)增,擴(kuò)增條件: 95℃ 15min(預(yù)變性)、95℃ 10s(變性)、58℃ 30s(退火)、72℃ 30s(延伸)、72℃ 5min(再延伸)共 40 個(gè)循環(huán)。分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增,同時(shí)在60℃~95℃進(jìn)行溶解曲線分析。

        1.7 引物設(shè)計(jì)與合成檢索根據(jù)NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中Wnt7a 全長(zhǎng)基因序列,應(yīng)用Primer premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)出Wnt7a 基因引物,上游引物 P1:5'-GCCAAGGTCTTTGTGGATG-3';下游引物 P2:5'-AG CAGGTCTTAGTGGTGCA-3'。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度157bp,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

        1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,以LSD 法進(jìn)行組間兩兩比較。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 骨骼肌急性鈍挫傷后腓腸肌組織變化情況對(duì)照組腓腸肌肌纖維呈鈍角多邊形,形狀規(guī)則且排列整齊,肌纖維間隙大小一致,肌絲排列整齊,胞核呈圓形或卵圓形,位于肌纖維的周邊。與對(duì)照組腓腸肌組織相比,鈍挫傷后1d 組可觀察到肌外膜完整性被破壞、損傷肌細(xì)胞變圓肥大,細(xì)胞間質(zhì)中存在大量的紅細(xì)胞和少量的炎性細(xì)胞,部分肌纖維斷裂;鈍挫傷后2d、3d 組有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肌細(xì)胞仍然腫脹明顯,并可見(jiàn)空泡組織;鈍挫傷后4d 組紅細(xì)胞較前3d 減少、炎性細(xì)胞減少、巨噬細(xì)胞增多、肌纖維壞死;鈍挫傷后5d 組成纖維細(xì)胞增多、細(xì)胞排列紊亂;鈍挫傷后7d 組肌細(xì)胞腫脹減輕,鈍挫傷區(qū)內(nèi)可見(jiàn)部分新生肌細(xì)胞以及成纖維樣細(xì)胞,細(xì)胞排列紊亂,可見(jiàn)明顯的結(jié)締組織填充,炎細(xì)胞浸潤(rùn)減輕;鈍挫傷后14d 組可見(jiàn)肌絲扭曲,肌纖維明顯恢復(fù),纖維化增加,損傷部位初步愈合。見(jiàn)圖1。

        2.2 急性鈍挫傷后骨骼肌Wnt7a mRNA 表達(dá)變化RT-PCR 結(jié)果顯示,家兔骨骼肌鈍挫傷在自然恢復(fù)過(guò)程中,Wnt7a mRNA 表達(dá)水平呈逐漸升高的趨勢(shì)。對(duì)照組的平均Cq 值為1.01±0.02,鈍挫傷后1d、2d、3d、4d、5d、7d 與14d 組的平均Cq 值分別為1.69±0.17、2.05±0.21、3.83±0.89、6.27±0.99、7.56±1.14、13.55±0.85 與8.22±0.29。與 對(duì)照組相比,鈍挫傷后1d 和2d 組的平均Cq 值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),鈍挫傷后3d、4d、5d、7d、14d 組的Cq 值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。并且在骨骼肌鈍挫傷后Wnt7a mRNA 表達(dá)水平逐漸升高,在第7 天表達(dá)最高,隨后開(kāi)始下降,鈍挫傷后14d 組明顯低于鈍挫傷后7d 組(P<0.05)。

        圖1 腓腸肌急性鈍挫傷后組織形態(tài)學(xué)變化(HE 染色,×200)

        3 討論

        傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為經(jīng)筋具有約束骨骼主持運(yùn)動(dòng)的功能,《黃帝內(nèi)經(jīng)·痿論》:“陽(yáng)明者,五臟六腑之海,主潤(rùn)宗筋,宗筋主束骨而利關(guān)節(jié)也。”說(shuō)明經(jīng)筋是運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的重要組成部分,并對(duì)周圍組織結(jié)構(gòu)起著保護(hù)作用。

        現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨骼肌鈍挫傷主要表現(xiàn)為肌纖維的斷裂和肌細(xì)胞的溶解,目前研究認(rèn)為骨骼肌損傷后的修復(fù)有三個(gè)過(guò)程[5,6]:第一個(gè)階段為損傷變性期,在骨骼肌損傷后1~3d 出現(xiàn),當(dāng)某些外力因素破壞肌肉的超微結(jié)構(gòu)和周圍血管時(shí),導(dǎo)致肌肉內(nèi)血腫形成,損傷處的肌組織壞死退化,中性粒細(xì)胞開(kāi)始浸潤(rùn)。第二個(gè)階段為修復(fù)期,一般出現(xiàn)在骨骼肌損傷后的5~10d,巨噬細(xì)胞吞噬壞死的肌組織,損傷肌肉周圍的纖維基膜和漿膜間的肌衛(wèi)星細(xì)胞激活、增殖與分化,融合形成新的肌管細(xì)胞,伴有毛細(xì)血管增生。第三個(gè)階段為肌肉塑形期,瘢痕組織的形成一般在骨骼肌損傷后2~3 周內(nèi)發(fā)生,再生肌纖維分化成熟,受損的骨骼肌功能恢復(fù)。

        Wnt7a 在骨骼肌損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。Wnt7a 可通過(guò)多條非經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路,促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和遷移,加速骨骼肌損傷修復(fù)過(guò)程[7]。以Wnt7a 為代表的非經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路的激活,可有效促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞擴(kuò)增、遷移, 促進(jìn)骨骼肌損傷修復(fù)。Wnt7a 對(duì)損傷骨骼肌再生的調(diào)控機(jī)制是通過(guò)Wnt7a 與骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中的受體FZD7 結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞極化,并選擇性增加對(duì)稱干細(xì)胞擴(kuò)增,促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的大量增殖[8]。Xu 等[9]通過(guò)對(duì)肌肉損傷后的大鼠給予rh-Wnt7a,表明rh-Wnt7a 的直接作用是促進(jìn)骨骼肌中的肌纖維增生。骨骼肌再生期間Wnt7a 過(guò)表達(dá)可顯著促進(jìn)損傷骨骼肌再生,增加了肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量;骨骼肌中Wnt7a 缺失時(shí)則表現(xiàn)為損傷骨骼肌中肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量顯著降低;這表明Wnt7a 可作為刺激肌肉修復(fù)的有效促肌原性因子[10,11]。本實(shí)驗(yàn)顯示家兔腓腸肌急性鈍挫傷后1d、2d 組的Wnt7a mRNA 表達(dá)水平無(wú)明顯變化,第3 天后Wnt7a mRNA 表達(dá)顯著性升高,并在第7 天時(shí)表達(dá)最高,隨后開(kāi)始下降。HE 染色顯示新生肌管和成纖維細(xì)胞在鈍挫傷后5~7d 開(kāi)始顯著增多,而Wnt7a 也在第7天時(shí)達(dá)到最高水平,Wnt7a 表達(dá)上調(diào)與肌細(xì)胞再生的病理過(guò)程在時(shí)間上有一致性,因此推斷這是因?yàn)楣趋兰〗M織在損傷狀態(tài)下,Wnt7a 參與肌衛(wèi)星細(xì)胞擴(kuò)增、遷移的結(jié)果。有研究發(fā)現(xiàn)短時(shí)間的Wnt7a 治療顯著刺激了組織的散布和植入,從而顯著改善了肌肉功能[12]。用Wnt7a 治療肌肉損傷可通過(guò)增加衛(wèi)星干細(xì)胞的數(shù)量以及最終增加整體衛(wèi)星細(xì)胞池來(lái)加速肌肉修復(fù)。

        綜上所述,Wnt7a 可能參與骨骼肌損傷的早期修復(fù)過(guò)程,推測(cè)損傷修復(fù)的速度很可能與Wnt7a 的表達(dá)水平密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)只涉及了早期階段,不能對(duì)骨骼肌鈍挫傷修復(fù)全過(guò)程做出定論,Wnt7a 在骨骼肌鈍挫傷后修復(fù)后期階段的確切作用還有待進(jìn)一步研究。

        成年人视频在线播放麻豆| 精品国产爱在线观看| 欧洲无码一级毛片无遮挡| 久久少妇高潮免费观看| 日韩一区av二区三区| 国产麻豆极品高清另类| 蜜桃视频一区二区三区四| 色综合天天综合网国产成人网| 婷婷久久香蕉五月综合加勒比| 男女一边摸一边做爽爽的免费阅读| 99这里只有精品| 国产一区二区丰满熟女人妻| 蜜桃av区一区二区三| 亚洲成人一区二区av| 中文字幕av久久亚洲精品| 亚洲av无码av在线播放| 人妻系列无码专区久久五月天| 日本免费人成视频播放| 99在线无码精品秘 人口| 视频国产自拍在线观看| 国产精品妇女一二三区| 84pao强力打造免费视频34| 精品久久久久久电影院| 人妻少妇粉嫩av专区一| 国产av无码专区亚洲av男同| 337人体做爰大胆视频| 在线观看亚洲AV日韩A∨| 亚洲av成人一区二区三区色| 国产精品高湖呻呤久久av| 日本精品视频二区三区| 国产精品免费_区二区三区观看 | 最近中文字幕视频完整版在线看| 亚洲天堂在线视频播放| 国产精品毛片99久久久久| 隔壁人妻欲求不满中文字幕| 国产av在线观看久久| 国产自偷自偷免费一区| 国内无遮码无码| av免费观看在线网站| 开心五月婷婷激情综合网| 国产女人高潮视频在线观看|