周鵑，馮晶，汪偉，余超，張帆，秦偉偉

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┙陙?lái)的發(fā)病率逐漸升高，且呈現(xiàn)年輕化傾向[1]。研究指出，心肌缺血導(dǎo)致心臟供氧減少是其直接表現(xiàn)，無(wú)法有效支持心臟正常工作，部分患者甚至出現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡[2]。脂代謝異常、血管內(nèi)皮功能損傷可能導(dǎo)致冠心病的發(fā)生以及嚴(yán)重心腦血管事件發(fā)生，甚至引起死亡[3]。激活蛋白激酶C（PKC）被激活后可有效刺激核轉(zhuǎn)錄因子κB和絲裂原活化蛋白激酶水平異常升高，導(dǎo)致TNF-α、組胺、IL-6等炎癥介質(zhì)的大量釋放，加重冠心病的進(jìn)展[4]。芝麻素是芝麻的重要組成成分，具有改善血管肥厚、心肌，降低膽固醇（TC）、三酰甘油（TG），抗氧化，減少中風(fēng)發(fā)生等[5]。此外動(dòng)物研究結(jié)果顯示，單純高脂飲食可導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化，使用芝麻素干預(yù)后則可有效改善大鼠動(dòng)脈粥樣硬化程度[6]。但芝麻素對(duì)冠心病療效和作用機(jī)制尚無(wú)相關(guān)報(bào)道，筆者擬構(gòu)建冠心病大鼠模型，分析芝麻素對(duì)冠心病大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響及PKCα/NF-κB信號(hào)途徑的影響。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組本研究選用30只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重140～180 g，購(gòu)買(mǎi)自南京青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育場(chǎng)，分籠飼養(yǎng)，SPF動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由飲食飲水和采光。將大鼠分為對(duì)照組、模型組和觀察組3組，每組各10只。

1.2 分組處理方法模型組和觀察組大鼠進(jìn)食高脂飼料（69%基礎(chǔ)飼料、20%豬油、5%白糖、3%膽固醇、2%蛋黃粉、1%維生素D、0.2%丙基硫氧嘧啶）連續(xù)飼養(yǎng)16周，自由飲水。16周后，禁食，采用3 ml/kg 25%烏拉坦麻醉腹腔注射、30 μ/kg垂體后葉素。記錄心電圖，評(píng)估心肌缺血程度時(shí)以J及T波改變作為標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組大鼠予以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。觀察組造模完成后芝麻素（80 mg/kg）灌胃治療1/d，對(duì)照組和模型組大鼠應(yīng)用等體積生理鹽水進(jìn)行干預(yù)，持續(xù)灌胃6周。

1.3 觀察指標(biāo)干預(yù)結(jié)束后禁食12 h，鼠尾采血法取血，后3000 rpm/min離心10 min，收集血清檢測(cè)三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。麻醉后取大鼠胸主動(dòng)脈，剪除結(jié)締組織，剪3～4 mm血管環(huán)，懸掛K-H液氣管浴管，連接張力換能器，給予95%氧氣和5%二氧化碳混合，血管環(huán)穩(wěn)定后使用去氧腎上腺素（1μM）干預(yù)。張力恢復(fù)1 g后，使用1 μM去氧腎上腺素收縮血管，達(dá)峰值10 min后，給予乙酰膽堿，穩(wěn)定后并平衡至基礎(chǔ)張力。收縮達(dá)峰值后給予以酸化亞硝酸鈉，以1 μM去氧腎上腺素，記錄血管張力變化。大鼠心肌組織切片后，使用TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況，鏡下記錄凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡率。稱(chēng)量大鼠心肌組織重量，冰上操作使用裂解液制備組織勻漿，用Western-blot法檢測(cè)組織中Caspase-3、Caspase-12、PKCα、p-PKCα、p-IκBα、IκBα、NF-κB、NF-κB p65和β-actin水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用ImageJ軟件分析Western blot法檢測(cè)結(jié)果，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用mean±sd表示計(jì)量資料，方差檢驗(yàn)分析多組計(jì)量資料差異，以P＜0.05，為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠脂代謝水平檢測(cè)結(jié)果本組研究結(jié)果顯示，各組大鼠TG和HDL-C水平無(wú)明顯差異（P＞0.05），三組的TC水平存均在明顯差異，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），觀察組大鼠TC水平明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表1。

2.2 大鼠血管內(nèi)皮功能檢測(cè)結(jié)果研究結(jié)果顯示，各組大鼠血管內(nèi)皮經(jīng)酸化亞硝酸鈉處理后血管最大舒張程度無(wú)明顯差異（P＞0.05），但經(jīng)ACH處理后，三組大鼠血管最大舒張程度間存在明顯差異，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），觀察組大鼠ACH處理血管最大舒張程度明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表2。

2.3 大鼠心肌細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白調(diào)查結(jié)果結(jié)果顯示，各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率、Caspase-3和Caspase-12存在明顯差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），觀察組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯低于模型組，Caspase-3和Caspase-12蛋白表達(dá)水平明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表3。

表1 大鼠脂代謝檢測(cè)結(jié)果（mmol/L）

表2 大鼠血管內(nèi)皮功能檢測(cè)結(jié)果

表3 大鼠心肌細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白調(diào)查結(jié)果

圖1 凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)圖

2.4 大鼠心肌細(xì)胞PKCα/NF-κB信號(hào)蛋白檢測(cè)結(jié)果結(jié)果顯示，各組大鼠心肌細(xì)胞p-PKCα、p-IκBα和NF-κB p65間存在明顯差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中觀察組大鼠心肌細(xì)胞p-PKCα、p-IκBα和NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表4。

表4 大鼠心肌細(xì)胞PKCα/NF-κB信號(hào)蛋白檢測(cè)結(jié)果

圖2 PKCα/NF-κB信號(hào)蛋白檢測(cè)結(jié)果

3 討論

研究指出，冠心病多伴血脂異常，是異常動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立性因素[7]。有學(xué)者指出，黏附內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞數(shù)量明顯增加，細(xì)胞移入內(nèi)膜下，有效吞噬低密度脂蛋白，導(dǎo)致硬化病變[8]，隨著TC水平長(zhǎng)期處于增高狀態(tài)，導(dǎo)致冠心病事件發(fā)病率逐年增高。高脂高糖飲食可制備冠心病模型，且與病理特征相似[9]，使血壓升高和血管內(nèi)皮功能障礙。研究指出，單純高糖飲食可提升體內(nèi)活性氧水平，抑制一氧化氮合酶活性，導(dǎo)致血管舒張功能障礙[10]。長(zhǎng)期高脂高糖飲食易伴隨血管內(nèi)皮功能障礙，改善血管內(nèi)皮功能有助于冠心病的防治[11]。

模型組飼養(yǎng)6周后大鼠血脂水平顯著升高，可見(jiàn)冠心病改變。采用芝麻素干預(yù)6周后，大鼠TC水平顯著改善。分析認(rèn)為，芝麻素可抑制腸管中膽固醇的吸收，加速膽固醇溶解性下降，加速降低血脂水平，阻礙膽固醇合成，抑制體內(nèi)膽固醇合成相關(guān)酶活性，但改善TG和HDL-C水平療效一般，可能與觀察時(shí)間短有關(guān)。冠心病的病理過(guò)程中多伴隨出現(xiàn)不同程度的血管內(nèi)皮功能損傷，并出現(xiàn)血管內(nèi)皮舒縮功能失調(diào)。本研究使用ACH干預(yù)大鼠胸主動(dòng)脈可誘導(dǎo)血管舒張效應(yīng)，冠心病模型可出現(xiàn)血管內(nèi)皮依賴(lài)性舒張障礙。結(jié)果顯示，冠心病大鼠采用芝麻素干預(yù)治療后，可緩解主動(dòng)脈對(duì)ACH舒張反應(yīng)，激活體內(nèi)一氧化氮生物活性。

研究顯示，PKC激活后可激活I(lǐng)κB激酶復(fù)合物，通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解，NF-κB與IκB形成復(fù)合物并釋放進(jìn)入細(xì)胞核，與DNA上特異性序列結(jié)合，引起IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8基因的轉(zhuǎn)錄[12,13]。PKC信號(hào)介導(dǎo)NF-κB激活在冠心病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[14]。PKC/NF-κB途徑活性增高可提高炎癥細(xì)胞因子表達(dá)水平升高，通過(guò)siRNA干擾PKCα后顯著降低炎癥因子表達(dá)[15]。此外，PKCα磷酸化IκBα后進(jìn)一步激活NF-κB介導(dǎo)氣道變態(tài)反應(yīng)性疾病。本組研究結(jié)果顯示，冠心病大鼠模型心肌細(xì)胞的PKCα、IκBα及NF-κB磷酸化程度加重，應(yīng)用芝麻素干預(yù)后可有效抑制PKCα、IκBα及NF-κB磷酸化，抑制PKC/NF-κB途徑活性。分析認(rèn)為，芝麻素可有效抑制冠心病大鼠心肌細(xì)胞的異?；罨种芇KCα/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑并降低體內(nèi)多種炎癥介質(zhì)釋放。

綜上所述，芝麻素通過(guò)調(diào)控PKCα/NF-κB信號(hào)途徑有效抑制冠心病大鼠心肌細(xì)胞凋亡。但本研究并未對(duì)大鼠體內(nèi)基因水平差異進(jìn)行分析，有待后續(xù)持續(xù)追蹤報(bào)道。