關(guān)紅 董勁春 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心 （北京 100081）

內(nèi)容提要： 抗人球蛋白檢測(cè)試劑作為高風(fēng)險(xiǎn)體外診斷試劑，有重要的臨床檢測(cè)意義?；谠擃愒噭┳陨硖攸c(diǎn)，文章旨在通過對(duì)產(chǎn)品注冊(cè)申報(bào)過程中原材料研究、反應(yīng)體系、性能評(píng)估、陽(yáng)性判斷值研究及說明書撰寫規(guī)范等部分資料要求進(jìn)行解析，以期對(duì)產(chǎn)品的研發(fā)和注冊(cè)工作提供一些思路和幫助。

抗人球蛋白試驗(yàn)也稱Coombs試驗(yàn)，是臨床上進(jìn)行血型血清學(xué)檢測(cè)的經(jīng)典方法，包括直接抗人球蛋白試驗(yàn)（Direct Anti-Globulin Test，DAT）和間接抗人球蛋白試驗(yàn)（Indirect Anti-Globulin Test，IAT），主要用于不規(guī)則抗體篩查、交叉配血、抗體致敏紅細(xì)胞的檢測(cè)等[1]?？谷饲虻鞍自囼?yàn)與輸血密切相關(guān)，有重要的臨床意義。常用檢測(cè)方法有鹽水法、聚凝胺法、微柱凝膠法等[2-4]。其中抗人球蛋白微柱凝膠法近年來在臨床中應(yīng)用較多，是集離心技術(shù)、生物化學(xué)凝膠過濾技術(shù)及免疫化學(xué)抗原抗體反應(yīng)三者結(jié)合的產(chǎn)物，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果易讀[5-7]。目前已有多家國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口企業(yè)的相關(guān)產(chǎn)品批準(zhǔn)上市，并有多家企業(yè)處于研發(fā)或申報(bào)階段。但該類產(chǎn)品具有較高的個(gè)人風(fēng)險(xiǎn)，出現(xiàn)錯(cuò)誤結(jié)果易對(duì)個(gè)人健康安全造成嚴(yán)重威脅，作為第三類體外診斷試劑進(jìn)行管理應(yīng)進(jìn)行充分的安全有效性驗(yàn)證。結(jié)合審評(píng)經(jīng)驗(yàn)和相關(guān)指南，本文將對(duì)注冊(cè)申報(bào)重點(diǎn)技術(shù)要求進(jìn)行分析，為研發(fā)和相關(guān)工作人員提供思路。

1.主要原材料研究

以微柱凝集法為例，該類產(chǎn)品主要原材料主要包括抗體、填充物、填充緩沖液、液體試劑稀釋液等。注冊(cè)申報(bào)資料中應(yīng)詳細(xì)描述原材料的選擇研究、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等資料，自制材料還應(yīng)提交制備原理、詳細(xì)的生產(chǎn)及鑒定過程。

抗體是抗人球蛋白檢測(cè)試劑的核心原材料，很大程度上影響產(chǎn)品靈敏度和特異性，且鑒于該類產(chǎn)品具有較高的個(gè)人風(fēng)險(xiǎn)，因此應(yīng)對(duì)抗體的物理指標(biāo)如純度、濃度以及功能性指標(biāo)如靈敏度、特異性、效價(jià)等基本性能進(jìn)行充分驗(yàn)證。

靈敏度和特異性研究至少應(yīng)選取7種臨床有意義的已知血型系統(tǒng)，如Rh、MNS、Kidd血型系統(tǒng)等。效價(jià)研究可采用倍比稀釋方法驗(yàn)證。

2.反應(yīng)體系研究

相較于試管法，抗人球蛋白檢測(cè)試劑操作更為簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)過程中干擾因素較少，主要的樣本處理和反應(yīng)過程研究包括：

2.1 紅細(xì)胞制備要求

如洗滌次數(shù)、紅細(xì)胞濃度范圍確定、加樣量的確定。此外，紅細(xì)胞配制如采用LISS液而非生理鹽水，還應(yīng)明確確配合使用的LISS液的基本信息如生產(chǎn)廠家、規(guī)格、貨號(hào)、注冊(cè)證號(hào)。

2.2 孵育條件要求

主要包括溫度、時(shí)間的選擇。

2.3 離心條件

離心條件受填充物粒徑等的影響，通過對(duì)離心力選擇研究，建議以離心力或固定離心機(jī)型號(hào)固定轉(zhuǎn)數(shù)和時(shí)間的方式設(shè)置。

3.分析性能評(píng)估（間接抗人球試驗(yàn)）

3.1 配合使用的試劑

產(chǎn)品性能研究中所采用的各種儀器、試劑或其他物品（如LISS液、抗體篩查紅細(xì)胞、血型抗體等）如可能均應(yīng)采用境內(nèi)或境外已批準(zhǔn)上市的產(chǎn)品，并明確生產(chǎn)廠家、規(guī)格、貨號(hào)、注冊(cè)證號(hào)等信息。以LISS液為例，在產(chǎn)品說明書中聲稱的配套產(chǎn)品，應(yīng)在反應(yīng)體系研究、性能評(píng)估、注冊(cè)檢測(cè)、臨床試驗(yàn)等資料中一致。

3.2 靈敏度與特異性

除ABO血型系統(tǒng)外，目前已發(fā)現(xiàn)多種其他血型系統(tǒng)，如Rh、MNS、Kidd、Diego、Duffy、Lewis、Kell和Kx等，靈敏度和特異性應(yīng)至少選擇7種臨床有意義的血型系統(tǒng)進(jìn)行充分驗(yàn)證[8]。

3.3 重復(fù)性

可選擇有代表性的IgG性質(zhì)血型抗體如抗D、抗Jka/Jkb、抗Fya/Fyb對(duì)批內(nèi)、批間、日間進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證，檢測(cè)結(jié)果凝集強(qiáng)度差異建議不超過1+。

3.4 干擾驗(yàn)證

應(yīng)至少采用強(qiáng)、中、弱性質(zhì)的抗體，對(duì)常見內(nèi)源性干擾如溶血、脂血、黃疸進(jìn)行評(píng)估，并具體描述采用的抗體。

3.5 臨床樣本驗(yàn)證

上述研究均采用試劑紅細(xì)胞進(jìn)行研究，在性能評(píng)估中應(yīng)充分評(píng)估復(fù)雜臨床樣本和臨床環(huán)境中可能面臨的各種問題，因此另需通過真實(shí)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)靈敏度和特異性的評(píng)價(jià)，應(yīng)考慮涵蓋腫瘤、血液病、自身免疫病和貧血患者、老人及兒童等病例來源，應(yīng)包括陽(yáng)性和陰性病例。

3.6 其他

每個(gè)預(yù)期用途均應(yīng)進(jìn)行完整性能評(píng)估并應(yīng)至少包括50例陽(yáng)性病例。應(yīng)注意所有試驗(yàn)結(jié)果均應(yīng)以凝集強(qiáng)度而非陰陽(yáng)性表示。

3.7 直接抗人球蛋白試驗(yàn)

使用被不規(guī)則抗體和/或C3d致敏的紅細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)，評(píng)價(jià)產(chǎn)品性能，適用的性能評(píng)價(jià)內(nèi)容可以參照間接抗人球蛋白試驗(yàn)。

4.陽(yáng)性判斷值

紅細(xì)胞表面已結(jié)合的抗體和/或補(bǔ)體與微柱中相應(yīng)人免疫球蛋白抗體和/或抗補(bǔ)體抗體形成的特異性紅細(xì)胞免疫復(fù)合物位于凝膠表面或膠中，呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，一般根據(jù)反應(yīng)強(qiáng)度從4+～1+依次減弱，還可能出現(xiàn)溶血、混合視野雙群等非典型凝集狀態(tài)。產(chǎn)品應(yīng)提供不同凝集強(qiáng)度的圖例或相片，提供生產(chǎn)企業(yè)對(duì)不同凝集強(qiáng)度的研究方法，并明確不同凝集強(qiáng)度代表的具體意義，并應(yīng)包含溶血、混合視野雙群等情況。

應(yīng)注意如產(chǎn)品有多個(gè)預(yù)期用途如不規(guī)則抗體篩查、交叉配血等，針對(duì)每種預(yù)期用途都應(yīng)分別進(jìn)行陽(yáng)性判斷值的建立與驗(yàn)證。

5.產(chǎn)品說明書

說明書是體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)最重要的文件之一，也是指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果給出合理醫(yī)學(xué)解釋的重要依據(jù)。說明書中產(chǎn)品預(yù)期用途、檢驗(yàn)原理、試驗(yàn)方法、檢測(cè)結(jié)果解釋以及注意事項(xiàng)等重要信息是產(chǎn)品研發(fā)、性能評(píng)估和臨床試驗(yàn)的總結(jié)，應(yīng)與申報(bào)資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致。配合使用的離心機(jī)、紅細(xì)胞配制用LISS液、抗體篩查用紅細(xì)胞等，是研究結(jié)果穩(wěn)定重現(xiàn)的重要保證，應(yīng)在說明書中明確生產(chǎn)廠家、規(guī)格/型號(hào)、貨號(hào)等重要信息。根據(jù)性能評(píng)估、陽(yáng)性判斷值及臨床試驗(yàn)驗(yàn)證的全面與否，嚴(yán)謹(jǐn)確定產(chǎn)品的預(yù)期用途，如不規(guī)則抗體篩查、交叉配血、抗體致敏紅細(xì)胞的檢測(cè)（明確疾病類型）等，并明確不用于血源篩查，僅用于臨床檢驗(yàn)[9,10]。

6.小結(jié)

抗人球蛋白檢測(cè)是檢測(cè)不規(guī)則抗體的常用方法，也是診斷免疫性溶血病的重要指標(biāo)，在臨床輸血前檢測(cè)中具有重要意義。近年來，以微柱凝膠法為代表的抗人球蛋白檢測(cè)試劑在臨床中取得了廣泛應(yīng)用。該類產(chǎn)品雖然技術(shù)原理及操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但風(fēng)險(xiǎn)較高，在生產(chǎn)研發(fā)中應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，如在抗體、凝膠及緩沖液篩選中應(yīng)合理制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品生產(chǎn)過程中對(duì)于抗體濃度的選擇、凝膠溶脹條件的確定、填充量及填充過程等關(guān)鍵工藝進(jìn)行確認(rèn)[11]。希望通過本文對(duì)抗人球蛋白檢測(cè)試劑申報(bào)過程中常見問題的梳理，幫助申請(qǐng)人減少注冊(cè)申報(bào)資料中的問題，提升該類產(chǎn)品注冊(cè)申報(bào)資料質(zhì)量。