王璠,張莉

胃癌是世界上高發(fā)的惡性腫瘤之一，死亡率高，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素、多階段、多基因變異的綜合病變過程[1]。現(xiàn)代中醫(yī)學家認為臟腑陰陽失調(diào)、氣滯血瘀、肺氣抑郁等是多種癌癥發(fā)生的主要病因[2]。因此，應該以扶正培本、清熱解毒、活血化瘀為中醫(yī)藥治療癌癥的基本原則。大黃酸(Rhein)是廖科植物藥用大黃的主要成分之一，具有抗腫瘤[3]、抗菌[4]、免疫抑制[5]、抗炎[6]等活性。研究表明大黃酸對于肝癌[7]、宮頸癌[8]等都有一定的抑制作用，但是大黃酸對于胃癌細胞生物學行為的影響研究甚少，故本研究將分析大黃酸對人胃癌細胞(SGC-7901)增殖、遷移、侵襲、凋亡的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細胞株SGC-7901(CL-0206)購于武漢普諾生命科技有限公司；大黃酸(R24531，HPLC≥95%)購于上海吉至生化科技有限公司；細胞培養(yǎng)基RPMI-1640(PM150110)、胎牛血清(164210-500)均購于上海雅吉生物科技有限公司；胰蛋白酶(T4049)購于Sigma；Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑(C0526)、CCK-8試劑盒(C0038)、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(C1062M)、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(RG027)購于碧云天生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR037A)、熒光定量PCR檢測試劑盒(DRR096A)購于大連寶生物工程有限公司；FSCN1-3′ UTR WT和FSCN1-3′ UTR MUT由昆明擎科生物有限公司設(shè)計并合成；miR-29c-3p mimics及NC mimics、miR-29c-3p inhibitor及NC inhibitor由上海吉瑪制藥公司設(shè)計并合成。GAPDH(AF5009)抗體購于碧云天生物；FSCN1抗體(D120251)購于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

SGC-7901細胞使用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，然后取處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

取處于對數(shù)生長期的SGC-7901細胞(密度為2×105cells/孔)接種于6孔板中，實驗分組為：①NC組、miR-29c-3p mimics組、NC mimics組；②Rhein組、Rhein+miR-29c-3p inhibitor組、Rhein +NC inhibitor組；③野生型質(zhì)粒對照組(轉(zhuǎn)染NC mimics和FSCN1-3′ UTR WT)、野生型實驗組(轉(zhuǎn)染miR-29c-3p mimics和FSCN1-3′ UTR WT)、突變型質(zhì)粒對照組(轉(zhuǎn)染mimics-NC和FSCN1-3′UTR MUT)、突變型質(zhì)粒實驗組(轉(zhuǎn)染miR-29c-3p mimics和FSCN1-3′ UTR MUT)。

按照實驗設(shè)計分別轉(zhuǎn)染至SGC-7901細胞，分別用100 μL無血清RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋5 μL Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑和8 μL轉(zhuǎn)染物，室溫靜置5 min后混合，再室溫靜置5 min。將混合物均勻滴加到孔內(nèi)，并輕輕混勻。8 h后更換完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.4 qRT-PCR

通過Trizol法分離得到SGC-7901細胞總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過SYBR Green定量PCR試劑盒在7500儀器上進行qRT-PCR，使用2-ΔΔCt法計算miR-29c-3p的相對表達。具體引物序列如表1所示。

1.5 CCK-8實驗檢測細胞的增殖活性

取處于對數(shù)生長期的SGC-7901細胞(密度為2×103cells/孔)接種于96孔板中，進行大黃酸處理或轉(zhuǎn)染NC/miR-29c-3p mimics、NC/miR-29c-3p inhibitor后，培養(yǎng)0、24、48、72 h測定各孔的吸光值(每孔加入20 μL CCK-8試劑，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，使用酶標儀測定吸光度值)。

1.6 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力

取處于對數(shù)生長期的SGC-7901細胞接種于24孔板中，細胞密度為2×104cells/孔。在在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)24 h。使用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，1×PBS清洗后，隨機選擇5個視野，計數(shù)下室染色細胞，并評估細胞遷移能力。

將提前凍存的Matrigel膠置于4 ℃直至溶成液態(tài)，使用400 μL無血清培養(yǎng)基對50 μL Matrigel膠原液進行稀釋并輕輕搖晃混勻。取50 μL稀釋液加至向Transwell小室的上室中,置于37 ℃培養(yǎng)箱中進行孵育，當凝固后加入100 μL無血清培養(yǎng)基浸潤凝膠，吸棄。

取處于對數(shù)生長期的SGC-7901細胞接種于24孔板中，細胞密度為2×104cells/孔。然后取細胞懸液100 μL加至Transwell小室上層，Transwell小室下層中加入500 μL 10%血清完全培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)48 h后取出小室，使用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，1×PBS清洗后，隨機選擇5個視野，計數(shù)下室染色細胞。通過計數(shù)穿膜細胞數(shù)來反應細胞侵襲能力。

1.7 流式細胞術(shù)和Annexin V-FITC/PI檢測細胞凋亡

取處于生長期的SGC-7901細胞至6孔板中，進行處理或轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h。然后收集細胞，加入500 μL的1×bingding buffer對細胞進行重懸，再加入5 μL的Annexin V-FITC和10 μL的PI并輕輕搖晃混勻，室溫孵育10 min后，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡并統(tǒng)計細胞凋亡率。

1.8 雙熒光素酶報告基因檢測實驗

取處于對數(shù)生長期的SGC-7901細胞制備成單細胞懸液，接種于96孔板，采用Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑按說明書操作進行共轉(zhuǎn)染。將細胞分為以下四組：①野生型質(zhì)粒對照組(轉(zhuǎn)染NC mimics和FSCN1-3′ UTR WT)；②野生型實驗組(轉(zhuǎn)染miR-29c-3p mimics和FSCN1-3′ UTR WT)；③突變型質(zhì)粒對照組(轉(zhuǎn)染mimics-NC和FSCN1-3′ UTR MUT)；④突變型質(zhì)粒實驗組(轉(zhuǎn)染miR-29c-3p mimics和FSCN1-3′ UTR MUT)。對其培養(yǎng)24 h后裂解細胞，并按照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。。

1.9 Western blot檢測FSCN1蛋白表達情況

收集大黃酸處理或轉(zhuǎn)染NC/miR-29c-3p mimics、NC/miR-29c-3p inhibitor的細胞，使用細胞裂解液對細胞進行裂解，然后使用BCA法測定蛋白濃度。按照各樣品30 μg蛋白的上樣量進行上樣，進行SDS-PAGE電泳，電泳后用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，使用5%的脫脂奶粉封閉1 h，洗膜。加入相應的一抗(1∶1 000)，4 ℃過夜孵育，洗膜后，加入二抗(1∶3 000)，室溫孵育1 h。清洗膜后，加入ECL發(fā)光液顯影。

1.10 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 大黃酸對人胃癌細胞SGC-7901增殖、遷移、侵襲的影響

CCK-8實驗結(jié)果(圖1A)顯示，與對照組相比較，大黃酸處理24 h、48 h、72 h對細胞增殖具有一定的抑制作用，并具時間依賴性，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。同時，隨著大黃酸處理濃度的增加，增殖速率顯著降低，具有一定的劑量依賴性，為此選擇50 μM大黃酸處理48 h進行后續(xù)實驗。Transwell侵襲實驗結(jié)果(圖2B、C)顯示，與對照組相比較，不同濃度的大黃酸處理，細胞的遷移能力、侵襲能力顯著降低，具有濃度依賴性，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 大黃酸對人胃癌細胞中miR-29c-3p表達、凋亡的影響

qRT-PCR結(jié)果(圖2A)顯示，與對照組相比較，大黃酸處理后細胞中miR-29c-3p表達上升，且隨著大黃酸濃度的增加，miR-29c-3p表達上升，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

流式細胞術(shù)和Annexin V-FITC/PI檢測結(jié)果(圖2B)顯示，與對照組相比較，大黃酸處理后，細胞凋亡率上升，且隨著濃度的增加，凋亡率顯著上升，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

圖2 大黃酸對人胃癌細胞SGC-7901中miR-29c-3p表達、凋亡的影響 A：qRT-PCR檢測miR-29c-3p在細胞中的表達水平；B：流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。與大黃酸(0 μM)組比較，**P<0.01，***P<0.001

2.3 過表達miR-29c-3p對人胃癌細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響

與對照組相比較，miR-29c-3p mimics組中miR-29c-3p表達升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而對照組與NC mimics組中miR-29c-3p表達變化不明顯，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3A。CCK-8實驗結(jié)果(圖3B)顯示，與對照組相比較，處理24 h、48 h、72 h后miR-29c-3p mimics組中細胞增殖率下降(P<0.001)，具有時間依賴性，而對照組與NC mimics組間差異不明顯。Transwell實驗結(jié)果(圖3C、D)顯示，與對照組相比較，miR-29c-3p mimics組中細胞遷移和侵襲能力均降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，而對照組與NC mimics組間差異不明顯。流式細胞術(shù)和Annexin V-FITC/PI檢測結(jié)果(圖3E)顯示，與對照組相比較，miR-29c-3p mimics組中細胞凋亡率增加，而對照組與NC mimics組間差異不明顯。

圖3 過表達miR-29c-3p對SGC-7901細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響 A：qRT-PCR檢測miR-29c-3p在細胞中的表達水平；B:CCK-8試驗檢測細胞增殖能力；C、D：Transwell試驗檢測細胞遷移和侵襲能力；E:流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。與正常對照組比較，**P<0.01，***P<0.001

2.4 抑制miR-29c-3p后大黃酸對人胃癌細胞增殖、凋亡的影響

qRT-PCR檢測結(jié)果(圖4A)顯示，與Rhein組相比較，Rhein+miR-29c-3p inhibitor組中miR-29c-3p表達量降低(P<0.01)，而Rhein組與Rhein +NC inhibitor組差異不明顯。CCK-8實驗檢測結(jié)果(圖4B)顯示，與Rhein組相比較，處理24 h、48 h、72 h后Rhein +miR-29c-3p inhibitor組中細胞增殖率升高(P<0.05)，而Rhein組與Rhein +NC inhibitor組差異不明顯。

圖4 抑制miR-29c-3p后大黃酸對SGC-7901細胞增殖、凋亡的影響 A： qRT-PCR檢測miR-29c-3p在細胞中的表達水平；B：CCK-8檢測細胞增殖能力；C：流式細胞儀檢測細胞凋亡率。與大黃酸組比較，*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001

流式細胞術(shù)和Annexin V-FITC/PI實驗結(jié)果(圖4C)顯示，與Rhein組相比較，Rhein +miR-29c-3p inhibitor組中細胞細胞凋亡率降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，而Rhein組與Rhein +NC inhibitor組差異不明顯，這表明在細胞中抑制miR-29c-3p表達能夠逆轉(zhuǎn)大黃酸處理引起的細胞增殖和凋亡等生物學行為。

2.5 miR-29c-3p靶向調(diào)控FSCN1表達

通過Starbase數(shù)據(jù)庫預測到FSCN1的3′UTR與miR-29c-3p存在互補區(qū)域(圖5A)。雙熒光素酶報告基因活性檢測實驗分析顯示，與NC mimics組相比較，miR-29c-3p mimics組中miR-29c-3p能夠顯著性降低轉(zhuǎn)染FSCN1 3′ UTR WT細胞中的熒光素酶強度(P<0.01)，而轉(zhuǎn)染FSCN1 3′ UTR MUT細胞中的熒光素酶強度并沒有改變(圖5B)。Western blot檢測結(jié)果(圖5C)顯示，與對照組相比較，在miR-29c-3p mimics組中FSCN1表達顯著降低(P<0.01)。這表明miR-29c-3p可靶向調(diào)控FSCN1的表達。

圖5 miR-29c-3p靶向調(diào)控FSCN1表達 A：FSCN1與miR-29c-3p互補結(jié)合位點；B：雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，驗證miR-29c-3p與FSCN1的靶向關(guān)系；C：免疫印跡法檢測FSCN1蛋白表達。與正常對照組比較，**P<0.01

2.6 大黃酸對人胃癌細胞中FSCN1表達的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與Rhein組相比較，Rhein+miR-29c-3p inhibitor組中FSCN1蛋白表達量增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而Rhein組與Rhein+NC inhibitor組差異不明顯(圖6)。

圖6 免疫印跡法檢測大黃酸對SGC-7901細胞中FSCN1表達的影響 與大黃酸組比較，**P<0.01

3 討論

胃癌是世界范圍內(nèi)的常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率高、死亡率高，與多種因素有關(guān)[9]。臨床上常用順鉑、培美曲塞、奧沙利鉑、多西紫杉醇、氟尿嘧啶等，但具有一定的副作用[10-11]。臨床上常使用中藥輔助治療癌癥，例如，羥基喜樹堿[12]、人參皂苷Rh2[13]、四藤方[14]、蛇六谷[15]、山慈菇[16]等。

中藥大黃具有攻積滯、清濕熱、瀉火、涼血、祛瘀、解毒等功效[17]。大黃酸來源于大黃，是廖科大黃屬植物的根莖中的活性成分，屬于蒽醌類[18]。近年來，對于這些植物的藥理研究已從傳統(tǒng)的免疫學領(lǐng)域擴展至腫瘤治療方面，并進一步探究其誘導腫瘤細胞增殖和凋亡的機理。大黃酸能夠提高細胞中Ca2+含量，使得線粒體膜電位降低，激活線粒體內(nèi)很多信號通路，促進細胞凋亡[19]。大黃酸可通過Rac1/LIMK1/cofilin信號通路有效抑制卵巢癌細胞的侵襲和遷移[20]。本研究結(jié)果顯示大黃酸能夠顯著抑制人胃癌細胞增殖、遷移、侵襲，促進細胞凋亡，表明大黃酸具有抗癌作用，能夠抑制人胃癌細胞的發(fā)生、發(fā)展，與在卵巢癌[21]、宮頸癌[22]等腫瘤細胞中的研究結(jié)果相一致。

MicroRNA是一種高度保守的內(nèi)源性非編碼蛋白質(zhì)的小RNAs(約為22個核苷酸)，能夠結(jié)合到mRNA的3′UTR端來發(fā)揮其負調(diào)控基因表達的作用[23]?，F(xiàn)已證實，miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有緊密的聯(lián)系，例如細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等[24]。miR-29c-3p/KIAA1199軸通過與WBP11和PTP4A3結(jié)合來調(diào)節(jié)胃癌的遷移[25]。Dong等研究發(fā)現(xiàn)血紅素堿通過調(diào)節(jié)miR-96-5p/miR-29c-3p和MAPK/JNK信號通路抑制BGC-823胃癌細胞的增殖[26]。Chen等研究發(fā)現(xiàn)miR-29c-3p的過表達可抑制Akt3在P19胚胎癌細胞中的增殖，促進其凋亡和分化[27]。本研究中采用人胃癌SGC-7901細胞進一步進行實驗證實，過表達miR-29c-3p能夠促進細胞增殖、遷移和侵襲并且抑制細胞凋亡。當抑制細胞中miR-29c-3p的表達后，然后使用大黃酸進行處理，引起細胞增殖、遷移、侵襲，抑制細胞凋亡。這表明miR-29c-3p過表達能夠抑制人胃癌SGC-7901細胞的生物學功能。

miR-29c-3p是miR-29家族的重要成員，在多種腫瘤中處于低表達狀態(tài)[25,27]。通過Starbase數(shù)據(jù)庫預測到miR-29c-3p能夠靶向調(diào)控FSCN1。FSCN1在人乳腺癌[28]、胃腸道腫瘤[29]、肺癌[30]和卵巢癌[31]中高表達。在乳腺癌細胞中FSCN1的表達與侵襲性的生物學行為相關(guān)[32]。猜測miR-29c-3p可能通過靶向FSCN1來發(fā)揮抑癌作用。

綜上所述，大黃酸能夠參與人胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡能力，其具體機制為大黃酸通過上調(diào)miR-29c-3p的表達，降低FSCN1蛋白表達，進而抑制胃癌細胞的生物學行為，后續(xù)將進一步進行動物實驗研究，為開發(fā)抗胃癌藥物提供科學的理論基礎(chǔ)。