李 文, 何月秋, 王佳瑩, 王國良, 王志龍*,

(1. 寧波城市職業(yè)技術學院，浙江 寧波 315100；2. 寧波檢驗檢疫科學技術研究院，浙江 寧波 315012；3. 浙江萬里學院 生物與環(huán)境學院，浙江 寧波 315100)

百日草Zinnia elegans Jacq. 又名百日菊，是菊科百日菊屬的一年生草本花卉。原產墨西哥，有單瓣、重瓣、卷葉和各種不同花色[1]。百日草喜歡溫暖的環(huán)境，因為其開花時間長、花色鮮艷、花形優(yōu)美，在全世界廣泛種植，是園林綠化常用的觀賞花卉[2-3]。百日草上的病害較少，主要以細菌性葉斑病報道較多，該病發(fā)病率高，嚴重時可達90%，嚴重影響百日草的觀賞價值[4-6]。而對于百日草炭疽病，尚未見系統(tǒng)的病原菌鑒定及藥劑防治方面的研究。

2019 年5 月到6 月期間，在浙江省寧波市植物園的百日草種植園區(qū)發(fā)現(xiàn)了一種葉部病害，該病害在苗期和成株期均可發(fā)病，下部葉片先發(fā)病，逐漸擴散到上部葉片。葉片發(fā)病后會產生圓形、多角形或不規(guī)則形灰色或黑褐色病斑，多個病斑逐漸擴大，聯(lián)合形成大的枯死斑。調查顯示，類似的病害癥狀在寧波植物園、寧波市北侖區(qū)春曉社區(qū)、四明山國家森林公園和寧波市區(qū)種植百日草的路邊花壇均有發(fā)生，個別養(yǎng)護管理不到位的區(qū)塊，該病害的發(fā)病率高達80%。該病造成百日草葉片提早脫落，嚴重影響花朵的大小，縮短花期，降低百日草花海的觀賞價值。本研究按照柯赫氏法則對發(fā)病葉片進行病原物的分離、回接，以明確致病菌，然后結合形態(tài)學特征及分子生物學方法，對病原菌進行系統(tǒng)的鑒定。同時，采用菌絲生長率法，測定了9 種殺菌劑制劑對該病原菌的殺菌活性，旨在為百日草炭疽病的防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑及培養(yǎng)基

次氯酸鈉溶液，購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，用蒸餾水定容至1 000 mL。75%肟菌 · 戊唑醇水分散粒劑(WG，總有效成分含量75%，其中戊唑醇50%，肟菌酯25%)、35%氟菌 · 戊唑醇懸浮劑 (SC，總有效成分含量35%，其中戊唑醇17.5%，氟吡菌酰胺17.5%)、75%百菌清可濕性粉劑 (WP)、250 g/L嘧菌酯懸浮劑、50%咪鮮胺可濕性粉劑、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、10% 丙硫菌唑懸浮劑、500 g/L 氟啶胺懸浮劑和25%溴菌晴可濕性粉劑，分別購買于中國農科院植保所中保綠農集團及先正達 (蘇州) 作物保護有限公司。

1.2 試劑及儀器

DNA 提取試劑盒以及PCR 擴增試劑盒2 × Taq PCR Mix，購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司，其余試劑均為國產分析純。LEH-70F 恒溫培養(yǎng)箱，浙江華宏一家科技有限公司；S1000 PCR儀，美國Bio-Rad 公司；Leica DM3000 光學顯微鏡，徠卡顯微系統(tǒng) (上海) 貿易有限公司。

1.3 病原菌分離及形態(tài)學鑒定

百日草炭疽病病葉于2019 年5 月24 日到6 月10 日期間采集于寧波植物園、寧波市北侖區(qū)春曉社區(qū)和四明山國家森林公園。每個采集地選取10 株發(fā)病植物，每株選取一個發(fā)病早期、具有典型癥狀的葉片。剪取病、健交界部分的組織，先用75%的酒精消毒30 s，用無菌水沖洗3 次；再將葉片浸泡在質量分數(shù)為10%的次氯酸鈉溶液中消毒2～3 min 后，用無菌水清洗3 次，置于無菌濾紙上吸干水分。轉移至PDA 平板上，置于25 ℃的光照培養(yǎng)箱內于12 h/12 h 的光暗周期培養(yǎng)2～3 d。挑取菌落邊緣的菌絲，接種至空白PDA 平板上，置于25 ℃的光照培養(yǎng)箱中于12 h/12 h 的光暗周期下進行純化培養(yǎng)。觀察并拍照記錄平板上菌落形態(tài)，通過Leica DM3000 光學顯微鏡觀察分生孢子及附著胞形態(tài)特征。每個菌株隨機觀察10 個視野，每個視野10～20 個分生孢子。測量分生孢子大小，并于斜面上保存分離得到的菌株。

1.4 病原菌致病性測定

參考Wang 等的方法[7]，從分離保存的菌株中隨機選擇3 個，于PDA 平板活化，25 ℃下黑暗培養(yǎng)7 d。收集分生孢子，用無菌水制成1 × 106個/mL的分生孢子懸浮液，噴灑在60 d 大小的健康百日草上，每個菌株處理10 株，然后置于25 ℃的光照培養(yǎng)箱內于12/12 的光暗周期下保濕培養(yǎng)，并于接種后7～15 d 記錄發(fā)病情況。以噴灑無菌水的處理作為對照，每個處理3 次重復。對接種后15 d發(fā)病的葉片進行再一次的病原菌分離。從形態(tài)學以及分子生物學兩方面，與之前接種的菌株進行比對。

1.5 病原菌分子生物學分析

從分離保存的菌株中隨機選擇3 個菌株 (F1、F3 和F5) 進行分子生物學鑒定。刮取在PDA 平板上生長了5 d 的菌絲，用真菌基因組DNA 提取試劑盒進行DNA 的提取，參考相關文獻中的基因[8-12]，合成肌動蛋白基因 (actin gene, ACT)、幾丁質合酶基因 (chitin synthase A gene, CHS)、磷酸甘油醛脫氫酶基因 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、核糖體內部轉錄間隔區(qū) (ribosomal internal transcribed spacer, ITS)、錳超氧化物歧化酶 (manganesesuperoxide dismutase, SOD2)、谷氨酰胺合酶 (glutamine synthatase-GS)、微管蛋白 (beta-tubulin-TUB2) 以及鈣調蛋白 (calmodulin, CaM) 8 個基因引物 (表1)，以提取的DNA 為模板，進行PCR 擴增。PCR 擴增體系 (50 μL) 及程序如下：DNA 2.5 μL、上下游引物各2.5 μL、2 × Taq PCR Master Mix 25 μL，用無菌水補足至50 μL。擴增程序如下：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

將PCR 產物送杭州擎科生物有限公司測序，測序結果上傳至GenBank，對應的序列號見表2。從GenBank 下載標準菌株對應的序列 (表2)，用MEGA7 進行8 個基因序列的聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析，用最大似然法 (Maximum Likelihood method, ML)以JTT 為模型構建進化樹，其中，該進化樹的步長設為1 000[13]。

表1 PCR 擴增引物Table1 PCR primers used in this study

1.6 殺菌活性測定

采用菌絲生長率法[14]測定殺菌劑制劑對百日草炭疽病菌的殺菌活性，參考鄧潔、楊曉琦等的方法選取9 種常見用于炭疽病防治的殺菌劑[15-16]，各殺菌劑制劑濃度見表3。以空白PDA 平板作為對照。從活化5 d 的菌落邊緣打孔，分別接種到含有不同濃度殺菌劑的PDA 平板中央，25 ℃的培養(yǎng)箱黑暗條件下培養(yǎng)5 d。然后用十字交叉法測量菌落的直徑，每個處理重復3 次。根據菌落直徑計算菌絲生長抑制率，用DPS 軟件計算出毒力回歸方程和有效抑制中濃度 (EC50)。

2 結果與分析

2.1 百日草炭疽病病原菌分離

百日草炭疽病于早春在百日草幼苗的葉片上開始發(fā)病，隨著植株的生長，逐漸由下部葉片向上蔓延。葉片發(fā)病后會產生圓形、多角形或不規(guī)則形灰色或黑褐色病斑，多個病斑逐漸擴大，聯(lián)合形成大的枯死斑 (圖1)。經柯赫氏法則分離得到15 株分離物，其菌落形態(tài)相同，分別編號為F1～F15。

2.2 百日草炭疽病分離物致病性檢測

隨機選擇3 株分離物，將其分生孢子懸浮液噴灑在健康的百日草植株上，接種10 d 后發(fā)現(xiàn)圓形、多角形病斑，15 d 后病斑擴大，內部灰色或黑褐色，對照無任何癥狀 (圖2a～2c)。對發(fā)病葉片再次進行病原物的分離、純化，得到了與接種菌株相同的真菌。結果表明分離獲得的分離物確實為百日草炭疽病的致病菌。

表2 本研究所用菌株信息Table2 Bacterial strains used in this study

表3 不同殺菌劑制劑在培養(yǎng)基中的濃度梯度Table3 Concentration of fungicide in the medium

2.3 百日草炭疽病菌形態(tài)學鑒定

分離得到的15 株炭疽病菌具有一致的形態(tài)特征，菌絲生長初期為白色，中央絨狀平鋪，后期在菌落中央形成橘紅色的分生孢子堆。分生孢子單胞、無隔膜，橢圓形或卵圓形，兩端鈍圓，大小為 (15.6～17.3) μm × (4.6～5.1) μm (n = 50) (圖3)，符合Colletotrichum 的特征[17]。

2.4 百日草炭疽病菌分子生物學鑒定

為了進一步明確分離物的種類，對分離的菌株進行分子生物學鑒定。選取菌株F3，以C.gloeosporioides 特異性鑒定通用的8 個序列 (ACT、CHS、GAPDH、ITS、SOD2、GS、CaM 和TUB2)通用引物進行PCR 擴增，獲得相應的目的片段。將8 個基因序列與C. gloeosporioides 家族中的其他23 個菌株的對應序列進行串聯(lián)，并在MEGA7.0版本中構建系統(tǒng)進化樹，結果表明，分離得到的菌株與C. siamense 聚在一起，同源性高達99%，屬于同一種真菌 (圖4)。結合分離物的形態(tài)學特征，明確該病原菌為暹羅刺盤孢菌Colletotrichum siamense。

2.5 9 種殺菌劑制劑對暹羅刺盤孢菌的殺菌活性測定

菌絲生長速率法測定結果 (表4) 表明，在9 種常用殺菌劑制劑中，500 g/L 氟啶胺懸浮劑和50%咪鮮胺可濕性粉劑對供試菌株菌絲生長的抑制作用最強，EC50值分別為0.002 9 和0.034 2 mg/L，而10% 丙硫菌唑懸浮劑抑制作用較弱。結果表明，500 g/L 氟啶胺懸浮劑和50%咪鮮胺可濕性粉劑可用于該病的化學防治。

表4 9 種殺菌劑制劑對暹羅刺盤孢菌的殺菌活性Table4 Antibiotic activities of 9 fungicides to C. siamense

3 小結與討論

百日草因其花色鮮艷、花期長，被廣泛栽培于城市綠地、公園[2-3]，但在浙江省寧波市多個百日草種植地已觀察到炭疽病的發(fā)生。本研究通過對百日草病葉系統(tǒng)性的觀察、病原菌的分離、致病性測定以及形態(tài)學分子生物學鑒定，證明引起百日草炭疽病的病原菌為暹羅刺盤孢菌Colletotrichum siamense。通過文獻查閱，由C. siamense 引起的炭疽病癥狀在多種植物上發(fā)現(xiàn)，包括香蕉和澳洲堅果，但尚未見該病原物在百日草上的報道[18-19]。

本研究調查表明，炭疽病在百日草葉片上的擴展，會嚴重影響百日草的正常生長，引起百日草葉片提早脫落，造成開花提早、花朵較小以及開花期縮短。炭疽病是植物上的一類重要真菌性病害，在多種園林植物以及作物上均有發(fā)生，對于炭疽病的防治，也有相關研究報道。劉霞等[20]研究結果顯示，咪鮮胺、戊唑醇和三唑酮對核桃炭疽病菌C. gloeosporioides 的防效比較好，其EC50值分別為0.07、1.45 和3.04 mg/L。胡曉穎等比較了5 種殺菌劑對桃炭疽病菌C. gloeosporioides的毒力，結果顯示，氟啶胺對桃樹炭疽病具有很好的防治效果[21]。也有報道顯示，咪鮮胺對柑橘葉片的炭疽病防治效果高達63% 以上，是防治該病的優(yōu)良藥劑[22]。咪鮮胺防治其他炭疽病，如草莓炭疽病的試驗結果顯示，草莓炭疽病菌C. fructicola 對咪鮮胺非常敏感，EC50值為0.039 6 mg/L[23]。本研究結果顯示，500 g/L 氟啶胺懸浮劑和50%咪鮮胺可濕性粉劑對百日草炭疽病菌的EC50值分別為0.002 91 和0.034 2 mg/L，具有較高的殺菌活性，而75%肟菌 · 戊唑醇水分散粒劑、35%氟菌 · 戊唑醇懸浮劑以及10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑對百日草炭疽病也有較好的防治效果。氟啶胺屬于吡啶胺類殺菌劑，無內吸和治療的作用，是一種保護性殺菌劑，可在百日草幼苗出土后噴灑，用作百日草幼苗炭疽病的預防。而咪鮮胺通過抑制麥角甾醇的生物合成，從而破壞病原菌細胞膜結構與功能，達到抑制菌絲的生長的效果，可以和氟啶胺交替使用，在百日草成株期進行病害的防治。75%肟菌 · 戊唑醇水分散粒劑、35%氟菌 · 戊唑醇懸浮劑和10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑的抑菌效果較好，75%肟菌 · 戊唑醇水分散粒劑和35%氟菌 · 戊唑醇懸浮劑均是混配劑，成本較高。苯醚甲環(huán)唑屬于三唑類殺菌劑，通過抑制麥角甾醇合成，來達到殺菌的效果。雖然另外一種殺菌劑丙硫菌唑也能夠抑制麥角甾醇的合成，但它對百日草炭疽病的防效較差，說明雖然殺菌的原理相同，但不同的農藥對百日草炭疽病的防效差異較大，需要通過科學的試驗，來指導生產實踐。嘧菌酯是一種線粒體呼吸抑制劑，其主要抑制真菌分生孢子萌發(fā)，而對真菌菌絲生長的抑制效果不佳。本研究結果顯示，質量濃度低至1 mg/L 的嘧菌酯懸浮劑即能夠強烈抑制百日草炭疽病菌分生孢子的形成，該藥劑是9 種農藥制劑中唯一抑制分生孢子形成的藥劑 (圖S1)，因此，250 g/L 嘧菌酯懸浮劑也可以用于百日草炭疽病的防治。生產上常用的殺菌劑75%百菌清可濕性粉劑、25%溴菌晴可濕性粉劑及10%丙硫菌唑懸浮劑對該菌無顯著抑制作用，不作為該病害的有效化學防治手段。本研究結果和其他報道的炭疽病防治藥劑相比，500 g/L 氟啶胺懸浮劑和50%咪鮮胺可濕性粉劑兩種藥劑有著更加優(yōu)良的防治效果，可以為田間防治百日草炭疽病提供參考。