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        探討PDCD4在稽留流產(chǎn)患者血清和絨毛與蛻膜組織中的表達及臨床意義

        2021-04-06 09:12:16鄭媛媛鄭素娟
        實驗與檢驗醫(yī)學(xué) 2021年6期
        關(guān)鍵詞:蛻膜雌二醇絨毛

        鄭媛媛,鄭素娟

        (1.登封市人民醫(yī)院產(chǎn)科;2.登封市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科 河南 登封 452470)

        稽留流產(chǎn)是自然流產(chǎn)的一種特殊形式,無需外界干預(yù),稽留流產(chǎn)中胚胎死亡而仍稽留于宮腔內(nèi),且孕產(chǎn)物一般多在癥狀產(chǎn)生后1~2個月內(nèi)排出[1]。稽留流產(chǎn)約占自然流產(chǎn)的15%到20%,且近年來呈上升趨勢[2]。有關(guān)稽留流產(chǎn)的機制到目前為止并不明確,與母體染色體異常、內(nèi)分泌失調(diào)、機體炎癥反應(yīng)和環(huán)境原因密切相關(guān)[3]。程序性細胞死亡因子4(programmed cell death 4,PDCD4)是在凋亡過程中被上調(diào)的基因,近年來研究發(fā)現(xiàn)PDCD4是腫瘤抑制基因,在多種腫瘤細胞(肝細胞癌、侵襲性乳腺癌、人膠質(zhì)瘤、和鼻咽癌等)的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用[4]。同時PDCD4還參與機體炎癥反應(yīng),microRNA-16(miR-16)靶向PDCD4可能通過動脈粥樣硬化中的有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核因子-kB(NF-kB)信號傳導(dǎo)抑制炎性巨噬細胞的活化[5]。PDCD4缺乏會加速脂多糖/D-半乳糖胺(LPS/D-GalN)誘導(dǎo)的急性肝損傷,結(jié)腸炎以及與結(jié)腸炎相關(guān)的結(jié)直腸癌,并明顯上調(diào)促炎性細胞因子(如IL-6)的表達,表明PDCD4作為抗炎因子的潛在作用[6-7]。目前,對稽留流產(chǎn)患者血清、絨毛與蛻膜組織中PDCD4水平的檢測報道很少,而本研究擬通過測定稽留流產(chǎn)患者血清、絨毛與蛻膜組織中PDCD4水平,并分析其與血清炎癥因子及激素水平的關(guān)系,這在國內(nèi)外比較少見,將為稽留流產(chǎn)發(fā)生機制的探討提供依據(jù)。

        1 對象與方法

        1.1 研究對象 選取2018年2月至2019年12月本院婦產(chǎn)科稽留流產(chǎn)患者40例為病例組,同期終止妊娠的健康早孕婦女40例為對照組。研究對象自愿提供血清及絨毛與蛻膜組織用于待測。本研究得到了本院倫理委員會的批準,并獲得患者知情同意書。病例納入標準:⑴符合稽留流產(chǎn)或早孕終止妊娠標準[8];⑵年齡>18歲。排除標準:⑴采用輔助生殖技術(shù)受孕者;⑵近3個月有手術(shù)者;⑶合并心臟病或高血壓者;⑷早產(chǎn)胎膜破裂者;⑸前置胎盤或產(chǎn)前出血婦女。

        1.2 方法

        1.2.1 血清、絨毛蛻膜組織PDCD4 mRNA表達水平測定 使用TRIzol試劑(上海圣貢生物技術(shù)有限公司)從組織,血清中提取總RNA。經(jīng)過濃縮,純度和完整性檢測后,將1μg經(jīng)DNase I處理的RNA與用于RT-qPCR試劑盒的Hieff First Strand cDNA Synthesis Super Mix(Yeasen Biotech,Shanghai)進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用Hieff qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒(Yeasen Biotech,上海)在ABI Prism 7300序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems,CA)上進行定量PCR分析。引物序列如下:PDCD4正向:5′-GCAAAGGGACGTCGGAGA-3′,反 向:5′-TCCAGGTTGTGCAGGTTGTT-3′,GAPDH蛋 白 正向:5′-CATTCCAAATATGAGATGCGTTGT-3′,反向:5′-TGTGGACTTGGGAGAGGACT-3′。根據(jù)檢測到的基因/樣品,將甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)蛋白用作內(nèi)源性對照。反應(yīng)條件如下:52℃3 min;94℃12 min,93℃30 s,60℃1 min(40個循環(huán))。反應(yīng)體系為:正向引物10μl、反向引物10μl、RNA模版0.6μl、超級酶混合物0.2μl、2×μByr。通過使用2-ΔΔCt方法計算相對表達水平。

        1.2.2 血清、絨毛蛻膜組織PDCD4蛋白表達水平測定 用裂解緩沖液提取血清、絨毛蛻膜組織中蛋白質(zhì),使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(均來自中國江蘇海門的Beyotime生物技術(shù)研究所)來測定蛋白質(zhì)濃度。采用免疫印跡分析(Western blot法)將蛋白裂解物在12%SDS-PAGE凝膠上分離,然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(Millipore,Billerica,MA,USA),再用5%的脫脂奶粉封閉該膜。接下來,將膜與兔抗PDCD4單 克 隆 抗 體(ab6721;Abcam,Cambridge,MA,USA)以及GAPDH(ProteinTech,Chicago,IL,USA)孵育過夜,再用Tween的Tris緩沖鹽水(TBST)洗滌四次,并與辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗培養(yǎng)2 h。采取增強的化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑(Pierce,Rockford,IL,美國)來顯示蛋白條帶。

        1.2.3 血清中TNF-α、雌二醇、孕酮水平測定TNF-α、雌二醇、孕酮采用ELISA法測定,試劑盒購于武漢華美生物科技有限公司 (批號:ZW54896.63、XW1258.63、BGA52478.63)。 按 照ELISA試劑盒說明書進行相應(yīng)檢測操作。

        1.3 統(tǒng)計分析 采用SPSS19.0對數(shù)據(jù)進行錄入、統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,采用t檢驗比較;采用Pearson相關(guān)性分析探討變量之間相關(guān)性,檢驗水準α為0.05。

        2 結(jié)果

        2.1 兩組一般情況比較 兩組年齡、BMI、妊娠周數(shù)、TG、HDL-C、LDL-C等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

        表1 兩組一般情況比較

        2.2 兩組血清、絨毛蛻膜組織PDCD4 mRNA和蛋白水平比較 病例組血清、絨毛蛻膜組織PDCD4 mRNA水平低于對照組,病例組血清、絨毛蛻膜組織PDCD4蛋白水平低于對照組,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖1。

        表2 兩組血清、絨毛蛻膜組織PDCD4 mRNA和蛋白水平表達

        圖1 各組血清、絨毛蛻膜組織PDCD4蛋白電泳圖

        2.3 兩組血清TNF-α、雌二醇、孕酮水平比較 表3所見,病例組血清TNF-α水平高于對照組,雌二醇、孕酮水平低于對照組(P<0.05)。見表3。

        表3 兩組血清TNF-α、雌二醇、孕酮水平比較

        2.4 各變量相關(guān)分析 血清、絨毛蛻膜組織PDCD4 mRNA和蛋白水平與血清TNF-α負相關(guān),與血清雌二醇、孕酮正相關(guān)(P<0.05)。見表4。

        表4 各變量的相關(guān)分析

        3 討論

        PDCD4最初是一個與凋亡相關(guān)的基因,后來被鑒定為抑癌基因。同時,它還參與了一些急性和慢性炎癥性疾病,例如動脈粥樣硬化、飲食引起的肥胖、LPS/D-GalN引起的急性肝損傷、結(jié)腸炎等[9]。絨毛被稱為母體子宮組織,它在保護胚胎免受母體免疫細胞攻擊中起著至關(guān)重要的作用,并為胎盤形成之前的胚胎發(fā)育提供營養(yǎng)支持。有研究報道,類維生素A-干擾素引起的絨毛組織發(fā)育不良與新生血管抑制導(dǎo)致的流產(chǎn)有關(guān),在流產(chǎn)的絨毛樣樣品中發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達下調(diào),提示VEGF可能在稽留流產(chǎn)中起重要作用[10-11]。PDCD4與VEGF具有類似的促進血管生成功能[12]。本研究中qRT-PCR和Western blot的結(jié)果顯示,病例組血清,絨毛蛻膜組織PDCD4 mRNA和蛋白水平低于對照組,這說明,低水平的PDCD4可能導(dǎo)致了絨毛蛻膜組織血管發(fā)育不良進而誘導(dǎo)稽留流產(chǎn)。

        本研究檢測了TNF-α的表達,結(jié)果顯示流產(chǎn)患者TNF-α水平較高,進一步采用Pearson相關(guān)分析血清、絨毛蛻膜組織PDCD4與TNF-α水平的相關(guān)性,提示PDCD4的表達與TNF-α之間正相關(guān);這也說明PDCD4在稽留流產(chǎn)炎癥反應(yīng)的機制還有待進一步研究。細胞因子在維持胎兒和母體免疫系統(tǒng)之間的體內(nèi)平衡方面起著重要作用,如果打破這種微妙的平衡,則免疫調(diào)節(jié)機制可能不足以恢復(fù)體內(nèi)穩(wěn)態(tài),并可能導(dǎo)致妊娠失敗[13-14]。既往研究表明PDCD4通過影響細胞因子(如TNFα、IL-12)的分泌而參與炎癥相關(guān)性疾病[15]。

        本研究檢測了母體中血清雌二醇和孕酮的水平,結(jié)果表明,病例組血清雌二醇、孕酮水平低于對照組,這些結(jié)果表明正常雌二醇和孕酮與健康懷孕的發(fā)展和保護有關(guān)。分析認為,成功懷孕期間,蛻膜化是一個關(guān)鍵過程(子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞分化為蛻膜基質(zhì)細胞),這種轉(zhuǎn)化受雌激素和孕激素等激素控制,并協(xié)調(diào)胚胎著床和胎盤的形成。這對于實現(xiàn)母體對同種異體胎兒的免疫耐受也起著決定性作用[16]。此外,采用Pearson相關(guān)性分析在稽留流產(chǎn)患者中,雌二醇水平低與調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)細胞水平下降和炎癥因子IL-4產(chǎn)生呈正相關(guān),這也再一次提示炎癥反應(yīng)在稽留流產(chǎn)中的重要作用。本研究也發(fā)現(xiàn),血清、絨毛蛻膜組織PDCD4 mRNA蛋白水平與血清雌二醇、孕酮正相關(guān)。體外細胞實驗黃體酮可以下調(diào)子宮內(nèi)膜癌細胞和原代子宮內(nèi)膜細胞中PDCD4的表達[17-18]。本研究中,與對照組相比,稽留流產(chǎn)患者血清中孕酮水平低,稽留流產(chǎn)蛻膜組織中PDCD4表達降低,這提示稽留流產(chǎn)患者中PDCD4的下調(diào)與低水平孕酮相關(guān),但其機制仍需進一步研究闡明。

        綜上所述,稽留流產(chǎn)患者血清、絨毛與蛻膜組織PDCD4表達水平降低;PDCD4與稽留流產(chǎn)患者炎癥反應(yīng)及激素水平紊亂有相關(guān)性,這可能是稽留流產(chǎn)的機制之一。

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