石 峰， 李 僉， 田 晶， 費(fèi) 旭， 劉 向 麗， 羅 健， 張 楠， 陳 高 俊

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034； 2.大連工業(yè)大學(xué) 分析中心, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

柚苷酶是一種重要的生物酶制劑[1]，由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶組成。柑橘類果汁加工過程中常用柚苷酶進(jìn)行酶法脫苦，從而改善飲品的風(fēng)味[2]。α-L-鼠李糖苷酶可將柚柑類果汁中的黃烷酮糖苷類化合物——柚皮苷(苦味較大)水解成鼠李糖和普魯寧(苦味較小)，普魯寧可在β-D-葡萄糖苷酶的繼續(xù)作用下生成柚皮素(無(wú)苦味)和葡萄糖，使果汁脫苦[3]。近年來(lái)，隨著研究的不斷深入，柚苷酶開始被廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥工業(yè)[4]。

研究表明，超聲刺激能夠有效提高相關(guān)酶的產(chǎn)量[5-6]。但目前應(yīng)用超聲刺激強(qiáng)化柚苷酶發(fā)酵酶活的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用超聲刺激對(duì)黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶過程進(jìn)行研究，并通過響應(yīng)曲面法對(duì)相關(guān)操作參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳工藝條件，為深入研究新型柚苷酶發(fā)酵策略，促進(jìn)生物食品酶及生物催化的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

黑曲霉FFCC uv-11，大連工業(yè)大學(xué)菌種保藏中心提供；柚皮苷，寶雞市方晟生物開發(fā)有限公司；脫脂豆粉，大連調(diào)味食品廠；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 培養(yǎng)條件

將低溫保存的黑曲霉菌種轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后，取孢子接種于種子培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h后接種到發(fā)酵培養(yǎng)基。改良后的發(fā)酵培養(yǎng)基組成(L)[7]：KH2PO4·2H2O 1.5 g，K2HPO4·12H2O 1.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，(NH4)2SO44.0 g，ZnSO4·7H2O 0.09 g，CaCl20.1 g，豆粉2.0 g，蛋白胨2.0 g，酵母浸粉1.0 g，柚皮苷6.0 g；pH 6.0。

1.3 酶活力測(cè)定方法

使用Davis法測(cè)定發(fā)酵培養(yǎng)基中柚苷酶活力[8-9]。柚苷酶活力定義：在pH 4.5、50 ℃條件下，1 min水解1 μg的柚皮苷所需的酶量為1個(gè)酶活性單位(U/mL)[7]。

1.4 超聲對(duì)黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶的工藝優(yōu)化

1.4.1 超聲工藝

使用超聲波清洗機(jī)(頻率固定為40 kHz)對(duì)發(fā)酵搖瓶進(jìn)行間歇性超聲處理，并通過冷卻水循環(huán)系統(tǒng)控制超聲水浴溫度為30 ℃。以未超聲處理的試驗(yàn)組為對(duì)照組，研究不同超聲參數(shù)對(duì)柚苷酶發(fā)酵酶活力的影響。

1.4.2 單因素試驗(yàn)

1.4.2.1 超聲時(shí)期的確定

分別在發(fā)酵18、24、30、36、42 h時(shí)進(jìn)行超聲，功率150 W，時(shí)長(zhǎng)5 min，每組試驗(yàn)3個(gè)平行，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定柚苷酶活力。

1.4.2.2 超聲功率的確定

在最佳超聲時(shí)期，分別在超聲功率125、150、175、200、225 W時(shí)進(jìn)行超聲，時(shí)長(zhǎng)5 min，每組試驗(yàn)3個(gè)平行，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定柚苷酶活力。

1.4.2.3 超聲時(shí)長(zhǎng)的確定

在其他最佳條件下，分別進(jìn)行3、5、10、15、20 min 超聲，每組試驗(yàn)3個(gè)平行，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定柚苷酶發(fā)酵酶活力。

1.4.2.4 超聲次數(shù)的確定

在其他最佳條件下，分別進(jìn)行1～4次超聲，每組試驗(yàn)3個(gè)平行，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定柚苷酶發(fā)酵酶活力。

1.4.2.5 超聲時(shí)間間隔的確定

在其他最佳條件下，分別間隔6、12、18、24 h進(jìn)行兩次超聲，每組試驗(yàn)3個(gè)平行，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定柚苷酶發(fā)酵酶活力。

1.4.3 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析法和Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以柚苷酶活力作為響應(yīng)值，以超聲時(shí)期(A)、超聲功率(B)、超聲時(shí)長(zhǎng)(C)、超聲次數(shù)(D)、超聲時(shí)間間隔(E)進(jìn)行五因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用響應(yīng)曲面法分析各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Code and true values of variables of the Box-Benhnken design models

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲時(shí)期對(duì)柚苷酶活的影響

如圖1所示，在黑曲霉發(fā)酵18 h進(jìn)行超聲，柚苷酶活最低，這可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵前期進(jìn)行超聲處理使微生物發(fā)酵的延滯期延長(zhǎng)，相對(duì)生長(zhǎng)速率降低，從而影響發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)生。發(fā)酵30 h進(jìn)行超聲時(shí)，發(fā)酵終點(diǎn)柚苷酶活達(dá)到最大，為918.3 U/mL。發(fā)酵時(shí)間持續(xù)延長(zhǎng)，柚苷酶活有所下降，因此確定最佳超聲時(shí)期為菌體發(fā)酵30 h。

圖1 超聲時(shí)期對(duì)柚苷酶活的影響Fig.1 Effect of ultrasonic stimulation stage on naringinase activity

2.1.2 超聲功率對(duì)柚苷酶活的影響

如圖2所示，隨著超聲功率的增大，柚苷酶活不斷增加，當(dāng)超聲功率為175 W時(shí)，柚苷酶活達(dá)到最大。而進(jìn)一步增大超聲功率，柚苷酶活快速降低，可能是因?yàn)槌暪β实脑黾邮沟每栈饔眉訌?qiáng)，較強(qiáng)的空化作用會(huì)對(duì)菌體造成損傷，導(dǎo)致菌體產(chǎn)酶能力降低[10]，這與張澤棟等[11]的研究結(jié)果相似，因此選取175 W為最佳超聲功率。

圖2 超聲功率對(duì)柚苷酶活的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on naringinase activity

2.1.3 超聲時(shí)長(zhǎng)對(duì)柚苷酶活的影響

如圖3所示，在超聲功率一定的情況下，隨著超聲時(shí)長(zhǎng)的增加，柚苷酶活不斷增加，當(dāng)超聲時(shí)長(zhǎng)為10 min時(shí)，柚苷酶活達(dá)到最大。當(dāng)超聲時(shí)長(zhǎng)繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)，柚苷酶活顯著降低，這可能是因?yàn)檫^度的超聲會(huì)造成細(xì)胞損傷[12]，導(dǎo)致產(chǎn)酶能力下降。因此選取10 min為最佳超聲時(shí)長(zhǎng)。

圖3 超聲時(shí)長(zhǎng)對(duì)柚苷酶活的影響Fig.3 Effect of the ultrasonic duration on naringinase activity

2.1.4 超聲次數(shù)對(duì)柚苷酶活的影響

如圖4所示，當(dāng)超聲次數(shù)為2時(shí)，柚苷酶活達(dá)到最高，繼續(xù)增加超聲次數(shù)，柚苷酶活降低。這可能是由于適當(dāng)?shù)某暷軌虼龠M(jìn)菌絲體的生長(zhǎng)和次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成，但多次刺激會(huì)對(duì)細(xì)胞膜造成損傷[13]，因此確定最佳超聲次數(shù)為2。

圖4 超聲次數(shù)對(duì)柚苷酶活的影響Fig.4 Effect of ultrasonic times on naringinase activity

2.1.5 超聲時(shí)間間隔對(duì)柚苷酶活的影響

如圖5所示，當(dāng)超聲時(shí)間間隔為12 h時(shí)柚苷酶活達(dá)到最大，繼續(xù)延長(zhǎng)超聲時(shí)間間隔會(huì)導(dǎo)致柚苷酶活的降低，這可能是由于超聲時(shí)間間隔的延長(zhǎng)使得菌體對(duì)超聲的反應(yīng)減弱，進(jìn)而導(dǎo)致柚苷酶活的下降。因此確定最佳超聲時(shí)間間隔為12 h。

圖5 超聲時(shí)間間隔對(duì)柚苷酶活的影響Fig.5 Effect of ultrasonic interval on naringinase activity

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化工藝

以超聲時(shí)期(A)、超聲功率(B)、超聲時(shí)長(zhǎng)(C)、超聲次數(shù)(D)、超聲時(shí)間間隔(E)為試驗(yàn)因素，以柚苷酶活為響應(yīng)值進(jìn)行五因素三水平的Box-Behnken設(shè)計(jì)，采用響應(yīng)曲面法對(duì)超聲強(qiáng)化柚苷酶活的工藝進(jìn)行優(yōu)化。Box-Behnken設(shè)計(jì)由46個(gè)試驗(yàn)組組成，包括40個(gè)因子點(diǎn)和6個(gè)中心點(diǎn)，響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)方案與結(jié)果Tab.2 Experimental scheme and results of RSM

2.2.1 數(shù)學(xué)模型建立

使用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到柚苷酶活與各因素間的二元回歸方程：

N=1 058.34+4.36A-6.60B+8.21C+

0.34D-4.81E-0.12AB-11.24AC-

23.14AD+7.17AE-10.26BC-

15.84BD-9.13BE+10.14CD+

5.74CE+11.00DE-29.06A2-

32.09B2-15.14C2-14.64D2-7.74E2

2.2.2 方差分析

由表4可知，對(duì)響應(yīng)值產(chǎn)生影響的5個(gè)因素對(duì)柚苷酶活的影響作用由大到小依次為B、C、E、A、D，其中B、C、E三項(xiàng)影響極顯著(P<10-4)，A影響顯著(P<0.05)，D影響不顯著(P>0.05)；A、B、C、E各因素平方項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響都達(dá)到極顯著水平，所以超聲時(shí)機(jī)、超聲功率、超聲時(shí)長(zhǎng)和超聲間隔時(shí)間對(duì)柚苷酶活的影響較大。

2.2.3 響應(yīng)面分析

使用Design-Expert 8.0.6軟件繪制出各因素對(duì)響應(yīng)值影響的三維曲面圖，如圖6所示?？梢钥闯觯晻r(shí)期、功率、時(shí)長(zhǎng)和時(shí)間間隔都存在相關(guān)性，所有的曲面圖均為開口向下的凸面，并存在最高點(diǎn)，說明在試驗(yàn)考察范圍內(nèi)存在最大的柚苷酶活響應(yīng)值。

表3 響應(yīng)曲面回歸模型方差分析Tab.3 Variance analysis of RSM regression equation

由圖6(a)可以看出，當(dāng)超聲功率、超聲次數(shù)和超聲時(shí)間間隔為零水平時(shí)，隨著A和C的增大，柚苷酶活呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì)；由圖6(b)可以看出，當(dāng)其余因素處于零水平時(shí)，隨著A和E的增大，柚苷酶活達(dá)到最大酶活后快速降低，A、E表現(xiàn)出對(duì)柚苷酶活的非線性影響；由圖6(c)可以看出，隨著B和C的增大，柚苷酶活快速增大，后趨于平緩，響應(yīng)曲面的坡度較陡，B、C對(duì)柚苷酶活的影響顯著；圖6(d)為C、E對(duì)柚苷酶活的交互影響。總體來(lái)說，各因素的交互影響效果明顯，等高線都呈現(xiàn)橢圓形，說明該響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)能夠合理反映出各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。

2.2.4 最佳超聲工藝的確定和驗(yàn)證試驗(yàn)

最佳超聲刺激工藝條件：超聲時(shí)期27.25 h、超聲功率160.12 W、超聲時(shí)長(zhǎng)14.43 min、超聲次數(shù)2.83、超聲時(shí)間間隔13.02 h，柚苷酶活的理論預(yù)測(cè)值最高可達(dá)1 064.19 U/mL。結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)條件，確定超聲強(qiáng)化黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)柚苷酶的最佳工藝參數(shù)為超聲時(shí)機(jī)27 h、超聲功率160 W、超聲時(shí)長(zhǎng)14 min、超聲次數(shù)2次、超聲間隔時(shí)間13 h。在該工藝條件下測(cè)得柚苷酶活為1 059.20 U/mL，與預(yù)測(cè)值非常接近。

圖6 響應(yīng)面分析各因素對(duì)柚苷酶活影響

Fig.6 Response surface plots of the effect of two-factor interaction on naringinase activity

3 結(jié) 論

對(duì)超聲刺激強(qiáng)化黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶過程進(jìn)行了研究，通過響應(yīng)曲面法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，獲得了最佳優(yōu)化工藝：超聲時(shí)期27 h、超聲功率160 W、超聲時(shí)長(zhǎng)14 min、超聲次數(shù)2次、超聲時(shí)間間隔13 h，柚苷酶活達(dá)1 059.20 U/mL，與未進(jìn)行超聲的對(duì)照組相比提高了23.16%。