陳樹東, 馮 銳, 林曉佳, 梁土金, 何秋婷

(1. 廣東省中藥研究所, 廣東 廣州 510640; 2. 廣東醫(yī)科大學(xué), 廣東 東莞 523808; 3. 廣州檢測認證集團有限公司, 廣東 廣州 511447)

人參、西洋參和三七等五加科(Araliaceae)植物不僅是傳統(tǒng)的名貴中藥材,作為納入可用于保健食品管理的中藥品種,在保健食品中的應(yīng)用也非常廣泛。據(jù)統(tǒng)計,在2006～2015年間，中國注冊的保健食品中,有近40%的保健食品含有人參、西洋參或三七成分[1]。人參皂苷是人參、西洋參和三七的主要活性化合物,對心血管系統(tǒng)[2]、免疫系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)[3,4]都具有藥理作用,作為保健食品的特征成分和質(zhì)量評價指標,準確檢測其含量具有非常重要的意義。人參皂苷屬于四環(huán)三萜類化合物,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的種類有50多種,主要分為原人參二醇型皂苷(PPD)、原人參三醇型皂苷(PPT)和齊墩果酸型皂苷3種類型[5]。其中,人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1和Rg2等9種化合物的含量超過90%[6,7],本文以9種主要人參皂苷成分為研究對象,旨在建立一個快速、可靠的人參皂苷檢測方法,用于保健食品中人參皂苷成分的檢測和質(zhì)量評價。

目前,人參皂苷的測定方法有高效液相色譜法(HPLC)[8-12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[5,13]、液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法(HPLC-QTOF-MS)[14,15]、膠束電動毛細管色譜法(MEKC)[16]等,這些分析方法的研究主要集中在中藥植物或中成藥含量分析方面,通常只針對某些特定的人參皂苷化合物,針對保健食品中主要人參皂苷成分的定性定量研究鮮有報道。其中,QTOF-MS和MEKC由于儀器成本和實際應(yīng)用的限制,方法較難普及。人參皂苷的檢測主要以HPLC為主,但由于人參皂苷在紫外區(qū)的吸收較弱,在紫外吸收的臨界波長下人參皂苷的響應(yīng)不高,大量的雜峰干擾也會對檢測結(jié)果產(chǎn)生較大影響[17]。保健食品中添加的其他復(fù)雜成分在沒有做好合理凈化的情況下也會進一步影響檢測結(jié)果[18]。另外,人參皂苷的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)相近,在常規(guī)液相色譜法中分離時間過長[8]。本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),可以實現(xiàn)對原人參二醇型皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd和原人參三醇型皂苷Re、Rf、Rg1、Rg2(結(jié)構(gòu)式見圖1)等9種人參皂苷主要成分的快速分離和準確定量,結(jié)合固相萃取前處理條件,在復(fù)雜基質(zhì)條件下對保健食品中的人參皂苷物質(zhì)進行提取、富集,為保健食品中的人參皂苷含量檢測和質(zhì)量監(jiān)控提供技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

TSQ Quantum Access MAX三重四極桿質(zhì)譜儀、UltiMate 3000超高效液相色譜儀(美國Thermo Scientific公司); Sartorius BSA224S-CW電子天平(德國Sartorius公司); 5424R冷凍離心機(德國Eppendorf公司); MIX-1振蕩渦旋混合器(上海托莫斯科學(xué)儀器有限公司); KQ-250E超聲波水浴器(昆山市超聲儀器有限公司); Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

乙酸銨(色譜純,上海Macklin公司);甲醇、乙腈、甲酸(色譜純,德國Merck公司); Alumina-N/XAD-2 SPE柱(1 g/4 g, 10 mL)和人參皂苷Rb2(批號Z99800205)、Rb3(批號Y8650010)、Rc(批號U9330025)、Rd(批號R7880050)、Rf(批號T7810020)、Rg2(批號47560010)購于上海安譜實驗科技股份有限公司;對照品人參皂甙Re(批號110754-201827)、Rg1(批號110703-201731)、Rb1(批號110704-201827)購于中國食品藥品檢定研究院。11批保健食品均為市售。

1.2 標準溶液的配制

分別準確稱取各目標物標準品0.01 g,用甲醇溶解并配制成1 mg/mL的標準儲備液,于-18 ℃保存。分別吸取一定量的標準儲備液,用甲醇稀釋,渦旋混勻,配制成質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL的混合標準溶液,于-18 ℃保存。移取適量混合標準溶液,用甲醇-水(30∶70, v/v)配制成0.005～0.5 μg/mL的系列混合標準工作液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

1.3.1提取

固體試樣:取片劑或膠囊內(nèi)容物研成粉末,稱取0.5 g試樣,置于50 mL塑料離心管中,加入約15 mL純化水渦旋振搖混勻,超聲提取(功率300 W,頻率40 kHz)30 min,以5 000 r/min離心5 min,上清液轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中,殘渣用30 mL純化水分2次重新提取,提取液并入量瓶中,用純化水定容至刻度,混勻,待凈化。

液體試樣:稱取2 g試樣,置于50 mL塑料離心管中,加入約40 mL純化水,渦旋振搖混勻,超聲提取(功率300 W,頻率40 kHz)30 min,用純化水定容至50 mL,混勻,待凈化。

1.3.2凈化

分別用20 mL 70%乙醇水溶液和20 mL水對固相萃取柱進行活化,取2.0 mL樣品提取溶液上樣,分別用20 mL水進行淋洗,用20 mL 70%乙醇水溶液進行洗脫,收集洗脫液;洗脫液用甲醇-水(30∶70, v/v)定容至25.0 mL,混勻后用0.22 μm混合型濾膜過濾,上機檢測。若樣品中人參皂苷濃度超出線性范圍,用甲醇-水(30∶70, v/v)適當(dāng)稀釋。

1.4 分析條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:Hypersil Gold C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm)柱;柱溫:40 ℃;流動相:A為5 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸), B為乙腈;流速：0.4 mL/min。梯度洗脫條件:0～4.0 min, 81%A; 4.0～6.0 min, 81%A～79%A; 6.0～8.0 min, 79%A～72%A; 8.0～15.0 min, 72%A～69%A; 15.0～20.0 min, 69%A～54%A; 20.0～20.5 min, 54%A～10%A; 20.5～22.0 min, 10%A; 22.0～22.5 min, 10%A～81A%。進樣量:5 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧電離源,負離子模式(ESI-);掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;離子傳輸毛細管溫度:350 ℃;電噴霧電壓:3 000 V;蒸發(fā)溫度:400 ℃;碰撞氣體壓力:0.2 Pa;輔助氣流量:3.6 mL/min;鞘氣流量:10.5 mL/min。9種分析物的監(jiān)測離子對(Q1/Q3 ion pairs)、碰撞能量和管透鏡補償電壓(tube lens)見表1。

表 1 9種分析物的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

實驗在ESI-和MRM模式下檢測人參皂苷,由于9種人參皂苷的主要分子結(jié)構(gòu)類似(見圖1),人參皂苷的電離裂解過程為皂苷分子M丟失一個質(zhì)子形成[M-H]-準分子離子,準分子離子在碰撞池與碰撞氣分子發(fā)生碰撞而裂解成的碎片離子也多以丟失各種糖基G后形成[M-H-G]-為主[19,20],離子形成和裂解機理基本一致,碎片離子具有各型皂苷的典型特征。原人參二醇型皂苷作為準分子離子,斷裂后以m/z783.5和m/z945.5的碎片離子為主;原人參三醇型皂苷準分子離子,斷裂后出現(xiàn)m/z475.5和m/z637.4為主的碎片離子。在確定了一級質(zhì)譜準分子離子峰和相應(yīng)的碎片離子后,實驗通過對噴霧電壓、碰撞能量和管透鏡補償電壓等條件進一步優(yōu)化,使得方法的靈敏度進一步得到提升。

2.2 色譜條件優(yōu)化

圖 2 9種人參皂苷的總離子流色譜圖

由于9種人參皂苷的分子結(jié)構(gòu)相類似,通過對比可以發(fā)現(xiàn),原人參二醇型結(jié)構(gòu)的人參皂苷Rb2、Rb3和Rc互為同分異構(gòu)體,分子結(jié)構(gòu)相同,只是在空間結(jié)構(gòu)上存在差別,3種物質(zhì)的一級準分子離子峰和裂解失去糖基后形成的離子碎片均相同(m/z1 077.6/783.5、m/z1 077.6/945.5),且在色譜柱上的保留時間接近,因此在色譜分離時,這3種物質(zhì)需達到完全分離才能準確定量。研究采用Hypersil Gold C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm),在0.4 mL/min的流速條件下,通過優(yōu)化梯度洗脫條件,使人參皂苷Rb2、Rb3和Rc 3種目標物質(zhì)實現(xiàn)完全分離,全部9種目標物質(zhì)均實現(xiàn)較好的分離效果(見圖2)。實驗進一步考察了相同梯度洗脫條件下甲醇-水和乙腈-水體系流動相對9種目標物質(zhì)的分離效果,結(jié)果表明,乙腈-水體系流動相的洗脫能力優(yōu)于甲醇-水體系,且峰形對稱性更好。在質(zhì)譜條件優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn),在乙腈-水流動相體系中加入甲酸能夠提高皂苷物質(zhì)的響應(yīng)信號,另外,添加一定比例的乙酸銨,也能改善流動相的洗脫能力和部分目標物質(zhì)的峰形。經(jīng)過對乙酸銨和甲酸加入量的優(yōu)化,最終確定采用5 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)-乙腈流動相作為實驗最終條件,能獲得更好的洗脫能力和信號強度。

表 2 采用不同固相萃取柱時9種人參皂苷的基質(zhì)效應(yīng)和回收率

2.3 前處理條件優(yōu)化

2.3.1固相萃取柱的選擇

保健食品成分相對復(fù)雜,實驗的關(guān)鍵步驟是對目標物質(zhì)的凈化和富集。在傳統(tǒng)的SPE提取凈化方法中,C18固相萃取柱[21]和HLB固相萃取柱[22]是常用的固相萃取柱類型。為考察不同固相萃取方式對復(fù)雜樣品凈化效果的影響,實驗以膠囊樣品為研究對象,以基質(zhì)效應(yīng)(ME)的大小和樣品的回收率為指標,對C18、HLB、Alumina-N/XAD-2 3種不同固相萃取柱的凈化效果進行比較(見表2)。其中,基質(zhì)效應(yīng)以基質(zhì)標準曲線各濃度點的響應(yīng)值與系列混合標準工作液中相應(yīng)濃度點的響應(yīng)值的比值計算,ME值越接近100%,表明基質(zhì)效應(yīng)越低。結(jié)果表明,經(jīng)Alumina-N/XAD-2 SPE Cartridge復(fù)合固相萃取柱凈化后,9種目標物的基質(zhì)效應(yīng)明顯低于C18和HLB柱凈化后,回收率與另外兩種萃取柱相比也有一定的優(yōu)勢。

2.3.2提取溶劑、淋洗和洗脫劑的選擇

研究采用Alumina-N/XAD-2復(fù)合固相萃取柱作為前處理的凈化柱,柱填料分別為XAD-2大孔吸附樹脂和中性氧化鋁,XAD-2大孔樹脂是一種適用范圍廣泛的固相萃取填料,通過分子排阻作用對保健食品中的糖類、蛋白質(zhì)和添加劑進行洗脫[23],中性氧化鋁填料能夠?qū)υ碥疹?、黃酮類水溶性成分或極性化合物有較強的吸附能力[24],兩種不同填料的復(fù)合使用能夠?qū)δ繕宋镔|(zhì)進行富集并與其他干擾物質(zhì)分離。水飽和的正丁醇溶液或甲醇水溶液是常見的人參皂苷提取劑,在實際操作中發(fā)現(xiàn),正丁醇或甲醇會洗脫固相萃取小柱XAD-2填料表面吸附的人參皂苷成分,需要在固相萃取上柱前先蒸干除去提取液中的醇類,再進行固相萃取富集和提取。實驗以水飽和正丁醇溶液、甲醇-水(50∶50, v/v)溶液和純水為提取溶液,分別對含有9種人參皂苷的保健食品進行提取,比較3種提取溶液的提取效率。結(jié)果表明,3種不同提取溶液對9種人參皂苷的提取效率基本一致,說明純水可以對人參皂苷進行有效提取。因此,選擇純水作為提取溶劑。

另外,洗脫劑的選擇和用量是前處理的關(guān)鍵,選擇最佳洗脫劑需要兼顧人參皂苷的洗脫率、雜質(zhì)洗脫率以及洗脫劑的用量。大孔樹脂洗脫時常用不同體積分數(shù)的乙醇溶液,乙醇的體積分數(shù)和洗脫體積對待分離成分的含量具有較大的影響[25]。通過提高洗脫液中乙醇的比例能夠使填料中吸附的人參皂苷逐漸被洗脫,實驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)洗脫劑中乙醇比例達到70%時,人參皂苷基本能夠完全洗脫,故選擇采用70%乙醇作為洗脫劑。方法考察了不同體積(5～30 mL)洗脫劑對人參皂苷提取率的影響(見圖3)。結(jié)果表明,洗脫劑達到20 mL時,基本能使人參皂苷完全洗脫。

圖 3 不同體積的洗脫劑對9種人參皂苷提取率的影響

表 3 9種人參皂苷的線性方程、相關(guān)系數(shù)、加標回收率和精密度(n=6)

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1線性范圍與檢出限

在優(yōu)化后的色譜條件下,考察了9種人參皂苷在0.005～0.5 μg/mL范圍內(nèi)的線性關(guān)系,以各分析物的質(zhì)量濃度為橫坐標,以其相應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標,得到各自的線性方程。結(jié)果顯示,9種人參皂苷在線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r2)為0.996 3～0.999 4。9種目標物在液體樣品和固體樣品中的定量限分別為2.5 mg/kg和10 mg/kg。該法靈敏度較高,可較好的應(yīng)用于保健食品中9種人參皂苷的檢測。

2.4.2回收率與精密度

按照確定的前處理方法,對保健食品基質(zhì)進行3個水平的加標回收試驗,添加水平為定量限的1、6和12倍,每個添加水平重復(fù)6次,計算回收率和精密度。結(jié)果表明，9種人參皂苷的回收率為81.1%～114.2%,精密度為0.4%～8.0%(見表3)。說明方法可滿足實驗室日常檢測的要求。

2.4.3穩(wěn)定性

實驗考察了9種人參皂苷經(jīng)提取后,在樣品瓶中放置1、4、8、12、24、48 h后的穩(wěn)定性。結(jié)果表明,9種人參皂苷含量的RSD值≤8.66%,說明該條件下樣品的穩(wěn)定性良好,能滿足測定要求。

2.4.4基質(zhì)效應(yīng)

分別選取3種代表性基質(zhì)(片劑、膠囊和口服液)的保健食品,采用1.3節(jié)的前處理方法,比較了3種代表性樣品基質(zhì)對9種人參皂苷測定的影響。結(jié)果顯示,9種人參皂苷的基質(zhì)效應(yīng)在片劑樣品、膠囊樣品和口服液樣品中分別為92.2%～102.3%、89.6%～95.3%和93.3%～105.1%。說明樣品基質(zhì)經(jīng)過前處理過程的凈化和較大體積的稀釋,基質(zhì)效應(yīng)對化合物的影響較小,采用甲醇-水(30∶70, v/v)溶劑配制的標準溶液能夠滿足測定要求。

2.5 實際樣品檢測

應(yīng)用所建立的方法分別對市售11批保健食品進行分析,其中6批原材料標識含有人參、西洋參、三七等五加科植物成分(樣品1-6), 5批未標識含有人參、西洋參、三七等五加科植物成分(樣品7-11),分別按照優(yōu)化后的前處理和分析條件處理,結(jié)果見表4。

表 4 保健食品樣品中9種人參皂苷成分的測定結(jié)果

結(jié)果表明,標識含有五加科植物配料的6批保健食品均檢出人參皂苷成分,9種人參皂苷含量占0.56%～2.68%,與樣品標簽標注總皂苷含量接近;有1批配料表僅標識葛根提取物、苦瓜提取物等成分的保健食品檢出包括人參皂苷Rf在內(nèi)的9種人參皂苷成分(樣品8), 9種人參皂苷含量占0.46%;另外4批未標識含有五加科植物成分樣品均未檢出9種人參皂苷。

3 結(jié)論

本文建立了一種快速、高效分析保健食品中9種人參皂苷的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。該法能快速測定人參提取物中9種人參皂苷的含量,通過對色譜和質(zhì)譜參數(shù)、樣品提取和凈化方式、淋洗和洗脫劑等條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明,該方法快速準確,靈敏度高,重復(fù)性好,實用性強,為保健食品中人參皂苷的檢測及質(zhì)量控制提供了可靠的技術(shù)支持。