車曉菲，張肖建,2，王紅志,2，郭永紅,2，郗艷菊,3★

（1.河北維爾利動物藥業(yè)集團(tuán)有限公司 050200；2.河北省中獸藥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院 050200；3.河北省功能性添加劑技術(shù)創(chuàng)新中心 050200）

黃芪益丹合劑是在《中華人民共和國藥典》“當(dāng)歸補血口服液”[1]基礎(chǔ)上進(jìn)行組方加減，由黃芪、當(dāng)歸、黃柏、肉蓯蓉、益母草、丹參等中藥配方組成，按規(guī)定工藝制備而成的口服液，用于預(yù)防和治療蛋雞輸卵管炎。 處方中黃芪、當(dāng)歸、黃柏是三大主要組分，而肉蓯蓉價格高可算“貴重藥材”，為有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量，本試驗參考2015 年版《中華人民共和國獸藥典》[2]中相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，制定了如下研究方案： ①通過TLC 法定性鑒別肉蓯蓉； ②通過HPLC 法測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、鹽酸小檗堿的含量。本試驗以黃芪益丹合劑檢測方法為研究對象， 研究復(fù)方中藥制劑定性檢測的專屬性以及定量檢測的可靠性， 為黃芪益丹合劑的檢驗分析提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

UltiMate 3000 高效液相色譜儀 （德國Thermo 公司），DAD檢測器，變色龍工作站；AUW120D 型電子天平（日本SHIMADZU公司）；DZKW-4 電子恒溫水浴鍋 （北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；ZF-20D 臺式紫外分析儀（上海貝侖儀器設(shè)備有限公司）

1.2 主要試劑與對照品

松果菊苷對照品（批號19092501，含量87.15%），毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號19031302，含量93.12%），鹽酸小檗堿對照品 （批號19050604， 含量94.08%）， 阿魏酸對照品 （批號110773-201604，含量99.0%），阿魏酸對照品購于中國食品藥品檢定研究院，其他對照品購于成都格利普生物科技有限公司；甲醇、乙腈、磷酸為色譜純。

1.3 藥材

黃芪、當(dāng)歸、益母草、丹參、黃柏、茵陳、茯苓、巴戟天、肉蓯蓉、青皮、川楝子等11 味藥材均購于安國藥材市場，經(jīng)本公司質(zhì)控部鑒別均符合《中華人民共和國獸藥典》2015 版（二部）有關(guān)項下規(guī)定。

1.4 樣品制備方法

黃芪益丹合劑樣品的制備：處方中黃芪200g、當(dāng)歸150g、益母草100g、丹參100g、黃柏150g、茵陳100g、茯苓50g、巴戟天50g、肉蓯蓉50g、青皮25g、川楝子25g，共計11 味，總重1kg。 將配好的藥材加水煎煮2 次，每次煎煮時間2h，加水量分別為10倍和8 倍，合并煎液，濾過，濾液濃縮至1000mL 左右，加入0.6%苯甲酸鈉，放冷，靜置24h，濾過，濾液加水制成1000mL，即得。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性鑒別

2.1.1 肉蓯蓉的薄層鑒別

取黃芪益丹合劑供試品5mL，水浴蒸干，加甲醇20mL，超聲處理20min，過濾，蒸干，殘渣加甲醇5mL 使溶解，作為供試品溶液；取松果菊苷對照品適量，加甲醇制成每1mL 含1mg 的溶液，作為對照品溶液；另按供試品工藝制備不含肉蓯蓉的陰性樣品，同法制成陰性對照溶液；照2015 版《中華人民共和國獸藥典》[2]“附錄0502”薄層色譜法試驗，吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各2μL，分別點于同一聚酰胺薄層板上，以甲醇-醋酸-水（2∶1∶7）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。 結(jié)果見圖1。 由圖1 可知，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。

圖1 肉蓯蓉TLC 圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫程序見表1；流速：1.0mL/min；檢測波長：全波長掃描（0～9min 毛蕊異黃酮葡萄糖苷檢測波長為260nm，9 ～13min 阿魏酸檢測波長為314nm，13～35min 鹽酸小檗堿檢測波長為345nm）； 柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2.2 制樣方式考察

精密量取供試品5mL， 置25mL 棕色量瓶中， 平行取樣3份， 編號1、2、3， 分別加入100%甲醇、70%甲醇和60%甲醇約20mL，超聲處理（功率200W,頻率50kHz）10min，取出，放冷，定容至刻度，離心，取上清液，濾過，即得供試品溶液。

按“2.2.1”項下規(guī)定的色譜條件行分析，結(jié)果見表2、圖2。由表2、圖2 可知：用70%甲醇制備供試品溶液，目標(biāo)成分的回收率較高，故選用70%甲醇超聲處理作為供試品溶液制備方式。

表2 不同提取溶劑對含量測定的影響

圖2 不同提取溶劑對含量測定的影響

2.2.3 供試品溶液及陰性樣品溶液的制備

精密量取本品5mL，置于25mL 棕色容量瓶中，加70%甲醇約20mL，超聲處理（功率200W,頻率50kHz）10min，取出，放冷，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，離心取上清液，0.45μm 微孔濾膜濾過，即得。 按“1.4 樣品制備方法”項下的工藝制備不含黃芪、當(dāng)歸、黃柏的陰性樣品，并按上述供試品溶液的制備方法制備陰性樣品對照溶液。

2.2.4 對照品溶液的制備

圖3 不同波長下各成分HPLC 色譜圖

取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品、 阿魏酸對照品和鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL 含毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品50μg、 阿魏酸對照品50μg 和鹽酸小檗堿對照品15μg 的混合對照品溶液，即得。

2.2.5 專屬性考察

分別精密吸取對照品溶液、 陰性對照品與供試品溶液各10μL，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。 對專屬性進(jìn)行考察。 結(jié)果表明，陰性樣品對測定無干擾，結(jié)果見圖3。

2.2.6 線性關(guān)系考察

精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品50mg、阿魏酸對照品50mg 和鹽酸小檗堿對照品15mg，置100mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品儲備液。 精密量取混合對照品儲備液1mL，依次用甲醇稀釋至50mL、25mL、12.5mL、5mL、2.5mL、2mL，作為混合對照溶液，分別精密量取10μL，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以濃度作為橫坐標(biāo)（X，μg/mL）,色譜峰峰面積作為縱坐標(biāo)（Y，mAU★min），進(jìn)行線性回歸計算。

結(jié)果： 毛蕊異黃酮葡萄糖苷 （260nm） 回歸方程為Y=0.5492X-0.1132，R2=0.9999， 在9.3604～234.01μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好； 阿魏酸 （314nm） 回歸方程為Y=0.2425X-0.155，R2=0.9997，在9.7496～243.74μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；鹽酸小檗堿 （345nm） 回歸方程為Y=1.9199X+0.1333，R2=1，在3.9514～98.785μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.7 重復(fù)性考察

取同一批樣品（批次：20200701），按取樣量0.5：1.0：1.5 的比例分別取樣，各平行3 份，按供試品溶液制備的方法制備，照上述色譜條件測定，分別計算毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸和鹽酸小檗堿的平均含量及平均含量的RSD 值， 考察方法的重復(fù)性。測得平均含量分別為：毛蕊異黃酮葡萄糖苷=0.113mg/mL,RSD=0.90%；阿魏酸=0.130mg/mL,RSD=0.93%；鹽酸小檗堿=0.202mg/mL,RSD=0.75%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 精密度考察

取同一供試品溶液，按確定的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，分別記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸和鹽酸小檗堿色譜峰峰面積，并分別計算峰面積的RSD 值，考察方法的精密度。 測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸和鹽酸小檗堿色譜峰峰面積RSD 值分別為：0.22%、0.26%和0.16%，表明該方法精密度良好。

2.2.9 穩(wěn)定性考察

取同一供試品溶液，分別于0,4,8,12,18,24h 進(jìn)樣1 次，分別記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸和鹽酸小檗堿色譜峰峰面積，并分別計算峰面積的RSD 值，考察方法的穩(wěn)定性。 測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸和鹽酸小檗堿色譜峰峰面積RSD 值分別為：0.52%、0.56%和0.47%， 表明供試品溶液在24h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.10 準(zhǔn)確度考察

精密量取“2.2.5”項下混合對照儲備液1.0mL 加甲醇稀釋并定容至10mL， 作為混合對照溶液。 取同一批樣品 （批次：20200701）作為供試品，平行9 份，每份2.0mL，平均分成3 組。第一組加混合對照溶液1.0mL， 第二組加混合對照溶液3.0mL，第三組加混合對照溶液5.0mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項下色譜條件下測定。 記錄峰面積并計算回收率，考察方法的準(zhǔn)確度。 測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸和鹽酸小檗堿的回收率均在98%～102%之間。 結(jié)果：

毛蕊異黃酮葡萄糖苷平均回收率=99.56%，RSD=0.98%（n=9）；阿魏酸平均回收率=100.21%， RSD=1.22%（n=9）；鹽酸小檗堿平均回收率=100.06%，RSD=0.77%（n=9）， 結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度符合要求。

2.3 樣品測定

取9 批樣品，每批平行樣個數(shù)n=3，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項下色譜條件下測定，計算含量。 結(jié)果見表3：

表3 各成分含量測定結(jié)果

3 討論

本試驗參考肉蓯蓉在《中華人民共和國獸藥典》[2]中標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定以及研究文獻(xiàn)[3-4]，通過TLC 薄層色譜條件的摸索，篩選出最佳展開條件，完成肉蓯蓉TLC 鑒別檢驗方法的制定。 在探索過程中發(fā)現(xiàn)：供試品色譜中，在與松果菊苷對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點。 而陰性對照液色譜中，在與松果菊苷對照品色譜相應(yīng)的位置上，未顯示熒光斑點。 由此可見，松果菊苷可作為鑒別肉蓯蓉的專屬指標(biāo)。

中醫(yī)藥理論強調(diào)的是整體觀念的原則。 中藥復(fù)方制劑中化學(xué)成分復(fù)雜，有效成分往往難以確認(rèn)，只對單一成分進(jìn)行檢測，無法體現(xiàn)制劑整體質(zhì)量情況以及中醫(yī)藥的整體性特點， 所以中藥復(fù)方制劑質(zhì)量評價應(yīng)進(jìn)行多組分檢測。 在黃芪益丹合劑處方中黃芪、當(dāng)歸、黃柏是三大主要組分，而毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸和鹽酸小檗堿分別為黃芪、當(dāng)歸、黃柏的主要活性成分。 經(jīng)查閱文獻(xiàn)[5-12]，建立了同時測定此3 種成分含量的高效液相色譜法。 對毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品、阿魏酸對照品和鹽酸小檗堿對照品進(jìn)行全波長掃描，譜圖同文獻(xiàn)[13-16]結(jié)果一致，故確定檢測波長分別為260nm、314nm、345nm，通過HPLC 全波長掃描同時測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸和鹽酸小檗堿的含量。 建立中藥制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和分析手段時，應(yīng)采取準(zhǔn)確、靈敏、可行的分析方法，測定多種有效成分，才能更加科學(xué)客觀的評價中藥制劑質(zhì)量。 隨著中藥化學(xué)成分研究分析方法學(xué)與制劑工藝學(xué)研究的不斷深入和發(fā)展，中藥制劑分析的靈敏度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性，將會逐步提高，以滿足中藥制劑質(zhì)量控制的實際需求。

4 結(jié)論

中藥制劑分析以中藥理論為指導(dǎo)， 應(yīng)用現(xiàn)代分析理論和方法， 研究中藥制劑質(zhì)量， 如何確定質(zhì)量評價的指標(biāo)是其關(guān)鍵問題。 本試驗通過TLC 定性鑒別和HPLC 定量測定來進(jìn)行組分檢測方法的研究， 樣品前處理條件以及系統(tǒng)適用性均經(jīng)過對比驗證，最終選擇以70%甲醇作為制樣溶劑，影響因素及中間精密度考察RSD 值均小于2%，結(jié)果表明此檢測方法專屬性高、準(zhǔn)確可靠，可為黃芪益丹合劑提供有效的質(zhì)量控制方法。 中藥制劑有已知成分又有未知成分，不確定因素諸多，分析難度大，存在問題多，極具挑戰(zhàn)性，對藥物分析工作者而言任重而道遠(yuǎn)。