代靜瀾 李朵 牟海剛 華蕾

(中國人民解放軍陸軍第958醫(yī)院心血管內(nèi)科，重慶 400020)

代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)是糖類和脂質(zhì)等多種代謝成分異常聚集而出現(xiàn)的比較復(fù)雜的代謝紊亂癥候群，已逐漸成為威脅人類健康與生活質(zhì)量的重要慢性非傳染性疾病[1-3]。MS的具體發(fā)病機制目前尚不完全明確，不少研究者認為機體的營養(yǎng)過剩和缺氧等造成細胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)等參與了MS的發(fā)病機制，而自噬作為一種細胞對多種應(yīng)激反應(yīng)的適應(yīng)性反應(yīng)，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等應(yīng)激反應(yīng)的重要環(huán)節(jié)，與MS的發(fā)病具有一定的聯(lián)系[4-5]。已有研究[6]表明，在出現(xiàn)胰島素抵抗(insulin resistance，IR)時，機體能通過增加自噬以防止胰島P細胞受傷害，自噬在MS發(fā)生和發(fā)展中的作用越來越受到醫(yī)學(xué)研究者們的重視，自噬的調(diào)控可能是治療MS的新的切入點，這也是臨床醫(yī)師研究的重點。外周血自噬相關(guān)炎癥因子微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)和p62是自噬標志性蛋白，其表達水平可反映機體自噬功能的強弱，自噬相關(guān)炎癥因子Atg5是自噬活動啟動的重要調(diào)節(jié)基因，已被研究證實其與MS的發(fā)生與發(fā)展具有明顯的相關(guān)性[7]。目前國內(nèi)關(guān)于MS與自噬相關(guān)炎癥因子表達水平之間關(guān)系的研究報道較少，因此，本研究嘗試探討自噬相關(guān)炎癥因子表達水平與MS之間的相關(guān)性，以期為臨床診斷提供一些理論參考，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018年7月—2019年6月于中國人民解放軍陸軍第958醫(yī)院收治的MS患者96例作為研究組，其中男性53例，女性43例，年齡32～78歲，平均年齡(59.23±8.77)歲。納入標準：(1)患者符合2005年國際糖尿病聯(lián)盟頒布的有關(guān)MS的診斷標準[8]；(2)年齡>18歲，且病歷資料完整者。排除標準：(1)精神異常和溝通障礙患者；(2)存在嚴重肝腎疾病、惡性腫瘤、嚴重感染性疾病和出血性疾病患者；(3)近1周有手術(shù)治療患者；(4)有藥物濫用史和從事有毒有害作業(yè)者；(5)妊娠及哺乳期婦女。采用1∶1配對病例對照研究方法，按照性別和年齡相差≤3歲匹配，收集同期在本院進行健康體檢的人群96例作為對照組，納入性別、年齡與研究組相等的健康體檢人群入組，排除與研究組患者存在血緣關(guān)系者，患有MS、糖尿病、高脂血癥、高血壓、心腦血管疾病或其他嚴重器質(zhì)性疾病者，妊娠及哺乳期婦女。對照組中男性49例，女性47例，年齡30～79歲，平均年齡(60.15±9.03)歲，兩組性別和年齡等比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。患者此次研究在醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過的情況下開始實施，研究內(nèi)容設(shè)計符合《世界赫爾辛基宣言》，患者均知情同意參與本研究。

1.2 方法

1.2.1 體格檢查和IR程度評估

現(xiàn)場測量患者的體重、身高、腰圍、臀圍、收縮壓和舒張壓等人體參數(shù)，采用身高體重儀及臺式水銀柱血壓計進行測量，計算體重指數(shù)(BMI)=體重(kg)/身高2(m2)，并采用穩(wěn)態(tài)模型評估法對患者的IR程度進行評估。

1.2.2 血液一般生化指標檢測

現(xiàn)場采集兩組入選者清晨空腹靜脈血，經(jīng)離心和分離后將血清置于微量離心管放置在-80 ℃環(huán)境中冷凍保存。血糖測定采用葡萄糖氧化酶法，采用美國強生公司快速血糖儀(ONE TOUCH SureStep)測定患者空腹血糖(FPG)；采用奧林巴斯AU400全型自動生化分析儀對患者甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平進行測定。采用ELISA試劑盒利用雙抗夾心法檢測血清炎性因子白介素-1β(IL-1β)水平，試劑盒均由上海恒遠生物技術(shù)發(fā)展有限公司提供。

1.2.3 細胞自噬相關(guān)炎癥因子檢測方法

收集患者清晨空腹肘靜脈血，采用蛋白質(zhì)印跡法測定自噬相關(guān)炎癥因子LC3、p62和Atg5蛋白表達水平，基本操作方法為：采用人全血蛋白提取試劑盒提取外周靜脈血總蛋白質(zhì)，BCA法測定蛋白濃度，并以10 g/L Buffer緩沖液溶解。以10 μg為上樣量進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，40 V預(yù)電泳30 min；隨后調(diào)整為電壓90 V電泳60 min。電泳完畢后，經(jīng)麗春紅染液染色觀察條帶分離狀態(tài)，轉(zhuǎn)移凝膠上條帶通道筆直和分離清晰的蛋白條帶至硝化纖維素膜上。5%的脫脂牛奶溶液封閉90 min，加入一抗，4 ℃孵育過夜；含吐溫-20的磷酸鹽(PBST)緩沖液清洗，加入二抗，28 ℃孵育90 min?？贵w均由Abcam公司提供，Atg5、p62和β-actin為單條帶，LC3為雙條帶，分別為LC3-Ⅱ(相對分子質(zhì)量為17 000)和LC3-Ⅰ(相對分子質(zhì)量為19 000)。LC3最終表達量以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的結(jié)果進行統(tǒng)計。二抗孵育完畢后，PBST緩沖液清洗，進行顯影和測量。所得蛋白印跡圖片采用Image J圖像分析軟件掃描，分析灰度值，各觀察指標的相對表達量為觀察指標的灰度值與β-actin的灰度值之比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般情況比較

比較研究組和對照組的體格檢查和血液生化指標結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組在身高方面的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但研究組患者的體重、BMI、收縮壓、舒張壓、腰圍、臀圍、腰臀比、FPG、TC、TG、LDL-C、IR以及IL-1β均高于對照組(P<0.05)，HDL-C水平低于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組患者體格檢查和血液生化指標比較

2.2 兩組患者自噬相關(guān)炎癥因子表達水平比較

兩組自噬相關(guān)炎癥因子測定結(jié)果顯示，研究組Atg5和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達水平明顯高于對照組(P<0.05)，p62表達水平明顯低于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 兩組患者自噬相關(guān)炎癥因子Atg5、LC3和p62的表達水平

2.3 自噬相關(guān)炎癥因子LC3、p62和Atg5表達水平與MS患者臨床指標的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Atg5的表達分別與BMI、收縮壓、舒張壓、FPG、TC、TG、LDL-C、IR和IL-1β均呈正相關(guān)性(P<0.05)，與HDL-C呈負相關(guān)性(P<0.05)；而自噬相關(guān)炎癥因子p62與BMI、收縮壓、舒張壓、FPG、TC、TG、LDL-C、IR和IL-1β均呈負相關(guān)性(P<0.05)，與HDL-C呈正相關(guān)性(P<0.05)，見表3和圖1。

圖1 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Atg5分別與IR和IL-1β的相關(guān)性

表3 LC3、p62和Atg5表達水平與MS患者臨床指標的相關(guān)性

2.4 MS患者自噬相關(guān)炎癥因子的多元線性回歸分析

進一步分別以自噬相關(guān)炎癥因子LC3、p62和Atg5的表達水平為因變量，年齡、性別、身高、體重、BMI、收縮壓、舒張壓、腰圍、臀圍、腰臀比、FPG、TC、TG、LDL-C、HDL-C、IR和IL-1β為自變量，行多元逐步回歸分析結(jié)果顯示，LC3表達量的重要相關(guān)因素為IR、TG和IL-1β；p62和Atg5表達量的重要相關(guān)因素均為IR和IL-1β，見表4。

表4 多元逐步回歸分析MS患者外周自噬相關(guān)炎癥因子表達水平的相關(guān)因素

3 討論

自噬是細胞對多種應(yīng)激反應(yīng)的適應(yīng)性反應(yīng)，是一種細胞應(yīng)激下的自我保護和防御機制，其在維持機體正常的心血管功能中具有重要作用[9]。大量研究[10-11]表明自噬與MS之間存在密切關(guān)系，并參與各種心血管損害的發(fā)生和發(fā)展。本研究通過對兩組自噬相關(guān)炎癥因子LC3、p62和Atg5的檢測，結(jié)果顯示，研究組Atg5和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達水平明顯高于對照組，p62表達水平明顯低于對照組，結(jié)果表明MS患者外周血存在自噬相關(guān)炎癥因子LC3、p62和Atg5的異常表達。LC3是自噬的標志性蛋白，存在LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種亞型，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ可反映LC3的活性狀態(tài)，且是研究自噬的較好標志物[12-13]。p62是一種在多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮作用的支架蛋白，在LC3介導(dǎo)下，可與LC3結(jié)合形成自噬小體，最后自噬小體與溶酶體相互融合完成蛋白的降解。當出現(xiàn)細胞自噬反應(yīng)時，p62聚集體降解增加，導(dǎo)致p62的蛋白水平明顯降低[14-15]。Atg5是細胞自噬通路上的關(guān)鍵因子，參與Atg12-Atg5泛素樣蛋白結(jié)合系統(tǒng)的組成，Atg5蛋白在自噬體的形成過程中具有重要作用。機體Atg5蛋白表達量的增加即意味著細胞自噬過程的抑制?；A(chǔ)研究[16]表明，用3-甲基腺嘌呤抑制自噬或低表達Atg5，無論是否提供外源性脂質(zhì)油酸鹽，肝細胞三酰甘油和脂滴含量均比對照組更高。同時，在用干擾核糖核酸干擾Atg5的肝細胞中，三酰甘油分解減少和脂肪酸的β氧化明顯降低?？梢娂毎允删哂姓{(diào)控肝臟細胞脂質(zhì)代謝的功能，參與了脂質(zhì)的儲存調(diào)節(jié)和分解代謝。且自噬可通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以調(diào)控胰島素信號通路，減緩IR。Cui等[17]通過高脂高糖飼養(yǎng)SD大鼠制備MS動物模型，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，MS大鼠腸系膜動脈內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78和C/EBP同源蛋白均升高，與此同時，自噬相關(guān)炎癥因子Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62均升高。當MS患者機體處于高血糖、脂質(zhì)代謝異常、高血壓和IR狀態(tài)時，細胞自噬啟動代謝調(diào)節(jié)機制，產(chǎn)生自噬反應(yīng)清除毒性代謝物和蛋白聚集體等，此時患者細胞自噬活性較強，其相關(guān)蛋白LC3和Atg5表達量較高，p62表達量降低。這與有學(xué)者[18]在研究報告中指出，在遺傳性和高脂飲食所致的肥胖鼠中，脂肪組織自噬相關(guān)蛋白LC3、Atg5、Atg6和Atg7水平均表現(xiàn)為明顯上升的結(jié)果比較一致。

本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示，自噬相關(guān)炎癥因子LC3、p62和Atg5與MS患者的收縮壓、BMI和IR等多項指標有明顯相關(guān)性。MS的血脂異常包括：TG升高、HDL-C低下、LDL-C正?；蜉p度升高，以及LDL-C亞型中的小而密LDL-C比例升高，加上IR的存在，可促使三酰甘油分解產(chǎn)生較多游離脂肪酸，游離脂肪酸的增多反過來可使肝臟合成三酰甘油的作用加強，進一步加劇高三酰甘油血癥，形成惡性循環(huán)[19]。MS患者機體自噬反應(yīng)能通過抵御脂質(zhì)過氧化應(yīng)激和炎性應(yīng)激等不利條件，及時清除異物，促進脂質(zhì)的分解代謝，發(fā)揮調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、IR、心肌細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和氧化應(yīng)激的作用[20]。進一步的多元逐步回歸分析結(jié)果顯示，LC3表達量的重要相關(guān)因素為IR、TG和IL-1β；p62和Atg5表達量的重要相關(guān)因素均為IR和IL-1β。研究表明，細胞自噬引起的細胞死亡還能導(dǎo)致諸多促炎因子釋放，促進炎性反應(yīng)。MS的發(fā)病是一個慢性炎癥和進展性的過程，本研究中MS患者的IL-1β水平是LC3、p62和Atg5三個因子的重要相關(guān)因素，自噬相關(guān)炎癥因子LC3、p62和Atg5表達水平與MS患者IR、TG和IL-1β的明顯相關(guān)性，可看出細胞自噬相關(guān)炎癥因子不僅與IL-1β和IR等指標關(guān)系密切，還可能成為MS發(fā)生和發(fā)展過程中的重要標志物，對MS患者外周血自噬相關(guān)炎癥因子表達量的調(diào)控有可能成為治療MS的新靶點，對自噬相關(guān)炎癥因子p62、LC3和Atg5蛋白在人外周血表達水平的研究也為在臨床研究自噬開辟了一個新的通路。

綜上所述，MS患者自噬相關(guān)炎癥因子LC3、p62和Atg5蛋白均呈現(xiàn)高表達，并與患者一般臨床指標存在明顯相關(guān)性，對于研究MS的發(fā)病機制和評估患者病情具有一定的指導(dǎo)價值。