時(shí)超杰，朱一帆，李莎莎，何敖林

江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)研究中心，江蘇昆山 215300

PCR 技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測(cè)的先進(jìn)技術(shù)之一，現(xiàn)在的分子診斷都基于這項(xiàng)技術(shù)。它讓人類基因組計(jì)劃得以于2003 年初步完成，通過(guò)基因組分析，科學(xué)家們揭示了人類基因的多態(tài)性與許多易感疾病的關(guān)系，并延伸到了基因工程藥物、基因生物芯片、細(xì)胞生物工程等的研究。此外，通過(guò)個(gè)體化的基因組表達(dá)分析，還能為個(gè)體提供一套疾病診斷、治療、預(yù)后的方案，實(shí)現(xiàn)真正的精準(zhǔn)醫(yī)療，PCR 技術(shù)實(shí)現(xiàn)了個(gè)體化檢測(cè)[1]。但是，隨著技術(shù)的迅速發(fā)展，外界對(duì)于檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的質(zhì)疑也越來(lái)越多。一方面，由于PCR 技術(shù)本身的高敏感性，操作不當(dāng)或是微量的污染都極易導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性；另一方面，實(shí)驗(yàn)室布局不合理、樣本管理不當(dāng)、試劑耗材管理不當(dāng)、儀器設(shè)備狀態(tài)不良、人員缺乏培訓(xùn)、質(zhì)控不在控、擴(kuò)增污染、異常結(jié)果處理不當(dāng)、檢測(cè)結(jié)果報(bào)告錯(cuò)誤等，這些都是隨時(shí)可能發(fā)生在實(shí)驗(yàn)前、中、后期的。最后，細(xì)節(jié)決定成敗，由于實(shí)驗(yàn)步驟較多，實(shí)驗(yàn)人員容易疏忽出錯(cuò)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中涉及的各個(gè)環(huán)節(jié)都是需要實(shí)驗(yàn)人員認(rèn)真嚴(yán)謹(jǐn)?shù)厝?duì)待，只有這樣才能為臨床提供更可靠的服務(wù)。面對(duì)上述這么多的問(wèn)題，這就要求實(shí)驗(yàn)人員在臨床檢測(cè)的工作之前，更要重視實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理。

1 實(shí)驗(yàn)前的質(zhì)量控制

1.1 實(shí)驗(yàn)室的布局

實(shí)驗(yàn)室的布局需要滿足《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》等相關(guān)規(guī)定，確保各個(gè)分區(qū)獨(dú)立且專用。

1.2 實(shí)驗(yàn)室的設(shè)施環(huán)境

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該規(guī)定人流、物流以及清潔工作的單向流動(dòng)來(lái)防止區(qū)間污染。安排實(shí)驗(yàn)人員對(duì)實(shí)驗(yàn)室的空間、照明、能源、溫度、濕度等的監(jiān)測(cè)來(lái)滿足檢測(cè)工作的環(huán)境要求。此外，各個(gè)區(qū)域都應(yīng)要有紫外燈的設(shè)置，包括固定的吊頂紫外燈以及移動(dòng)紫外消毒車，以滿足實(shí)驗(yàn)室防止“基因/核酸”污染的要求。

1.3 實(shí)驗(yàn)人員要求

實(shí)驗(yàn)室工作人員首先要具備省級(jí)或以上衛(wèi)生和計(jì)生行政部門授權(quán)的上崗證，再進(jìn)行內(nèi)部培訓(xùn)，在充分熟知實(shí)驗(yàn)室的工作流程和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)化的操作程序后，再對(duì)其進(jìn)行理論和操作考核[2]，盡量避免人員因素導(dǎo)致的結(jié)果差異。除此之外，實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人還需要定期組織人員通過(guò)培訓(xùn)、自學(xué)、會(huì)議等多種途徑來(lái)不斷提高實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的意識(shí)。

1.4 儀器設(shè)備管理和維護(hù)保養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)操作離不開儀器設(shè)備，因此儀器設(shè)備的管理和維護(hù)保養(yǎng)，是合格檢測(cè)結(jié)果的基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)室的主要儀器設(shè)備均需建立檔案，主要儀器設(shè)備包括PCR 儀、 離心機(jī)、移液器、冰箱、渦旋震蕩器、生物安全柜、紫外分光光度計(jì)等。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)這些相關(guān)儀器設(shè)備制定校準(zhǔn)、維護(hù)和保養(yǎng)的制度，規(guī)定每日、每周、每月、每年保養(yǎng)維護(hù)內(nèi)容，并進(jìn)行有效記錄。遇到儀器設(shè)備出現(xiàn)故障的情況時(shí)，及時(shí)登記故障記錄表，通知上級(jí)負(fù)責(zé)人的同時(shí)還需要給設(shè)備做好故障的標(biāo)識(shí)以防止他人誤用。要改正以往對(duì)儀器設(shè)備狀態(tài)問(wèn)題基本不重視的缺點(diǎn)，要明白定期校準(zhǔn)和保養(yǎng)儀器設(shè)備對(duì)保證日常檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的重要性。

1.5 試劑管理和質(zhì)檢

對(duì)試劑的質(zhì)檢包括內(nèi)、外包裝檢查和性能驗(yàn)證。外包裝檢查：實(shí)驗(yàn)人員需要查驗(yàn)試劑的外包裝、產(chǎn)品有效期、運(yùn)輸溫度等；內(nèi)包裝檢查：實(shí)驗(yàn)人員需對(duì)試劑盒內(nèi)的說(shuō)明書、試劑的符合情況等進(jìn)行檢查。試劑的性能驗(yàn)證是重中之重，需設(shè)置空白對(duì)照、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和多個(gè)上批次已測(cè)結(jié)果的樣本，以此來(lái)評(píng)估新批次試劑的性能。試劑在實(shí)際使用過(guò)程中應(yīng)避免反復(fù)凍融，開啟或復(fù)溶后需及時(shí)記錄日期和有效期。自配試劑，最好做到現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.6 耗材管理

實(shí)驗(yàn)耗材是實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行的基礎(chǔ)，實(shí)驗(yàn)室對(duì)主要耗材查驗(yàn)并登記記錄，特別應(yīng)加強(qiáng)對(duì)離心管和濾芯吸頭的質(zhì)檢，離心管應(yīng)進(jìn)行高溫爆管、高速離心完整性試驗(yàn)和是否含有擴(kuò)增抑制物等的檢測(cè)，濾芯吸頭的密封性需仔細(xì)查驗(yàn)。

1.7 標(biāo)本的管理

實(shí)驗(yàn)室根據(jù)所開展項(xiàng)目的需要，自行擬定樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)、接收、拒收、保存等相關(guān)制度以確保檢測(cè)樣本的有效性。該院實(shí)驗(yàn)室使用全血樣本，對(duì)采集人員宣教要求使用EDTA 抗凝管采血，嚴(yán)禁使用對(duì)PCR 擴(kuò)增有抑制作用的肝素管。轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中要求使用專用低溫貯存盒送檢，運(yùn)輸過(guò)程中應(yīng)避免血液樣本劇烈振蕩而導(dǎo)致的溶血。實(shí)驗(yàn)室在接收樣本時(shí)需仔細(xì)核對(duì)樣本基本信息并評(píng)估樣本的合格性，對(duì)不合格的樣本，如溶血、脂血、樣本量不足、運(yùn)輸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、基本信息不符等進(jìn)行拒收，記錄并與臨床取得溝通，對(duì)于無(wú)法重新采集的標(biāo)本，在與臨床溝通獲得知情同意后，方可進(jìn)行讓步檢測(cè)。將不能及時(shí)檢測(cè)的全血樣本放置4℃的冰箱，并保存時(shí)間不超過(guò)一周；將需要短期貯存的樣本置于-20℃的冰箱，并保存時(shí)間不超過(guò)一個(gè)月；將完成實(shí)驗(yàn)需要長(zhǎng)期保存的樣本置于-80℃的冰箱，以備復(fù)檢。此外，由于實(shí)驗(yàn)室在日常工作中樣本量較大，為了避免樣本間的混淆，還需要引入樣本唯一性編號(hào)的管理程序[3]，以便于樣本的核對(duì)與查找。

2 實(shí)驗(yàn)中的質(zhì)量控制

2.1 室內(nèi)質(zhì)控

室內(nèi)質(zhì)控指的是實(shí)驗(yàn)人員通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)工作的精密度，確保工作中批內(nèi)、批間樣本檢測(cè)結(jié)果的可靠性，從而來(lái)確定檢測(cè)結(jié)果能否發(fā)放的一項(xiàng)重要工作[4]。一般選用陰性和弱陽(yáng)性質(zhì)控品進(jìn)行監(jiān)測(cè)，陰性質(zhì)控品為無(wú)模板對(duì)照，需要將其包含在整個(gè)擴(kuò)增檢測(cè)步驟中，以證明樣本、試劑及整個(gè)操作平臺(tái)中沒(méi)有核酸的污染。弱陽(yáng)性質(zhì)控品應(yīng)包括所有突變位點(diǎn)，在日常監(jiān)測(cè)中只需加入一個(gè)已知突變，以后每批次檢測(cè)中逐步涵蓋所有突變位點(diǎn)，注意最好每次將質(zhì)控品的擴(kuò)增位置進(jìn)行順延以保證每個(gè)擴(kuò)增孔的有效性和穩(wěn)定性。對(duì)于室內(nèi)質(zhì)控出現(xiàn)問(wèn)題的情況，需要建立起應(yīng)對(duì)方案，包括查出異因、采取措施、保證消除、不再出現(xiàn)、納入標(biāo)準(zhǔn)來(lái)防止同樣情況的再次發(fā)生。

2.2 室間質(zhì)評(píng)

室間質(zhì)評(píng)是采用一些外部辦法來(lái)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，旨在提高實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力[5]。這些外部辦法有：①積極參與省臨檢中心組織的室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)，按照要求及時(shí)檢測(cè)并上報(bào)結(jié)果，對(duì)于反饋的不足之處需要認(rèn)真改正。②如果實(shí)驗(yàn)室所開展的項(xiàng)目并不在省臨檢中心組織的范圍內(nèi)，可以考慮參加國(guó)家組織的質(zhì)評(píng)活動(dòng)，同樣需要認(rèn)真對(duì)待反饋的結(jié)果并及時(shí)改善。③如果上述兩種質(zhì)評(píng)活動(dòng)都未能及時(shí)參與，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)與同級(jí)別或是更高級(jí)別實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比對(duì)，操作流程應(yīng)與國(guó)家和省級(jí)組織的活動(dòng)相同。室間質(zhì)評(píng)不是為了應(yīng)付考察，而是真真切切地對(duì)于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力的認(rèn)證，將不同實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果變得具有可比性，才能使實(shí)驗(yàn)室發(fā)出的結(jié)果更有保障[6]，也是對(duì)實(shí)驗(yàn)人員綜合素質(zhì)能力的認(rèn)定。

2.3 污染監(jiān)測(cè)及排除

介于PCR 技術(shù)的高敏感性，更需要將防污染的理念貫穿于整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中，并認(rèn)真落實(shí)。PCR 實(shí)驗(yàn)室的污染來(lái)源主要包括了試劑污染、標(biāo)本之間的交叉污染、PCR擴(kuò)增污染、質(zhì)粒污染等[7]。應(yīng)對(duì)這些棘手的問(wèn)題，首先要做到實(shí)驗(yàn)室布局合理，對(duì)實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)的所有設(shè)備、耗材進(jìn)行標(biāo)識(shí)，避免不同區(qū)域間混用帶來(lái)的污染。其次，在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)先打開紫外燈對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境消毒30 min 來(lái)消除殘留的核酸。在實(shí)驗(yàn)中如果發(fā)生污染，應(yīng)對(duì)污染的地方使用2 000 mg/L 的次氯酸鈉溶液進(jìn)行擦拭，等作用30 min后，再用蒸餾水和75%的乙醇擦拭2 遍，最后打開紫外燈照射1 h[8]。在實(shí)驗(yàn)后，對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中丟棄的槍頭、反應(yīng)管等有污染風(fēng)險(xiǎn)的耗材應(yīng)在2 000 mg/L 的次氯酸鈉溶液中浸泡過(guò)夜，實(shí)驗(yàn)樣本按照醫(yī)療廢棄物的生物安全要求進(jìn)行消毒處理。對(duì)實(shí)驗(yàn)室的地面、操作臺(tái)面及儀器設(shè)備使用1 000 mg/L 含氯消毒液進(jìn)行清潔，配合紫外燈照射30 min 以上[9]。此外，應(yīng)加強(qiáng)陰性、陽(yáng)性對(duì)照在每次試驗(yàn)中監(jiān)測(cè)污染的應(yīng)用分析，其中要強(qiáng)調(diào)的是對(duì)照樣本需要參與整個(gè)檢測(cè)流程，以確保能監(jiān)測(cè)任何可能帶來(lái)污染的環(huán)節(jié)，同時(shí)需要定期組織實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行防污染理論與實(shí)踐學(xué)習(xí)，來(lái)提高規(guī)范化操作的能力，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3 實(shí)驗(yàn)后的質(zhì)量控制

3.1 結(jié)果報(bào)告、解釋及臨床溝通

由于基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目還處在發(fā)展階段，這給臨床醫(yī)生解釋報(bào)告與治療的相關(guān)性提出了難題。因此，對(duì)于檢測(cè)報(bào)告的信息內(nèi)容要求更加詳細(xì)，除了有患者基本的相關(guān)信息外，還應(yīng)要有唯一性編號(hào)、樣本的質(zhì)量評(píng)價(jià)、檢測(cè)方法、檢測(cè)儀器、方法的局限性以及最新的臨床意義等。隨著結(jié)果報(bào)告的不斷完善，臨床對(duì)于檢測(cè)項(xiàng)目與治療的相關(guān)性也將有更好的理解。此外，實(shí)驗(yàn)室還需加強(qiáng)與臨床的主動(dòng)交流溝通[10]，如遇到樣本信息不符、檢測(cè)結(jié)果與臨床實(shí)際表現(xiàn)不符等情況，應(yīng)主動(dòng)查找原因，了解相關(guān)病史，給臨床提供進(jìn)一步檢查與治療的意見。只有這樣，將臨床與醫(yī)技緊密地聯(lián)系在一起，才能給患者帶來(lái)最優(yōu)質(zhì)的診療服務(wù)[11]。

3.2 異常結(jié)果處理

實(shí)驗(yàn)室若出現(xiàn)擴(kuò)增失敗、較難判讀的結(jié)果、質(zhì)控不在控等異常情況，需要有自己的應(yīng)對(duì)措施。一般的應(yīng)對(duì)措施有：①重新確認(rèn)樣本是否符合檢測(cè)的要求。②對(duì)確認(rèn)有效的樣本進(jìn)行重測(cè)，盡量避免人為因素、試劑因素、儀器設(shè)備因素等導(dǎo)致的異常。③仔細(xì)排查實(shí)驗(yàn)室是否存在污染而導(dǎo)致擴(kuò)增異常。④對(duì)于可疑的結(jié)果，應(yīng)使用數(shù)字PCR、基因芯片、基因測(cè)序等特異性和靈敏度更高的方法進(jìn)行驗(yàn)證，做好記錄并定期總結(jié)歸納[12]。可以將日常經(jīng)驗(yàn)寫成標(biāo)準(zhǔn)化的處理操作文件，實(shí)驗(yàn)人員需要認(rèn)真執(zhí)行并在日后的工作中不斷優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)文件。異常結(jié)果的妥善處理是對(duì)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制能力的考驗(yàn)，是實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步發(fā)展的必經(jīng)之路。

3.3 記錄保存與管理

實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)將實(shí)驗(yàn)過(guò)程中涉及的樣本唯一性編號(hào)、檢測(cè)試劑的來(lái)源和批號(hào)、核酸的純度與濃度、樣本檢測(cè)結(jié)果等相關(guān)情況進(jìn)行認(rèn)真記錄，在每日工作完成后及時(shí)整理歸檔，定期對(duì)這些記錄數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比對(duì)，保證批內(nèi)、批次間的檢測(cè)差異越小越好。如在分析中發(fā)現(xiàn)了問(wèn)題，需要及時(shí)組織科內(nèi)會(huì)議，仔細(xì)研討可能導(dǎo)致的原因并及時(shí)驗(yàn)證與糾正?？傊龊脤?shí)驗(yàn)室記錄不僅能夠規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作、提高工作效率，還能為建立標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的實(shí)驗(yàn)室管理體系奠定基礎(chǔ)[13]。

4 總結(jié)

目前，臨床基因擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)以其靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便快捷、可定性和定量檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于個(gè)體化藥物治療、產(chǎn)前篩查、腫瘤多基因檢測(cè)、感染性疾病檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域[14]。這項(xiàng)技術(shù)使得實(shí)驗(yàn)室在臨床醫(yī)療決策地位提升的同時(shí)，也給實(shí)驗(yàn)室提出了更加嚴(yán)格的要求。這就要求實(shí)驗(yàn)人員在日常的工作中，需要時(shí)刻謹(jǐn)記質(zhì)量第一的理念，嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)制度章程，規(guī)范操作并不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，進(jìn)一步加強(qiáng)與臨床的溝通交流，讓實(shí)驗(yàn)室能更好地服務(wù)于臨床。