劉昀彤，丁茹，梁舒，馬小惠，鄧斐爾，宋田田，閆東梅

(吉林大學基礎(chǔ)醫(yī)學院 免疫學系，長春 130000)

隨著免疫細胞在活化和分化期間的代謝重編程過程被發(fā)現(xiàn)，“免疫代謝”這一概念被提了出來。糖代謝重編程通過多種機制調(diào)控免疫細胞的活化和功能，包括糖酵解關(guān)鍵酶的非代謝功能、代謝中間產(chǎn)物調(diào)控表觀遺傳修飾和信號傳導等。增強的糖酵解和谷氨酰胺驅(qū)動的三羧酸(tricarboxylic acid, TCA)循環(huán)已被證明是卡介苗(bacillus Calmette-Guérin vaccine，BCG)誘導訓練免疫的重要途徑，但這一過程在單核巨噬細胞系統(tǒng)訓練免疫中的具體機制尚不清楚。

1 BCG誘導單核巨噬細胞系統(tǒng)發(fā)生訓練免疫

1.1 訓練免疫一直以來，先天免疫系統(tǒng)被認為沒有免疫記憶。然而，Netea等[1]基于BCG、β-葡聚糖等誘導先天免疫發(fā)揮非特異性保護作用的研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物也存在先天免疫記憶，并將其稱為“訓練免疫”，即先天免疫細胞在第1次接觸病原體時被訓練，當它們再次接受同一種或不同病原刺激時宿主表現(xiàn)出更高的反應(yīng)性和更強的抵抗力。訓練免疫不針對特定病原體，而是主要依賴于表觀遺傳修飾介導的先天免疫細胞功能的長期激活，但這種狀態(tài)并不能永久維持[2]。

1.2 BCG通過訓練單核巨噬細胞系統(tǒng)發(fā)揮非特異性保護作用BCG是唯一被證明對結(jié)核病有效的疫苗，自1970年以來，BCG免疫療法成為了治療非肌肉浸潤性膀胱癌的“黃金標準”[3]。大量臨床隨機試驗發(fā)現(xiàn)，BCG可以抵抗其他病原體的感染[4]，比如對人類皮膚利什曼病和瘧疾的非特異性作用[5]。流行病學統(tǒng)計資料顯示，接種BCG可降低由非結(jié)核分枝桿菌引起的感染和死亡。來自小鼠的實驗研究表明，BCG可以抵抗各種DNA和RNA病毒感染[6]。最近發(fā)現(xiàn)，BCG依靠訓練免疫清除結(jié)核分枝桿菌[7]，而其發(fā)揮的非特異性保護作用也是由單核巨噬細胞系統(tǒng)產(chǎn)生的訓練免疫所介導[8]。

接種BCG可改變?nèi)藛魏思毎墓δ軤顟B(tài)，表現(xiàn)為二次刺激后表面活化標志和細胞因子的上調(diào)，并證明發(fā)生在組蛋白的修飾是在轉(zhuǎn)錄水平對相關(guān)基因表達進行了長期調(diào)控。同時小鼠實驗表明，BCG誘導的非特異性保護不依賴于T細胞和B細胞[9]。相關(guān)研究檢測了BCG誘導的體外人單核細胞全基因組的一項組蛋白修飾標記，發(fā)現(xiàn)除了炎癥相關(guān)基因，包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/serine threonine kinase，PI3K/Akt)信號通路在內(nèi)的多種信號通路的相關(guān)基因在表觀遺傳學水平被上調(diào)，這與β-葡聚糖誘導的訓練免疫相似[10]。

1.2.1 單核巨噬細胞系統(tǒng)與免疫代謝 目前認為巨噬細胞在極化的過程中有2個極端：M1型經(jīng)典途徑和M2型替代途徑，前者通常分泌炎性分子并發(fā)揮殺滅病原微生物和抗腫瘤的功能，后者則主要發(fā)揮抑炎作用，促進損傷組織修復(fù)和纖維化以及腫瘤發(fā)展等病理過程[11]。隨著免疫細胞在活化和分化期間代謝重編程過程被發(fā)現(xiàn)，研究者提出了“免疫代謝”這一概念。研究表明，M1型巨噬細胞表現(xiàn)為糖酵解增強和乳酸產(chǎn)生增加，而M2型巨噬細胞似乎依賴于氧化磷酸化、脂肪酸攝取和β-氧化[12]。

1.2.2 單核巨噬細胞系統(tǒng)的訓練機制 先天免疫細胞依靠表達多種模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)及其組合將刺激信號傳入后，通過不同信號通路介入表觀遺傳機制，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄過程，繼而促進促炎細胞因子的生成，形成先天免疫記憶[13-14]，其中代謝相關(guān)信號通路以及代謝相關(guān)酶的基因在轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)也是組蛋白表觀遺傳修飾的結(jié)果，這種免疫和代謝系統(tǒng)的長期訓練起始于造血干細胞等前體細胞[15]。另外，某些代謝產(chǎn)物可以調(diào)節(jié)表觀遺傳酶的活性從而影響訓練免疫[16]，因而代謝重編程與表觀遺傳修飾的相互作用是介導訓練免疫的重要分子機制。表觀遺傳是指在一級結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變的情況下，DNA甲基化、組蛋白共價修飾、染色質(zhì)重塑、非編碼RNA調(diào)控等修飾作用導致的生物性狀產(chǎn)生可遺傳變異。通過各種表觀遺傳修飾的相互作用可促進轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶Ⅱ的招募，從而介導了訓練免疫中二次刺激后的快速轉(zhuǎn)錄，而轉(zhuǎn)錄因子也反過來募集組蛋白修飾酶和染色質(zhì)重塑因子[2]。目前人們認為，表觀遺傳學、轉(zhuǎn)錄組學和代謝重編程共同介導訓練免疫[14]。

2 糖代謝重編程和訓練免疫

Penkov等[17]認為細胞代謝的變化可能遵從低等動物到哺乳動物的先天免疫記憶的祖?zhèn)髟瓌t。最近的研究表明，增強的糖酵解及由谷氨酰胺驅(qū)動的TCA循環(huán)已被證明是BCG和β-葡聚糖誘導訓練免疫的重要代謝途徑[18-20]。

2.1 糖酵解正常哺乳動物細胞在有氧條件下，以葡萄糖氧化磷酸化途徑代謝產(chǎn)能；在缺氧條件下，分解葡萄糖生成的丙酮酸無法進入TCA循環(huán)，而是轉(zhuǎn)化為乳酸，產(chǎn)能效率遠低于前者[21]。1927年，德國生化學家Warburg[22]發(fā)現(xiàn)，在氧氣充足的條件下，惡性腫瘤細胞糖酵解同樣活躍，這種有氧糖酵解的代謝現(xiàn)象稱為Warburg效應(yīng)。1970年，有學者發(fā)現(xiàn)LPS誘導M1型巨噬細胞也依賴于Warburg效應(yīng)[23]。

糖酵解中乳酸生成增多是訓練免疫代謝的核心標志之一[24]。BCG刺激單核細胞24 h后，乳酸生成量和葡萄糖消耗量均增加，且二者比值接近2，表明葡萄糖是乳酸的主要來源[19]，BCG誘導的單核細胞糖酵解和氧化磷酸化均增強，而不同的是，β-葡聚糖的作用結(jié)果被認證是經(jīng)典的Warburg效應(yīng)，即糖酵解增強而氧化磷酸化減弱[18]。

BCG誘導的訓練免疫依賴于Akt-mTOR途徑的糖代謝重編程，抑制這一信號通路或糖酵解限速酶以阻止糖代謝重編程都會逆轉(zhuǎn)訓練免疫的訓練效果，而在β-葡聚糖誘導的訓練模型中，表觀遺傳抑制劑也會抑制乳酸的產(chǎn)生[18]。這進一步說明代謝重編程與表觀遺傳學是相互依賴的關(guān)系。糖酵解的核心地位還體現(xiàn)在限速酶在轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳水平均上調(diào)，且通過對接種BCG的健康人外周血單核細胞中糖酵解限速酶的單核苷酸多態(tài)性位點分析，發(fā)現(xiàn)其顯著影響志愿者的訓練免疫[19]。

2.1.1 糖酵解酶在單核巨噬細胞系統(tǒng)中發(fā)揮非代謝作用 大量研究表示，增強的糖酵解除了提供能量和中間代謝產(chǎn)物，還能影響巨噬細胞的功能[25](表1)。如丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2， PKM2)二聚體可以易位至細胞核穩(wěn)定低氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF1-α)，從而調(diào)節(jié)HIF1-α靶基因的轉(zhuǎn)錄過程。維持PKM2的高活性四聚體形式，將逆轉(zhuǎn)LPS的作用[26]。但糖酵解酶在訓練免疫中是否發(fā)揮非代謝作用尚待研究。

表1 糖酵解相關(guān)酶對巨噬細胞功能的影響

2.1.2 誘導Warburg效應(yīng)的信號通路 研究證明，在BCG和β-葡聚糖誘導的訓練免疫中，Akt和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin， mTOR)組成的信號通路介導的高糖酵解速率具有關(guān)鍵的作用[19]，多種抑制劑對Akt/mTOR和糖酵解通量的抑制都削弱了單核細胞訓練效果。敲除HIF1-α的小鼠完全失去了β-葡聚糖訓練免疫，這證明HIF1-α介導的糖酵解對在體內(nèi)誘導的訓練免疫是至關(guān)重要的[18]。

mTOR作為代謝環(huán)境的傳感器[36]，通過誘導下游HIF1-α、c-Myc(一種原癌基因)調(diào)節(jié)氧化磷酸化向糖酵解轉(zhuǎn)變，且直接調(diào)節(jié)磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway，PPP)中酶的表達。上游信號傳入時，HIF由α和β亞基組成異二聚體，HIF-α/β復(fù)合物易位至細胞核，與含有缺氧反應(yīng)元件(hypoxia response element，HRE)靶基因的啟動子結(jié)合，從而啟動一系列糖代謝和免疫相關(guān)基因的表達[37]。

HIF信號轉(zhuǎn)導主要受α亞基穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)，在靜息細胞中，HIF1-α被脯氨酰羥化酶(prolyl hydroxylase，PHD)羥基化而降解。缺氧誘導因子抑制因子(factor inhibiting HIF，F(xiàn)IH)通過羥基化阻斷其形成有效的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。PHD和FIH都需要O2和α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid，α-KG)作為底物和輔助因子。缺氧會抑制PHD而使HIF1-α積累，腫瘤細胞中原癌基因的突變等也會導致HIF1-α積累[38]。在LPS激活的巨噬細胞中，HIF1-α的穩(wěn)定性是由代謝中間體調(diào)節(jié)的，PHD活性依賴于α-KG，而富馬酸鹽和琥珀酸通過抑制PHD而使HIF穩(wěn)定表達[36]，線粒體產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)也可以上調(diào)HIF1-α的表達[38]。

2.2 磷酸戊糖途徑研究表明，糖酵解代謝的上調(diào)不僅為促炎型巨噬細胞提供ATP，而且還增強PPP。PPP通過產(chǎn)生氨基酸、核苷酸和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)來支持炎癥反應(yīng)[25]。NADPH用于生產(chǎn)還原型谷胱甘肽以控制M1型巨噬細胞的氧化應(yīng)激水平[39]。BCG刺激24 h后，核糖類物質(zhì)有所增加，說明BCG也誘導磷酸戊糖途徑的增強。β-葡聚糖誘導的PPP增強并不返回到糖酵解，6-氨基煙酰胺抑制PPP也并不會影響訓練后細胞因子的增加，這表明PPP在β-葡聚糖誘導的訓練免疫中的必要性遠不如糖酵解[19-24]。

2.3 TCA循環(huán)BCG訓練的單核細胞中谷氨酸和蘋果酸濃度升高，而富馬酸和乙酰輔酶A無變化，提示增強的谷氨酰胺代謝提高了TCA循環(huán)的通量，而抑制谷氨酰胺代謝會減弱BCG和β-葡聚糖誘導的訓練免疫[19-24]，這似乎解釋了氧化磷酸化為何增強的原因。蘋果酸可以生成丙酮酸從而增加乳酸的產(chǎn)量，但已知乳酸的唯一來源是葡萄糖，所以谷氨酰胺代謝似乎并沒有參與到糖酵解中。另外，在抑制電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅴ時，未觀察到明顯影響，而當通過二氯乙酸使丙酮酸流入TCA循環(huán)時，訓練的免疫力減弱。這表明，氧化磷酸化在BCG誘導的訓練免疫中可能只與生物合成有關(guān)[19]。

LPS誘導的M1型巨噬細胞表現(xiàn)為檸檬酸鹽和琥珀酸的積累[25]。檸檬酸鹽被證明是一種炎癥信號，其積累會產(chǎn)生3種重要的促炎介質(zhì)：NO、ROS和前列腺素。有研究發(fā)現(xiàn)，長期活化的單核細胞在低糖環(huán)境下會促進檸檬酸外排來維持PPP提供不足的NADPH(圖1)，這一過程伴隨著蘋果酸的耗竭及檸檬酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼徇M入谷氨酰胺代謝的過程[40]，這能否解釋BCG誘導谷氨酸和蘋果酸積累而乙酰輔酶A沒有大量產(chǎn)生，還需要進一步研究。另外，BCG誘導細胞中ROS增多，而β-葡聚糖訓練后ROS卻減少，這是否暗示BCG相對β-葡聚糖的訓練有更強的抗感染潛力也有待驗證[41]。

β-葡聚糖也誘導谷氨酰胺代謝驅(qū)動TCA循環(huán)，實驗證明谷氨酰胺代謝增加2-羥基戊二酸(2-hydroxyglutaric acid，2-HG)、琥珀酸、富馬酸和蘋果酸的積累量，不參與丙酮酸和乳酸的生成，其中富馬酸被發(fā)現(xiàn)可以通過拮抗作用抑制組蛋白去甲基化從而誘導與β-葡聚糖誘導的訓練免疫相類似的表觀遺傳修飾[20]。包括琥珀酸、2-HG、α-KG、富馬酸、乳酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)、乙酰輔酶A在內(nèi)的糖代謝中間產(chǎn)物均被發(fā)現(xiàn)可以調(diào)控表觀遺傳修飾，其中α-KG是去甲基化酶的輔助因子，富馬酸、琥珀酸、2-HG作為α-KG的拮抗劑則促進組蛋白甲基化，而乙酰輔酶A和NAD分別是組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶和組蛋白脫乙酰酶的輔助因子[42]，這表明代謝物可以通過表觀遺傳機制影響訓練免疫的狀態(tài)。

3 BCG在臨床治療中的前景

訓練免疫可增強免疫功能從而治療疾病，如糾正腫瘤、各種病原感染和敗血癥中的免疫麻痹，但也可以促進一些慢性代謝性炎癥疾病的持續(xù)發(fā)展。如DM患者持續(xù)的高血糖狀態(tài)可以訓練巨噬細胞產(chǎn)生免疫記憶，繼而可能促進動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展。

然而BCG誘導的訓練免疫卻對DM患者有長遠的治療效果。最近報道的Ⅰ期隨機臨床試驗發(fā)現(xiàn)，接受至少2次BCG接種的1型DM患者在大約3年后血糖恢復(fù)正常水平，其治療效果可持續(xù)5年以上。1型DM患者中高度活躍的氧化磷酸化導致葡萄糖利用不足，BCG通過激活有氧糖酵解，增加外周血細胞的葡萄糖消耗從而降低血糖，這種降血糖方式有效規(guī)避了胰島素帶來的低血糖風險。BCG的治療機制也可能部分依賴于TNF的表觀遺傳激活Treg和選擇性誘導攻擊胰島細胞的CTL死亡，從而改善自身免疫狀態(tài)[43]。此外，BCG可以降低小鼠血漿膽固醇水平并延緩動脈粥樣硬化的進程[44]。

注：PFK-1，6-磷酸果糖激酶 1(phosphofructokinase 1)；PEP，磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate)；LDH，乳酸鹽脫氫酶(lactic dehydrogenase)；NADP,煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)；PYC，丙酮酸載體(pyruvic acid carrier)；PDH，丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase)；DIC，二羧酸鹽載體(dicarboxylate carrier)；CIC，檸檬酸載體(citric acid carrier)；IDH，異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase)；MDH，蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase)；SDH，琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase)；IRG1，免疫應(yīng)答基因1(immune-responsive gene 1)；*標注的是BCG誘導后上調(diào)的代謝物。圖1 BCG在巨噬細胞中參與糖代謝途徑示意

BCG誘導的訓練免疫和糖代謝重編程對各種病原感染、腫瘤、敗血癥和一些慢性代謝性炎癥疾病表現(xiàn)出有益的作用。那么如何利用代謝組學技術(shù)和表觀遺傳學技術(shù)尋找治療慢性炎癥疾病的新靶點，如何最大化利用疫苗或其他刺激物誘導訓練免疫發(fā)揮非特異性保護作用將是未來的研究方向之一。