劉佳欣，賀夢瑤，湯興楠，欒凱雯

分析檢測

離子交換色譜法測定牛初乳中乳鐵蛋白的質(zhì)量濃度

劉佳欣，賀夢瑤，湯興楠，欒凱雯

（沈陽化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院，遼寧 沈陽 110142）

建立一種離子交換色譜法測定牛初乳中乳鐵蛋白質(zhì)量濃度的方法。采用cm-sepharose fast flow預(yù)裝柱5 mL，配置質(zhì)量濃度為10、20、30、40、50、60、70、80μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)乳鐵蛋白溶進(jìn)行液色譜分離，pH值為7.0，濃度為0.02 mol·L-1的磷酸鹽溶液為起始緩沖液，進(jìn)樣量為1 mL，流速1 mL·min-1，濃度為1 mol·L-1NaCl溶液洗脫，檢測波長475 nm?；貧w方程：=1.277 4+16.727 0，2=0.999，線性范圍為10~80 μg·mL-1，平均加標(biāo)回收率為96.56%。此方法在分離牛初乳中的乳鐵蛋白同時，又可以測定乳鐵蛋白的含量，方便，快捷，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好。

離子交換；牛初乳；乳鐵蛋白；檢測

乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）是一種相對分子量約為80 kDa的鐵結(jié)合性糖蛋白，主要存于哺乳動物的乳汁中[1]，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)也出現(xiàn)在人和哺乳動物的胰液、膽汁和小腸分泌液等組織[2]。乳鐵蛋白在乳中的含量最為豐富，特別是在初乳中含量較高，人初乳中乳鐵蛋白的濃度可達(dá)到7 mg·mL-1，牛初乳中乳鐵蛋白的濃度平均為1 mg·mL-1 [3]。乳鐵蛋白具有多種生物學(xué)功能,可以促進(jìn)鐵的吸收[4]，抗癌，抗病毒,抗氧化，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)[5-6]。乳鐵蛋白還具有抑制脂質(zhì)過氧化、抑制膽固醇的積累，促進(jìn)骨骼生長的功能[8-9],還可以同多種抗生素和抗病毒藥物協(xié)同作用[10-11]。

目前檢測乳鐵蛋白的方法有很多種，如高效液相色譜法[12]，酶聯(lián)免疫法[13]，聚丙烯酰胺凝膠電泳法[14]，毛細(xì)管電泳法[15]等。高效液相色譜法的優(yōu)點(diǎn)是快速，準(zhǔn)確，穩(wěn)定可靠，精密度高，但該方法對樣品的純度要求比較嚴(yán)格，僅適用于高純度的樣品測定[16]。酶聯(lián)免疫法的基本原理是抗原抗體的特異性反應(yīng)，樣品中的其他蛋白質(zhì)并不與乳鐵蛋白的抗體發(fā)生反應(yīng)，因此該法對樣品純度要求較低，不需要進(jìn)行純化，但是該方法操作時需要對待測樣品進(jìn)行逐級稀釋，過程繁瑣，容易出現(xiàn)誤差[17]。毛細(xì)管電泳法具有分析速度快、分離效率高、操作簡便、操作成本低等優(yōu)點(diǎn)，但該方法僅適用于保健食品、嬰幼兒配方奶粉中乳鐵蛋白的測定，對生乳中乳鐵蛋白含量的測定效果不佳[18]。聚丙烯酰胺凝膠電泳法具有設(shè)備簡單、費(fèi)用低、操作方法簡單等優(yōu)點(diǎn)，但檢測時間長、不宜檢測大批量樣品、檢測過程較為復(fù)雜等[19]。本試驗(yàn)試驗(yàn)采用離子交換色譜法測定牛初乳中乳鐵蛋白含量，操作方便，準(zhǔn)確可靠，并且分離和檢測可以同時進(jìn)行，大大提高試驗(yàn)效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

95%乳鐵蛋白，biotopped公司；牛初乳，木蘭花乳業(yè)奶牛養(yǎng)殖場； cm-sepharose fast flow 5 mL，通用電氣公司；鹽酸，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉均為分析純，西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AKTA purifier，通用電氣公司；高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技有限公司；Synergy2多功能酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司；HH4型數(shù)顯恒溫水浴鍋, 金壇市天瑞儀器有限公司；GB1302 型電子精密天平，梅特勒托利多儀器公司，SHZ-D (Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

將牛初乳裝入100 mL離心管中，以10 000 r·min-14 ℃離心30 min，除去上層脂肪；加入1 mol·L-1的稀鹽酸，緩慢添加調(diào)至牛初乳溶液pH為4.6，水浴加熱40 ℃，保溫30 min，然后放入高速冷凍離心機(jī)中，以10 000 r·min-140 ℃離心30 min，保留上層乳清蛋白，將得到乳清蛋白溶液；進(jìn)行抽濾，得到的粗樣品，用0.45μm的微孔濾膜過濾，得到純凈的樣品。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)乳鐵蛋白溶液的配置

精確稱取純度為95%的乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g，用0.15 mol·L-1NaCl溶液定容至100 mL，配成質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)乳鐵蛋白溶液。選用0.22 μm的微孔濾膜過濾，用于色譜測定。

1.3.3 最大吸收波長的確定

將上述配置好的100 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)乳鐵蛋白溶液，用紫外分光光度計(jì)在400~700 nm下掃描，測定最大吸收波長為475 nm。

1.3.4 色譜條件

色譜柱cm-sepharose fast flow 預(yù)裝柱5 mL；流動相：A溶液（pH值為7.0濃度為0.02 mol·L-1的磷酸緩沖鹽溶液）；B溶液（pH值為7.0濃度為1 mol·L-1NaCl混合溶液），流速1 mL·min-1，進(jìn)樣量: 1 mL; 檢測器:紫外檢測器; 檢測波長為475 nm。

1.3.5 穿透曲線的繪制

精確量取上述配置的標(biāo)準(zhǔn)乳鐵蛋白溶液（100μg·mL-1）10 mL。采用superloop 10 mL上樣管進(jìn)行上樣，按照1.3.4的色譜條件進(jìn)行動態(tài)吸附，觀察紫外檢測器變化，繪制穿透曲線。

1.3.6 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取9只試管，分別加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL的乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液（質(zhì)量濃度為100μg·mL-1）用0.15 mol·L-1NaCl溶液補(bǔ)足到10 mL，混合均勻，30 min內(nèi)以0管為空白對照，以標(biāo)準(zhǔn)乳鐵蛋白的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品在475 nm處的紫外吸收峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算曲線方程。

2 結(jié)果與討論

2.1 穿透曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)乳鐵蛋白的在cm-sepharose fast flow 離子交換色譜上的穿透曲線如圖1。試驗(yàn)在的流速1 mL·min-1下進(jìn)樣, 由圖1可見上樣體積達(dá)到1 mL時達(dá)到穿透點(diǎn), 2 mL左右cm-sepharose fast flow離子交換色譜吸附基本達(dá)到飽和，之后吸附作用開始減弱，由此計(jì)算得到, 進(jìn)樣2 mL左右可以使預(yù)裝柱充分吸附,當(dāng)吸附達(dá)到飽和時,繼續(xù)進(jìn)樣不僅對吸附量的增加效果不大, 而且由于溶質(zhì)濃度急劇變大, 還會造成目標(biāo)產(chǎn)物的損失，因此確定最大上樣量為100μg·mL-1。

圖1 cm-sepharose fast flow穿透曲線

2.2 精密度試驗(yàn)

精確吸取100 μg·mL-1的乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液6份，各5 mL，加入0.15 mol·L-1NaCl補(bǔ)足到10 mL于具塞試管中，按1.3.4中方法測定峰面積，計(jì)算RSD=1.039%。（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RDS=%）

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精確吸取樣品溶液6份各5 mL, 加入0.15 mol·L-1NaCl溶液補(bǔ)足到10 mL于具塞試管中，按1.3.4中測定峰面積，計(jì)算RSD=1.299%。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精確吸取100μg·mL-1的乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液6份，各 5 mL，加入0.15 mol·L-1NaCl補(bǔ)足到10 mL于具塞試管中，分別在 0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h 按照1.3.4中方法測定峰面積，計(jì)算RSD=1.028%。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.5 加樣回收試驗(yàn)

精確吸取樣品溶液6份，各5 mL，精確吸取100 μg·mL-1的乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液6份，各5 mL，加入0.15 mol·L-1NaCl補(bǔ)足到20 mL于具塞試管中，按 1.3.4的色譜條件測定峰面積，計(jì)算平均加樣回收率=96.56%。

表4 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.6 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以乳鐵蛋白的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以乳鐵蛋白在475 nm處的紫外吸收峰面積為縱坐標(biāo)（樣品進(jìn)樣量1 mL），做乳鐵蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖2），由此計(jì)算出的回歸方程為=1.277 4+16.727 0，2=0.999。

圖2 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.7 離子交換色譜起始緩沖液pH的選擇

牛乳中乳鐵蛋白的等電點(diǎn)約pH 7.8,緩沖液pH值與蛋白質(zhì)等電點(diǎn)相差越大，蛋白質(zhì)所帶正電荷越多，與陽離子交換劑結(jié)合越牢固, 大于等電點(diǎn)乳鐵蛋白會產(chǎn)生沉淀, 產(chǎn)物不能出現(xiàn)離子化。因此分別選擇pH 6、6.5、7、7.5、8的磷酸緩沖溶液，進(jìn)行動態(tài)吸附試驗(yàn)。試驗(yàn)過程中對乳鐵蛋白回收率的變化情況進(jìn)行監(jiān)測,得到最佳起始緩沖液pH值。

試驗(yàn)研究過程中，在質(zhì)量濃度相同pH值不同的流動相條件下，對牛初乳中所含的乳鐵蛋白和其他蛋白質(zhì)的分離程度進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同pH值的流動相對樣品的分離效果有一定的影響，并且乳鐵蛋白的出峰時間也有所不同。

當(dāng)起始緩沖液的pH值高于8.0時, 乳鐵蛋白基本無法吸附在cm-sephrose fast flow色譜柱上，乳鐵蛋白會與部分雜蛋白等組分一起率先被洗脫下來，這是因?yàn)槠鹗季彌_液的pH值高于8.0時乳鐵蛋白會產(chǎn)生沉淀,產(chǎn)物不能出現(xiàn)離子化碳水化合[20]。當(dāng)起始緩沖液的pH值低于6.5時, 乳鐵蛋白的出峰時間明顯延后, 這是由于乳鐵蛋白自身所帶的電荷增加以及與離子交換柱之間的吸附能力增強(qiáng)所致。

采用pH值低于6.5的磷酸鹽溶液作為起始緩沖液，洗脫時需要高濃度的鹽溶液才可以將乳鐵蛋白洗脫下來，由于鹽溶液濃度過高易腐蝕泵頭，并且浪費(fèi)試劑，不適合作為首選。

當(dāng)初始緩沖液的pH值低于8時，乳鐵蛋白是帶負(fù)電荷的，乳鐵蛋白并不能與Cm-sepharose fast flow色譜柱交換電荷和吸附，因此乳鐵蛋白和雜蛋白一起被洗脫下來。經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)起始緩沖液的pH值為7時，乳鐵蛋白出峰時間較早，并且很好的與雜蛋白分離，可以獲得了較高純度的乳鐵蛋白。

2.8 洗脫方式的選擇

2.8.1 梯度洗脫

采用0~1.5 mol·L-1NaCl進(jìn)行梯度洗脫,分離效果不佳,峰形較為擴(kuò)散,采用梯度洗脫時,洗脫劑梯度變化的快慢和洗脫液濃度都會影響分離效果。而且梯度速率的變化控制也是比較困難的。

2.8.2 分布洗脫

配置濃度為0.3、0.5、0.7 mol·L-1NaCl溶液依次進(jìn)行洗脫，這一步目的是先將雜蛋白與乳鐵蛋白分離，并將雜蛋白洗脫下來，然后直接采用1.0 mol·L-1的 NaCl溶液作為第四個分步，快速洗脫乳鐵蛋白組分。經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，采用0.3、0.5、0.7 mol·L-1NaCl溶液進(jìn)行洗脫，可以將雜蛋白和乳鐵蛋白完全分開，從而雜蛋白率先洗脫出來，直接采用1.0 mol·L-1NaCl 的高濃度的鹽溶液作為第四個分步，可以快速洗脫乳鐵蛋白組分，得到較為純凈的乳鐵蛋白[21]。

2.8.3 單一濃度洗脫

從2.5.2分布洗脫過程中得出，直接采用1.0 mol·L-1NaCl溶液進(jìn)行洗脫可以快速地將乳鐵蛋白分離出來。從出峰效果分析，與分步洗脫有很好的一致性。 差別僅在于沒有將雜蛋白沒有分開，但這一步對乳鐵蛋白的分離并未造成影響。單一濃度洗脫操作方便，節(jié)省時間和試劑。

3 結(jié) 論

乳鐵蛋白作為一種新興功能性食品配料，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，近年來乳鐵蛋白的提取純化工藝條件和應(yīng)用研究在不斷地增多，它已被成功的應(yīng)用在酸奶、嬰幼兒配方奶粉等產(chǎn)品中[22]。試驗(yàn)采用離子交換色譜法對牛初乳中的乳鐵蛋白的含量進(jìn)行了測定，按照方法學(xué)要求對試驗(yàn)的線性范圍、精密度、重現(xiàn)性以及加樣回收率等參數(shù)進(jìn)行了確定。該方法方便快捷，準(zhǔn)確可靠，對牛初乳中的乳鐵蛋白進(jìn)行了分離和檢測，為下一步乳鐵蛋白的純化奠定了基礎(chǔ)。

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Determination of the Mass Concentration of Lactoferrin in Bovine Colostrum by Ion Exchange Chromatography

,,,

（Shenyang University of Chemical Technology, Shenyang Liaoning 110142, China）

An ion exchange chromatography method was developed to determine the mass concentration of lactoferrin in bovine colostrum. Using cm-sepharose fast flow pre-loaded column 5 mL, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 μg·mL-1standard lactoferrin solutions were chromatographically separated, with pH value of 7.0, 0.02 mol·L-1phosphate solution as the initial buffer, sample quantity 1 mL, flow rate 1 mL·min-1, 1 mol·L-1NaCl solution as eluent, detection wavelength 475 nm. The regression equation was=1.277 4+16.727 0,2=0.999, the linear range was 10~80 g·mL-1, and the average spike recovery rate was 96.56%. This method can not only isolate lactoferrin from bovine colostrum, but also determine the content of lactoferrin, and it is convenient, fast, accurate and reproducible.

Ion exchange; Colostrum; Lactoferrin; Detection

2020-10-21

劉佳欣（1995-），女，遼寧省丹東市人，研究方向：乳鐵蛋白的提取及分離純化。

TQO658.6+8

A

1004-0935（2020）03-0419-04