李 瑋, 蔣珍珍, 李 菡, 屠鵬飛, 宋青青*, 于 娟*, 宋月林

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院, 中藥現(xiàn)代研究中心, 北京 100029; 2. 漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司, 福建 漳州 363000)

片仔癀(Pien-Tze-Huang)具有清熱解毒、消腫止痛、涼血化瘀之功效[1],可用于熱毒血瘀所致急慢性肝炎,癰疽疔瘡,跌打損傷、無(wú)名腫痛及各種炎癥。其藥用歷史悠久,為國(guó)家一級(jí)中藥保護(hù)制劑,目前公開(kāi)組方包括三七、牛黃、蛇膽、麝香4味名貴中藥?，F(xiàn)代藥理研究表明片仔癀具有治療急慢性肝炎、潰瘍、外傷、腦保護(hù)、抗腫瘤等作用[2-5]。片仔癀中三七皂苷、膽汁酸以及麝香酮等主要化學(xué)成分已被系統(tǒng)研究,但對(duì)片仔癀復(fù)方的化學(xué)成分進(jìn)行全面表征和解析的相關(guān)研究較少。中藥復(fù)方是中醫(yī)治病的主要臨床用藥形式,其化學(xué)成分并不是各單味中藥化學(xué)成分的相加,需要全面、系統(tǒng)地闡明復(fù)方化學(xué)成分組,進(jìn)而為其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)及藥效研究提供可靠的依據(jù)。

常用的提取方法如浸漬、回流和超聲等費(fèi)時(shí)費(fèi)力,還需要大量的溶劑和藥材,提取效率低。本課題組前期建立了在線加壓溶劑提取方法(online pressurized liquid extraction, online PLE),采用水作為綠色提取溶劑,通過(guò)升溫和加壓提高水對(duì)藥材中化學(xué)成分的溶解和提取能力,實(shí)現(xiàn)了快速、高效提取。Online PLE模塊可以連接于液相色譜系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)直接分析,有效地避免了不穩(wěn)定化學(xué)成分在提取等制備過(guò)程中發(fā)生降解[6]。課題組利用該儀器平臺(tái)定性、定量表征大小鼠糞便以及遠(yuǎn)志、肉蓯蓉等中藥的化學(xué)成分組成[7-9]。片仔癀含有的?；撬峤Y(jié)合型膽汁酸由于酰胺鍵的存在易發(fā)生水解或氧化[10],利用在線加壓溶劑提取方法能夠有效降低該類成分在提取時(shí)降解的可能性。并且,online PLE可以實(shí)現(xiàn)毫克級(jí)樣品分析,特別適合貴重藥材的化學(xué)成分組成表征。因此,本研究利用在線加壓溶劑提取-超高效液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜(online PLE-UHPLC-IT-TOF-MS)對(duì)片仔癀化學(xué)成分組進(jìn)行快速、全面分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與藥材

島津分析型超高效液相色譜儀,包含LC-20AD泵、CTO-20A柱溫箱、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、SPD-M20A紫外檢測(cè)器、DGU-20A脫氣機(jī)、CBM-20A控制器和色譜工作站(日本島津公司);島津質(zhì)譜儀IT-TOF-MS(日本島津公司);萬(wàn)分之一電子天平(METTLER XS105型,瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司);超聲波清洗器(南京壘君達(dá)超聲電子設(shè)備有限公司);超純水凈化系統(tǒng)(美國(guó)密理博有限公司);超速離心機(jī)(德國(guó)艾本德公司)。Phenomenex預(yù)柱芯(型號(hào):AJ0-4287)和適配的Security GuardTM預(yù)柱套(型號(hào):KJ0-4282,飛諾美公司)。預(yù)柱芯去除硅膠,用于填裝片仔癀粉末。

質(zhì)譜級(jí)甲醇、甲酸、乙腈購(gòu)于美國(guó)賽默飛世爾公司,超純水由實(shí)驗(yàn)室Milli-Q純水系統(tǒng)制備。片仔癀(粒)購(gòu)自北京金象大藥房醫(yī)藥連鎖有限責(zé)任公司,批號(hào)為1908096。

對(duì)照品人參皂苷Rc、Rd、Re、Rf、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、Ro、F1、F2、擬人參皂苷F11、三七皂苷R1均由北京大學(xué)天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供,經(jīng)HPLC-二極管陣列檢測(cè)器-IT-TOF-MS檢測(cè),純度均大于95%。膽酸(CA)、熊去氧膽酸(UDCA)、豬去氧膽酸(HDCA)、鵝去氧膽酸(CDCA)、甘氨膽酸(GCA)、牛磺鵝去氧膽酸(TCDCA)均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司,經(jīng)HPLC-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè),純度均大于98%。

1.2 Online PLE-UHPLC-IT-TOF-MS分析方法的建立

1.2.1Online PLE提取及色譜洗脫條件

提取 取片仔癀樣品一粒,用研缽研磨成細(xì)粉,精密稱取0.3 mg,置于空預(yù)柱芯的尾端,用正相硅膠填充預(yù)柱芯,構(gòu)成提取池。將提取池裝入Phenomenex Security GuardTM預(yù)柱套中,置于70 ℃的柱溫箱內(nèi)。構(gòu)建online PLE-UHPLC-IT-TOF-MS檢測(cè)系統(tǒng),0.1%(v/v)甲酸水為提取溶劑,流速為0.2 mL/min,提取3 min。通過(guò)引入一個(gè)二位六通閥,將在線加壓提取模塊直接連入液相色譜系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)直接分析。當(dāng)二位六通閥處于1-2位連接,通過(guò)自動(dòng)進(jìn)樣2 μL 0.1%(v/v)甲酸水觸發(fā)提取階段,系統(tǒng)提取流路裝置圖見(jiàn)圖1a。

洗脫及分析 采用Waters HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)。流動(dòng)相組成為0.1%(v/v)甲酸水(A)和乙腈(B)。梯度洗脫程序:0～3 min, 0%B; 3～18 min, 0%B～36%B; 18～28 min, 36%B～55%B; 28～41 min, 55%B～85%B; 41～43 min, 85%B～95%B; 43～43.01 min, 95%B～0%B; 43.01～48 min, 0%B,流速為0.2 mL/min。在提取3 min后,二位六通閥切換至1-6位,進(jìn)入洗脫分析程序。

圖 1 在線加壓溶劑提取-超高效液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)裝置圖

1.2.2質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源(ESI),負(fù)離子模式下MS1掃描范圍:m/z100～1 500, MS2掃描范圍:m/z50～1 500;碰撞誘導(dǎo)解離(CID)能量:90%。噴霧室電壓:-3.5 kV;曲型脫溶劑管(CDL)溫度:200 ℃;加熱模塊溫度:200 ℃;干燥氣電壓:100 MPa;霧化氣流速:1.5 L/min;檢測(cè)器電壓:1.5 kV。離子阱壓力:3.0×10-2Pa;碰撞室壓力:2.0×10-4Pa;各級(jí)質(zhì)譜的重復(fù)次數(shù)為3,離子累積時(shí)間為30 ms。

1.3 對(duì)照品溶液制備與分析

精密稱定各對(duì)照品適量,用甲醇溶解,配制成10 g/L的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,用甲醇稀釋,制備成混合對(duì)照品溶液。預(yù)柱芯僅用正相硅膠填充,自動(dòng)進(jìn)樣器吸取2 μL混合對(duì)照品溶液注入分析系統(tǒng),按1.2節(jié)條件分析。

1.4 超聲提取樣品的制備與分析

1.4.1供試品溶液的制備

精密稱定約50 mg片仔癀粉末,用1 mL甲醇超聲提取30 min后,室溫12 000 r/min離心10 min,用0.22 μm濾膜過(guò)濾上清液,取續(xù)濾液待用。

1.4.2分析條件

實(shí)驗(yàn)裝置與圖1b相同,二位六通閥處于1-6位。梯度洗脫程序:0～3 min, 0%B～5%B; 3～18 min, 5%B～36%B; 18～48 min同1.2.1節(jié)梯度。色譜柱、流動(dòng)相及流速等色譜條件與質(zhì)譜條件同1.2.1節(jié)和1.2.2節(jié)。

1.5 化學(xué)信息數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

在中國(guó)知網(wǎng)、SCIFinder、Pubmed等數(shù)據(jù)庫(kù)中廣泛檢索片仔癀4味單味藥三七、牛黃、蛇膽和麝香的化學(xué)成分分離和分析文獻(xiàn),將三七皂苷、膽汁酸、麝香酮、甾體激素等化學(xué)類型的結(jié)構(gòu)和質(zhì)譜信息錄入Microsoft Excel軟件,自建化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的優(yōu)化

為了增大在線加壓溶劑提取方法的效率,優(yōu)化所有化合物的色譜及質(zhì)譜行為,本實(shí)驗(yàn)在課題組前期工作[8]的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對(duì)提取和色譜條件進(jìn)行優(yōu)化。隨著提取流速的升高(0.1、0.2和0.3 mL/min),系統(tǒng)反壓也會(huì)增加,當(dāng)選擇0.2 mL/min為提取流速時(shí),能夠滿足片仔癀中化學(xué)成分全面提取所需的壓力和提取效率;同時(shí),隨著提取溫度的升高(50、60、70 ℃),水的黏度降低且溶出能力增強(qiáng),提取效率增高,故最終選擇70 ℃為提取溫度;對(duì)提取時(shí)間(3、4和5 min)進(jìn)行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)3 min即可提取完全,且此時(shí)提取液體積并不會(huì)影響色譜洗脫時(shí)的峰形。由于本實(shí)驗(yàn)僅引入一個(gè)二位六通閥,故需要優(yōu)化合適的流動(dòng)相作為提取溶劑,首先對(duì)比了水、0.05%甲酸水、0.1%甲酸水對(duì)提取效率和色譜峰形的影響,0.1%甲酸水能夠產(chǎn)生更好的色譜峰形、增強(qiáng)質(zhì)譜響應(yīng);之后,考察了提高提取流動(dòng)相中乙腈的體積分?jǐn)?shù)為5%、10%、15%時(shí)的提取效果,結(jié)果表明大多數(shù)成分難以提取出來(lái),色譜峰數(shù)量和響應(yīng)顯著降低,故選擇0.1%甲酸水作為提取溶劑。最終,本實(shí)驗(yàn)選擇0.1%甲酸水作為提取溶劑,提取流速、提取時(shí)間及提取溫度分別為0.2 mL/min、3 min和70 ℃。片仔癀中化學(xué)成分類型豐富,為了各化學(xué)成分有較好的色譜保留,提高色譜峰容量,最終選擇了耐純水的Waters HSS T3色譜柱。

2.2 在線加壓溶劑提取法與超聲提取法的對(duì)比

在相同的液相色譜和質(zhì)譜條件下,對(duì)比了在線加壓溶劑提取法與超聲提取法的提取效率。從二者的基峰色譜圖(見(jiàn)圖2)可以看出,兩種方法檢出的色譜峰具有一定的相似性,然而在線加壓溶劑提取法(見(jiàn)圖2a)的提取效率顯著高于甲醇超聲提取。通過(guò)指認(rèn)兩張色譜圖上的色譜峰,可以發(fā)現(xiàn)甲醇超聲提取所得到的化學(xué)成分在在線加壓溶劑提取樣品中均有檢出,且從色譜峰數(shù)量來(lái)看,在線加壓溶劑提取僅需片仔癀0.3 mg即可提取出更多的化學(xué)成分,尤其是對(duì)于中等極性化學(xué)成分的提取效率明顯高于超聲提取(見(jiàn)圖2b)。綜上,在線加壓溶劑提取方法能夠高效、快速地提取中藥化學(xué)成分。

2.3 片仔癀中皂苷類及膽酸類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律推導(dǎo)

由于麝香的化學(xué)成分主要為極性較小的大環(huán)酮及膽甾醇等化合物,難以在C18色譜柱上洗脫,且也未能檢出麝香相關(guān)的化學(xué)成分。因此,本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)片仔癀中三七、蛇膽與牛黃中的皂苷及膽酸類對(duì)照品的質(zhì)譜行為進(jìn)行分析,總結(jié)其裂解規(guī)律,用于片仔癀中化學(xué)成分的鑒定。

2.3.1皂苷類化合物的鑒定

片仔癀中皂苷類化合物主要來(lái)源于三七,多為達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜,在C-3、C-6和C-20位連接有葡萄糖、鼠李糖等組成的糖鏈。按照苷元的不同,主要分為人參二醇型和人參三醇型人參皂苷。

以人參皂苷Rg3(ginsenoside Rg3, 65(圖2中色譜峰號(hào),下同))為例,闡述皂苷類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律及途徑。負(fù)離子模式下,準(zhǔn)分子離子峰為m/z829.482 2([M+HCOO]-),二級(jí)質(zhì)譜圖中檢測(cè)到碎片離子主要為m/z783.474 7([M-H]-)、621.424 9([M-H-glc]-)和459.367 8([M-H-2glc]-)(見(jiàn)圖3a),由于人參皂苷Rg3的C-3位連接一個(gè)兩分子葡萄糖殘基的糖鏈,推測(cè)其碎片離子分別由準(zhǔn)分子離子丟失甲酸分子、一分子葡萄糖以及兩分子葡萄糖產(chǎn)生,m/z459.367 8為其苷元特征碎片,人參皂苷Rg3的質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖3b。化合物58、59與65具有相同的準(zhǔn)分子離子峰,三者預(yù)測(cè)分子式均為C42H72O13,化合物65與59具有相同的二級(jí)碎片,推斷為一組同分異構(gòu)體。

結(jié)合文獻(xiàn)[11],在負(fù)離子模式下,皂苷類化合物一級(jí)質(zhì)譜中易產(chǎn)生[M-H]-或[M+HCOO]-的準(zhǔn)分子離子峰,其糖苷鍵斷裂,會(huì)中性丟失葡萄糖殘基(162 Da)、木糖殘基(132 Da)、阿拉伯糖殘基(132 Da)、鼠李糖殘基(146 Da)和水(18 Da),從而形成苷元碎片離子,其中人參二醇型和人參三醇型人參皂苷元的碎片離子分別為m/z459和m/z475。

圖 3 人參皂苷Rg3的(a)MS2圖譜和(b)質(zhì)譜裂解途徑

2.3.2膽酸類化合物的鑒定

游離膽酸結(jié)構(gòu)中存在羧基以及多個(gè)羥基,脫羧基反應(yīng)以及失羥基為主要的裂解方式。有研究表明羥基位置不同其丟失水分子的能力也不同,且強(qiáng)弱順序依次遞減(7α>6α>12α>3α)[12]。當(dāng)12位存在羥基時(shí),會(huì)與24位羧基之間發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移,進(jìn)而得到[M-H-CH2O2]-碎片。以膽酸(cholic acid, CA, 55)為例,闡述游離型膽酸類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律。在負(fù)離子模式下,CA的準(zhǔn)分子離子為m/z407.278 5([M-H]-), CA在C-3、C-7以及C-12位均有羥基取代,在二級(jí)質(zhì)譜中能夠看到丟失水分子以及羧基所生成的主要碎片離子為m/z389.266 6([M-H-H2O]-)、361.269 8([M-H-CH2O2]-)、345.277 1([M-H-H2O-CO2]-)、343.261 8([M-H-H2O-CH2O2]-)和327.265 2([M-H-2H2O-CO2]-)(見(jiàn)圖4a),其質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖4b。

以?；蛆Z去氧膽酸(taurochenodeoxycholic acid, TCDCA, 50)為例,闡述牛磺酸結(jié)合型膽酸的質(zhì)譜裂解規(guī)律。在負(fù)離子模式下,TCDCA的準(zhǔn)分子離子峰為m/z498.287 3([M-H]-),二級(jí)碎片離子主要為m/z480.280 6([M-H-H2O]-)和355.261 2([M-H-H2O-C2H6NO3S]-)(見(jiàn)圖5a)。TCDCA中C-24位羧基與?；撬峄纬甚０锋I易斷裂,歸屬碎片離子分別為分子離子峰丟失水分子、?；撬釟埢a(chǎn)生,并未見(jiàn)母核碎裂的相關(guān)碎片離子,其質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖5b。

以甘氨膽酸(glycocholic acid, 42)為例,闡述甘氨酸結(jié)合型膽酸的質(zhì)譜裂解規(guī)律。在負(fù)離子模式下,準(zhǔn)分子離子峰m/z464.300 1([M-H]-)。甘氨結(jié)合型膽酸是由膽酸的24位羧基經(jīng)酰胺鍵與甘氨酸相連形成,酰胺鍵易發(fā)生斷裂,同時(shí),由于甘氨酸包括羧基,C-26位易發(fā)生脫羧失去44 Da(CO2)。故碎片離子歸屬為m/z446.289 5([M-H-H2O]-)、402.298 7([M-H-H2O-CO2]-)、382.273 0([M-H-2H2O-CH2O2]-)和353.246 6([M-H-2H2O-C2H4NO2]-)(見(jiàn)圖6a),推測(cè)準(zhǔn)分子離子峰會(huì)丟失水分子、二氧化碳分子、甲酸分子以及甘氨酸殘基生成相應(yīng)的碎片離子,甘氨膽酸的質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖6b。

圖 4 膽酸的(a)MS2圖譜和(b)質(zhì)譜裂解途徑

圖 5 ?；蛆Z去氧膽酸的(a)MS2圖譜和(b)質(zhì)譜裂解方式

圖 6 甘氨膽酸的(a)MS2圖譜和(b)質(zhì)譜裂解途徑

2.4 片仔癀化學(xué)成分表征

本工作采用online PLE-UHPLC-IT-TOF-MS方法在負(fù)離子模式下檢測(cè)片仔癀樣品,其基峰色譜圖見(jiàn)圖2a。通過(guò)主要成分皂苷以及膽酸類化合物的質(zhì)譜行為總結(jié),結(jié)合對(duì)照品以及相關(guān)文獻(xiàn),最終從片仔癀中鑒定了71個(gè)化學(xué)成分,仍有2個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)尚未確認(rèn)。通過(guò)與對(duì)照品比對(duì),化合物9、13、44、45、58、61、65、70、42、50、55、64、66和68分別鑒定為三七皂苷R1、人參皂苷Rf、Rd、Re、Rg2、F2、Rg3、Rh2、GCA、TCDCA、CA、UDCA、HDCA和CDCA。結(jié)合參考文獻(xiàn)[12,13]及裂解途徑,從片仔癀中初步鑒定了35個(gè)皂苷類化合物和34個(gè)膽酸類化合物。對(duì)比自建的三七、蛇膽、牛黃和麝香的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù),對(duì)鑒定的成分進(jìn)行歸屬,其中三七來(lái)源化學(xué)成分36個(gè),包括1個(gè)炔的脂肪酸苷(化合物1)以及35個(gè)皂苷(化合物2～13、18、19、22、23、31、33～36、43～47、49、54、56、58、59、61、62、65和70),蛇膽來(lái)源化學(xué)成分15個(gè),均為膽汁酸類化合物(化合物14、15、16、17、20、21、24、25、26、32、37、38、40、41和53),牛黃來(lái)源化學(xué)成分9個(gè),為化合物51、57、63、64、66、67、68、69和71,牛黃和蛇膽共有成分11個(gè),為化合物27、28、29、30、39、42、48、50、52、55和60(見(jiàn)表1)。

2.5 討論

中藥常用的提取方法,如連續(xù)回流法、超聲提取法等,需要大量的溶劑和藥材,費(fèi)時(shí)費(fèi)力,且不適用于貴細(xì)中藥材的分析。本文建立了在線加壓溶劑提取方法,采用水作為綠色提取溶劑,通過(guò)升溫和加壓改變水的理化性質(zhì),提高水對(duì)藥材中化學(xué)成分的溶解和提取能力。同時(shí),本法提取效率高,僅需微量樣品,提取3 min,可提取出中藥復(fù)方中豐富的化學(xué)成分。

通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)片仔癀的主要化學(xué)成分類型為皂苷和膽酸,且經(jīng)各已知單味藥化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),皂苷多來(lái)源于中藥三七,膽酸類主要來(lái)源于牛黃和蛇膽,由于麝香的化學(xué)成分主要為大分子環(huán)酮及膽甾醇等小極性化合物,本方法并未能檢出該類成分,后續(xù)將利用氣相色譜或超臨界流體色譜-串聯(lián)質(zhì)譜等技術(shù)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。

3 結(jié)論

本文采用online PLE-UHPLC-IT-TOF-MS法對(duì)片仔癀成分組進(jìn)行快速全面分析,為其質(zhì)量控制研究提供可靠的依據(jù)。通過(guò)對(duì)照品比對(duì)、質(zhì)譜裂解規(guī)律推斷以及相關(guān)文獻(xiàn)參考,共鑒定71個(gè)化學(xué)成分,推測(cè)其中36個(gè)化合物來(lái)源于三七,15個(gè)化合物來(lái)源于蛇膽,9個(gè)化合物來(lái)源于牛黃,11個(gè)為牛黃與蛇膽來(lái)源成分。Online PLE-UHPLC-IT-TOF-MS法不僅簡(jiǎn)化了樣品前處理步驟,節(jié)省了溶劑和人力,而且能夠?qū)崿F(xiàn)中藥復(fù)方制劑的直接分析,踐行了綠色化學(xué)的理念,提高了分析的準(zhǔn)確度和靈敏度。