李嫚嫚 馬惠昇，2 穆靜

骨骼肌是人體最大的組織，直接參與人體的各項(xiàng)生命活動(dòng)。而骨骼肌損傷在日常生活中也尤為常見(jiàn)，其中90%的骨骼肌損傷是骨骼肌鈍挫傷，是由鈍器擊打或碰撞引起皮內(nèi)或皮下以及軟組織局部水腫、出血、肌纖維斷裂、溶解等為主要改變的閉合性損傷[1，2]。骨骼肌損傷后的修復(fù)質(zhì)量是由肌纖維再生和結(jié)締組織重塑的協(xié)調(diào)性決定的，瘢痕組織過(guò)度增生則會(huì)影響整個(gè)骨骼肌的收縮功能[3，4]。本研究通過(guò)建立日本大耳兔骨骼肌急性鈍挫傷模型，觀察損傷后不同時(shí)間點(diǎn)的腓腸肌組織形態(tài)，初步分析以Wnt7a 為代表的非經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路表達(dá)水平的變化與骨骼肌鈍挫傷后修復(fù)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇6月齡日本大耳兔40 只, 體重1.75～2.20kg，雌雄各半，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器主要試劑：4%多聚甲醛（上海尚寶生物科技公司）；蘇木精-伊紅（HE）染液、Trizol、DEPC 水（北京索萊寶科技有限公司）；異丙醇(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；HiFiScript 快速去除基因組cDNA 第一條鏈合成試劑盒[康為世紀(jì)（Cat.NO.CW2582M）]；UltraSYBR Mixture 熒光定量試劑盒[康為世紀(jì)（Cat.NO.CW0957H）]。

主要儀器：臺(tái)式高壓蒸汽滅菌鍋、生物顯微鏡、圖像采集系統(tǒng)（Olympus）、低溫離心機(jī)、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（BioTek）、渦旋振蕩儀（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司）、熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems）、生物分光光度計(jì)（Eppendorf）。

1.3 骨骼肌急性鈍挫傷模型建立自制軟組織鈍挫傷重力砸傷器，砝碼（直徑7.0cm,長(zhǎng)10cm，質(zhì)量3kg），固定導(dǎo)管（直徑8.0cm，高50cm）。從50cm 處落下，重力29.4N，產(chǎn)生重力勢(shì)能14.7J。造模前用剃毛器將實(shí)驗(yàn)兔右腿內(nèi)側(cè)皮膚被毛剔除。水合氯醛麻醉后，將實(shí)驗(yàn)兔右后肢置于伸膝、踝背屈90°位置，打擊部位為右小腿內(nèi)側(cè)面（其皮下為腓腸肌中段，中心點(diǎn)在跟骨上約7cm 處），將導(dǎo)管垂直置于實(shí)驗(yàn)兔距腓腸肌受打擊中心表面50cm 高度，砝碼在導(dǎo)管上端，沿導(dǎo)管內(nèi)自由落體下落致一次性打擊傷并標(biāo)記。造模后通過(guò)大體觀察、觸診及病理學(xué)檢測(cè)，腓腸肌有一定收縮功能障礙且無(wú)骨折，屬急性腓腸肌鈍挫傷模型。砸傷器由同一人操作，以保證打擊力度、損傷部位及程度的一致性。

1.4 分組及取材40 只日本大耳兔適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周后，隨機(jī)選取5 只作為對(duì)照組，其余35 只制備腓腸肌急性鈍挫傷模型，然后隨機(jī)分為7 組(n=5)，各組分別在造模后1d、2d、3d、4d、5d、7d、14d 取材。取材前，耳緣靜脈注射水合氯醛麻醉，解剖并分離左側(cè)腓腸肌，迅速將離體的腓腸肌放在干凈的濾紙上均分為2 份，一份置4%多聚甲醛中固定，以備石蠟包埋HE 染色；另一份置-80℃冰箱保存，以備RTPCR 檢測(cè)。

1.5 腓腸肌組織HE 染色及病理學(xué)評(píng)價(jià)HE 染色光鏡觀察損傷骨骼肌形態(tài)學(xué)變化：將腓腸肌組織切成1cm×1cm×0.5cm 大小，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗后放入標(biāo)記好的包埋盒中，骨骼肌經(jīng)4%多聚甲醛固定24h 后，石蠟包埋，于腓腸肌肌腹中段處橫切5μm 厚的連續(xù)薄片，切片脫蠟復(fù)水，蘇木精染色，1%鹽酸-酒精分化，伊紅染色，梯度酒精脫水,二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.6 RT-PCR 檢測(cè)Wnt7a mRNA 表達(dá)水平從-80℃冰箱取出各組家兔腓腸肌組織約30mg，研磨后加入1ml Trizol 離心管中，充分振蕩混勻，靜置5～10min；加入0.2ml 氯仿混勻15～30s，然后靜置3min；用高速離心機(jī)（4℃，12 000rpm 15min）；取水相到新的EP 管中，加入0.5ml 異丙醇，混勻，冰浴10min；離心（4℃，12 000rpm 10min）；傾倒上層液體，用75%冰乙醇沉淀（1ml），混勻；再次離心處理（4℃，12 000rpm 5min）并干燥。加入DEPC 處理水溶解RNA，測(cè)濃度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄體系調(diào)整RNA 濃度并計(jì)算逆轉(zhuǎn)錄所需上樣量，而后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取1μlcDNA，0.6μl 上、下游引物以及10μl Mix 反應(yīng)液，并補(bǔ)水至25μl，構(gòu)建 RNA 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，行定量PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件: 95℃ 15min（預(yù)變性）、95℃ 10s（變性）、58℃ 30s（退火）、72℃ 30s（延伸）、72℃ 5min（再延伸）共 40 個(gè)循環(huán)。分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)在60℃～95℃進(jìn)行溶解曲線分析。

1.7 引物設(shè)計(jì)與合成檢索根據(jù)NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中Wnt7a 全長(zhǎng)基因序列，應(yīng)用Primer premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)出Wnt7a 基因引物，上游引物 P1：5'-GCCAAGGTCTTTGTGGATG-3'；下游引物 P2：5'-AG CAGGTCTTAGTGGTGCA-3'。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度157bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以LSD 法進(jìn)行組間兩兩比較。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨骼肌急性鈍挫傷后腓腸肌組織變化情況對(duì)照組腓腸肌肌纖維呈鈍角多邊形，形狀規(guī)則且排列整齊，肌纖維間隙大小一致，肌絲排列整齊，胞核呈圓形或卵圓形，位于肌纖維的周邊。與對(duì)照組腓腸肌組織相比，鈍挫傷后1d 組可觀察到肌外膜完整性被破壞、損傷肌細(xì)胞變圓肥大，細(xì)胞間質(zhì)中存在大量的紅細(xì)胞和少量的炎性細(xì)胞，部分肌纖維斷裂；鈍挫傷后2d、3d 組有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肌細(xì)胞仍然腫脹明顯，并可見(jiàn)空泡組織；鈍挫傷后4d 組紅細(xì)胞較前3d 減少、炎性細(xì)胞減少、巨噬細(xì)胞增多、肌纖維壞死；鈍挫傷后5d 組成纖維細(xì)胞增多、細(xì)胞排列紊亂；鈍挫傷后7d 組肌細(xì)胞腫脹減輕，鈍挫傷區(qū)內(nèi)可見(jiàn)部分新生肌細(xì)胞以及成纖維樣細(xì)胞，細(xì)胞排列紊亂，可見(jiàn)明顯的結(jié)締組織填充，炎細(xì)胞浸潤(rùn)減輕；鈍挫傷后14d 組可見(jiàn)肌絲扭曲，肌纖維明顯恢復(fù)，纖維化增加，損傷部位初步愈合。見(jiàn)圖1。

2.2 急性鈍挫傷后骨骼肌Wnt7a mRNA 表達(dá)變化RT-PCR 結(jié)果顯示，家兔骨骼肌鈍挫傷在自然恢復(fù)過(guò)程中，Wnt7a mRNA 表達(dá)水平呈逐漸升高的趨勢(shì)。對(duì)照組的平均Cq 值為1.01±0.02，鈍挫傷后1d、2d、3d、4d、5d、7d 與14d 組的平均Cq 值分別為1.69±0.17、2.05±0.21、3.83±0.89、6.27±0.99、7.56±1.14、13.55±0.85 與8.22±0.29。與 對(duì)照組相比，鈍挫傷后1d 和2d 組的平均Cq 值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），鈍挫傷后3d、4d、5d、7d、14d 組的Cq 值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。并且在骨骼肌鈍挫傷后Wnt7a mRNA 表達(dá)水平逐漸升高，在第7 天表達(dá)最高，隨后開(kāi)始下降，鈍挫傷后14d 組明顯低于鈍挫傷后7d 組（P<0.05）。

圖1 腓腸肌急性鈍挫傷后組織形態(tài)學(xué)變化（HE 染色，×200）

3 討論

傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為經(jīng)筋具有約束骨骼主持運(yùn)動(dòng)的功能，《黃帝內(nèi)經(jīng)·痿論》：“陽(yáng)明者，五臟六腑之海，主潤(rùn)宗筋，宗筋主束骨而利關(guān)節(jié)也。”說(shuō)明經(jīng)筋是運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的重要組成部分，并對(duì)周圍組織結(jié)構(gòu)起著保護(hù)作用。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨骼肌鈍挫傷主要表現(xiàn)為肌纖維的斷裂和肌細(xì)胞的溶解，目前研究認(rèn)為骨骼肌損傷后的修復(fù)有三個(gè)過(guò)程[5，6]：第一個(gè)階段為損傷變性期，在骨骼肌損傷后1～3d 出現(xiàn)，當(dāng)某些外力因素破壞肌肉的超微結(jié)構(gòu)和周圍血管時(shí)，導(dǎo)致肌肉內(nèi)血腫形成，損傷處的肌組織壞死退化，中性粒細(xì)胞開(kāi)始浸潤(rùn)。第二個(gè)階段為修復(fù)期，一般出現(xiàn)在骨骼肌損傷后的5～10d，巨噬細(xì)胞吞噬壞死的肌組織，損傷肌肉周圍的纖維基膜和漿膜間的肌衛(wèi)星細(xì)胞激活、增殖與分化，融合形成新的肌管細(xì)胞，伴有毛細(xì)血管增生。第三個(gè)階段為肌肉塑形期，瘢痕組織的形成一般在骨骼肌損傷后2～3 周內(nèi)發(fā)生，再生肌纖維分化成熟，受損的骨骼肌功能恢復(fù)。

Wnt7a 在骨骼肌損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。Wnt7a 可通過(guò)多條非經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路，促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和遷移，加速骨骼肌損傷修復(fù)過(guò)程[7]。以Wnt7a 為代表的非經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路的激活，可有效促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞擴(kuò)增、遷移， 促進(jìn)骨骼肌損傷修復(fù)。Wnt7a 對(duì)損傷骨骼肌再生的調(diào)控機(jī)制是通過(guò)Wnt7a 與骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中的受體FZD7 結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞極化，并選擇性增加對(duì)稱干細(xì)胞擴(kuò)增，促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的大量增殖[8]。Xu 等[9]通過(guò)對(duì)肌肉損傷后的大鼠給予rh-Wnt7a，表明rh-Wnt7a 的直接作用是促進(jìn)骨骼肌中的肌纖維增生。骨骼肌再生期間Wnt7a 過(guò)表達(dá)可顯著促進(jìn)損傷骨骼肌再生，增加了肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量；骨骼肌中Wnt7a 缺失時(shí)則表現(xiàn)為損傷骨骼肌中肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量顯著降低；這表明Wnt7a 可作為刺激肌肉修復(fù)的有效促肌原性因子[10，11]。本實(shí)驗(yàn)顯示家兔腓腸肌急性鈍挫傷后1d、2d 組的Wnt7a mRNA 表達(dá)水平無(wú)明顯變化，第3 天后Wnt7a mRNA 表達(dá)顯著性升高，并在第7 天時(shí)表達(dá)最高，隨后開(kāi)始下降。HE 染色顯示新生肌管和成纖維細(xì)胞在鈍挫傷后5～7d 開(kāi)始顯著增多，而Wnt7a 也在第7天時(shí)達(dá)到最高水平，Wnt7a 表達(dá)上調(diào)與肌細(xì)胞再生的病理過(guò)程在時(shí)間上有一致性，因此推斷這是因?yàn)楣趋兰〗M織在損傷狀態(tài)下，Wnt7a 參與肌衛(wèi)星細(xì)胞擴(kuò)增、遷移的結(jié)果。有研究發(fā)現(xiàn)短時(shí)間的Wnt7a 治療顯著刺激了組織的散布和植入，從而顯著改善了肌肉功能[12]。用Wnt7a 治療肌肉損傷可通過(guò)增加衛(wèi)星干細(xì)胞的數(shù)量以及最終增加整體衛(wèi)星細(xì)胞池來(lái)加速肌肉修復(fù)。

綜上所述，Wnt7a 可能參與骨骼肌損傷的早期修復(fù)過(guò)程，推測(cè)損傷修復(fù)的速度很可能與Wnt7a 的表達(dá)水平密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)只涉及了早期階段，不能對(duì)骨骼肌鈍挫傷修復(fù)全過(guò)程做出定論，Wnt7a 在骨骼肌鈍挫傷后修復(fù)后期階段的確切作用還有待進(jìn)一步研究。