申書昌, 李少華, 郭 麗, 呂偉超, 李秋實

(1. 齊齊哈爾大學分析測試中心, 黑龍江 齊齊哈爾 161006; 2. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院大慶分院, 黑龍江 大慶 163316)

大麻(CannabissativaL.)分為北亞種大麻(Cannabissativassp.sativa)和南亞種大麻(Cannabissativassp.indica);南亞種大麻具有精神活性,為禁止種植品種;北亞種大麻具有較高的經(jīng)濟利用價值,在造紙、紡織、功能保健食品、醫(yī)藥等行業(yè)用途廣泛[1-3]。大麻酚類化合物是大麻植物中特有的最重要的成分,其中主要是大麻二酚(CBD)、大麻酚(CBN)和Δ9-四氫大麻酚(Δ9-THC)[4,5]。大麻二酚具有藥理作用[6,7], Δ9-四氫大麻酚是使人致幻成癮的主要成分[8],大麻酚是具有醫(yī)療用途的大麻素[8]。

國際上主要根據(jù)Δ9-四氫大麻酚和大麻二酚的含量及比值將大麻分為3種化學型:毒品型大麻、中間型大麻和工業(yè)大麻[9]。由于全球范圍內(nèi)已有多個國家將醫(yī)用大麻全面合法化,促進了行業(yè)增長[10-12]。品種不同、生長環(huán)境不同的大麻中大麻酚類化合物的組成也不同,采取不同工藝條件獲得的提取物中的大麻二酚、大麻酚和Δ9-四氫大麻酚的含量也不一致[13-15]。判定大麻及其提取物的性質(zhì)及應(yīng)用對監(jiān)管部門來說非常重要[16],這也給分析化學工作者提出了重要的研究課題。

大麻中CBD、CBN和Δ9-THC含量檢測的最合適方法是液相色譜法。在目前報道的大麻中3種大麻酚測定的文獻中,多數(shù)[16-19]是采用溶劑萃取、濾膜過濾,直接進行高效液相色譜測定,這些方法存在的主要缺點是沒有對提取溶液進行很好的前處理。大麻化學成分復(fù)雜[20-23],提取液中含有一定量的葉綠素、多糖、高級脂肪酸酯及重金屬離子等成分。如果不對樣品凈化,大量的雜質(zhì)峰會影響被測組分測定結(jié)果的準確性;一些難溶于流動相的有機物、金屬鹽以及某些過渡金屬離子與流動相形成的配合物團簇離子[24]就會沉積在固定相中,雜質(zhì)累積到一定程度后會形成新的偽固定相,從而改變色譜柱的性能,對色譜柱造成嚴重的損害[25,26];有些雜質(zhì)在紫外檢測波長下不出現(xiàn)明顯的吸收峰,但仍會出現(xiàn)色譜基線波動增加分析誤差;為了防止有些雜質(zhì)在柱中滯留,需延長分析時間。對大麻提取液進行凈化是色譜分析工作者重要的研究課題。固相萃取(SPE)是一種將分析物與干擾組分有效分離的色譜分析樣品前處理方法,是大麻化學成分分析中提取液凈化的首選方法,但目前還沒有用于大麻中CBD、CBN和Δ9-THC測定的專用固相萃取柱。商品化的固相萃取柱有多種類型,張旭等[27]選用中性氧化鋁(alumina-N)固相萃取小柱對大麻的甲醇提取液進行了凈化后液相色譜測定,并考察了Florisil、C8、C18、alumina-A(酸性氧化鋁)、alumina-N、alumina-B(堿性氧化鋁)不同填料的固相小柱對CBD、CBN、Δ9-THC的吸附率;李航麒等[28]對大麻的甲醇-正己烷提取液進行了alumina-N柱凈化和HPLC測定。盡管以上文獻均得出了經(jīng)固相萃取凈化處理后,提取液的顏色(深綠色)明顯淡化的結(jié)論,但沒有考察色素的去除率以及小柱對其他雜質(zhì)的吸附性能。綜合商品化固相萃取小柱填料的性能及有關(guān)文獻的工作可見,單一吸附劑的固相萃取小柱無法解決上述大麻提取液中雜質(zhì)的去除問題。

本文依據(jù)中性氧化鋁、硅酸鎂和石墨化炭黑的分子結(jié)構(gòu)和表面特征,將3種吸附劑按最佳用量混合制成復(fù)合型專用固相萃取柱,呈現(xiàn)了極佳的吸附雜質(zhì)的效果,對3種大麻酚的回收率高。凈化后的樣品經(jīng)超高效液相色譜法(UHPLC)測定CBD、CBN、Δ9-THC的含量,結(jié)果準確可靠,重現(xiàn)性好,方法令人滿意。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

1290 InfinityⅡ型超高效液相色譜儀、Eclipse Plus C18色譜柱(50 mm×2.1 mm, 1.8 μm,美國Agilent公司); Visiprep DL SPE型固相萃取裝置(美國Supelco公司); DHG-9145A型電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司); SK2200HP型超聲波清洗儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司); IKA RW20 Digital型電動攪拌機(德國IKA公司); Adventurer系列AR1140型電子分析天平(上海奧豪斯儀器有限公司); Lamda35紫外分光光度計、NEXION-350X電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國PE公司)。

乙腈(色譜純,國藥集團化學試劑有限公司);乙酸、乙酸乙酯(分析純,天津市凱通化學試劑有限公司);甲醇(色譜純,天津市光復(fù)精細化工研究所);大麻二酚標準溶液、大麻酚標準溶液、Δ9-四氫大麻酚標準溶液(1.0 mg/mL;美國Sigma-Aldrich公司);中性氧化鋁(200～300目,國藥集團化學試劑有限公司海拓實驗室);硅酸鎂(100～200目,國藥集團化學試劑有限公司);石墨化炭黑(100～200目,上海熹恒生物科技有限公司)。

大麻花葉粉末(使用前過60目分樣篩)由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院大慶分院提供。

1.2 固相萃取小柱的制備

稱取1.80 g中性氧化鋁、0.15 g硅酸鎂和0.05 g石墨化炭黑于圓底燒瓶中,加入5 mL乙醇,用電動攪拌機攪拌均勻,除去乙醇,將剩余物轉(zhuǎn)移至瓷坩堝中,于180 ℃鼓風干燥箱中恒溫干燥2 h。取6 mL聚丙烯管,將多孔聚乙烯篩板裝入硬管底部,通過漏斗將填料加入垂直放置的聚丙烯管中,多次輕敲管壁使填料密實,將另一片多孔聚乙烯篩板裝入聚丙烯管中并壓實填料,填料上下表面平齊,制成2 g/6 mL固相萃取小柱。

1.3 標準溶液的配制

分別取大麻二酚、大麻酚和Δ9-四氫大麻酚標準溶液(1.0 mg/mL)各500 μL于10 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,制成質(zhì)量濃度均為50 mg/L的儲備液。分別吸取標準儲備液0.05、0.1、0.5、1.0、3.0 mL至5 mL容量瓶中,用甲醇定容,得到質(zhì)量濃度為0.5、1.0、5.0、10、30、50 mg/L的大麻二酚、大麻酚和Δ9-四氫大麻酚系列標準溶液。

1.4 大麻酚類化合物的提取

取0.2 g大麻花葉粉末(精確至0.000 1 g)于25 mL玻璃試管中,加入10 mL乙酸乙酯-甲醇混合溶劑(9∶1, v/v),超聲提取30 min,靜置10 min,待凈化。

1.5 樣品凈化及分析

取5 mL乙酸乙酯-甲醇混合溶劑(9∶1, v/v)活化固相萃取小柱,在柱床濕潤狀態(tài)下,將1 mL提取液以0.5 mL/min速度過自制固相萃取小柱,再用1 mL乙酸乙酯-甲醇混合溶劑洗脫殘留的被測物,流出液全部收集于玻璃試樣瓶中,在40 ℃水浴溫度下,用氮氣將溶劑吹干,用1 mL甲醇溶解,經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾后進行UHPLC分析。

1.6 色譜分析條件

色譜柱為Eclipse Plus C18柱(50 mm×2.1 mm, 1.8 μm,美國安捷倫公司),流動相為乙腈-1%乙酸水溶液(70∶30, v/v),等度洗脫,流速為0.5 mL/min,柱溫為30 ℃,檢測波長為210 nm,進樣量為1 μL,運行時間10 min。

1.7 固相萃取填料的吸附性能實驗

將中性氧化鋁、硅酸鎂和石墨化炭黑3種吸附劑按表1中的填料量制備6只復(fù)合型固相萃取小柱。分別移取一定量的大麻提取液,過0.22 μm有機相濾膜后,按1.5節(jié)操作步驟凈化樣品。

表 1 SPE柱中不同吸附劑的用量

1.8 含量測定

色素 在446 nm(葉黃素)、649 nm(葉綠素b)和665 nm(葉綠素a)波長[29]下分別測定凈化前和凈化后溶液的吸光度,計算小柱對色素的去除率。

糖 分別移取一定量的大麻提取液和凈化液,減壓真空將溶劑揮發(fā)后,用水溶解剩余物并定容,采用硫酸-苯酚法[30]測定凈化前和凈化后溶液中總糖含量,計算小柱對糖類物質(zhì)的去除率。

金屬離子 通過ICP-MS[31]測定凈化前和凈化后溶液中Cr3+、Mn4+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+、As3+、Ag+、Cd2+的含量,計算小柱對樣品中金屬離子的去除率。

脂肪酸甘油酯 將凈化前和凈化后溶液通過減壓真空去除溶劑后,經(jīng)氫氧化鉀-甲醇溶液皂化、鹽酸酸化、提取、甲酯化后,利用氣相色譜法測定脂肪酸甲酯[32]的含量,計算小柱對樣品中脂肪酸甘油酯的去除率。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇及樣品凈化的意義

由于檢測器設(shè)定的波長為210 nm,乙腈截止使用波長(190 nm)比甲醇的(205 nm)小,因此,乙腈作流動相對被測組分定量干擾小?？疾觳煌壤译?1%乙酸水溶液(10∶90、30∶70、50∶50、70∶30, v/v)作為流動相時的色譜分離效果,結(jié)果表明乙腈-1%乙酸水溶液的體積比為70∶30時,峰形對稱。

在1.6節(jié)色譜條件下,首先對未經(jīng)凈化的樣品進行分析,操作過程中發(fā)現(xiàn),隨著進樣次數(shù)的增加,色譜柱壓漸漸升高,基線波動較大,最后出現(xiàn)了色譜峰拖尾、變寬、分叉的現(xiàn)象。用甲醇、乙腈和水/甲醇分別沖洗色譜柱后,基線波動減小,但柱壓降低幅度很小,色譜峰峰形基本未變。采用新的色譜柱,將樣品凈化然后進行分析,在與未凈化樣品的進樣量及分析次數(shù)相同的情況下,未出現(xiàn)上述現(xiàn)象,色譜圖見圖1。實驗結(jié)果說明:通過增加流動相洗脫時間可以解決有些有機物雜質(zhì)在柱中滯留時間長的問題;但有些雜質(zhì)與流動相形成沉淀,殘留在色譜柱頭堵塞篩板,導(dǎo)致色譜柱無法再生。因此,對大麻提取液樣品進行凈化十分必要。

圖 1 (a)凈化樣品和(b)未凈化樣品進樣100次時的色譜圖

2.2 萃取溶劑的選擇

大麻二酚、大麻酚和Δ9-四氫大麻酚溶于甲醇、乙酸乙酯、氯仿、乙醚等多種有機溶劑中。甲醇為極性有機溶劑,相對分子質(zhì)量小、易揮發(fā),與植物纖維親和力強,易于滲透到細胞結(jié)構(gòu)中,萃取能力強。乙酸乙酯為弱極性有機溶劑,易揮發(fā),毒性低,對有機物溶解能力強,但在植物纖維中的滲透性比甲醇弱。以甲醇單一溶劑提取大麻酚類化合物時,不利于吸附劑對提取液中極性雜質(zhì)的保留,因此采用乙酸乙酯-甲醇混合溶劑(9∶1, v/v)作為萃取劑,萃取效率高,固相萃取凈化效果好。

2.3 固相萃取填料的吸附性能

在使用固相萃取法對大麻的提取液樣品凈化時,可以選擇強極性的填料去除其中的極性分子,也可以選擇非極性的填料去除其中的非極性分子,還可以選擇具有離子交換功能的填料去除金屬離子及物理吸附作用去除某些物質(zhì)。

對于中性氧化鋁、硅酸鎂和石墨化炭黑復(fù)合固相萃取小柱,3種吸附劑的用量和小柱的體積要依據(jù)對樣品的凈化效果、被測組分的回收率和被測組分的含量而確定。如果其中2種填料的用量不變,只改變1種填料用量,將會出現(xiàn)以下結(jié)果:中性氧化鋁的用量增加,會大幅度提高小柱對糖類物質(zhì)和脂肪酸甘油酯的去除率,而其他雜質(zhì)的去除率也會有所增加,但不會降低小柱對3種大麻酚類化合物的回收率;硅酸鎂用量的改變對重金屬離子的去除率影響最大,其他雜質(zhì)的去除率也有一定的變化,同時對3種大麻酚類化合物的回收率也有一定的影響。石墨化炭黑用量增加,色素的去除率迅速增加,同時直鏈脂肪酸酯的去除率較快增加,3種大麻酚類化合物的回收率也有較大的降低。

本文先設(shè)定總填料量為2 g,將3種吸附劑按等量配比(各0.67 g)制成固相萃取小柱,凈化實驗結(jié)果表明:3種大麻酚類化合物的回收率只有30%左右,葉黃素、葉綠素a和葉綠素b的去除率高于97%,總糖的去除率只有51%,總脂肪酸甘油酯的去除率為66%,重金屬離子的吸附率為90%左右。因此,本文設(shè)計了表1中的6種填料配比,制備復(fù)合型固相萃取小柱,考察各小柱的吸附性能。固相萃取小柱對3種大麻酚類及主要雜質(zhì)的去除率見圖2。

圖 2 6種不同配比復(fù)合填料固相萃取柱對3種大麻酚類化合物、色素、總糖、總脂肪酸酯及金屬離子的去除率

實驗發(fā)現(xiàn),分層填裝的小柱對提取液中組分去除率的重現(xiàn)性比3種填料均勻混合差。原因可能是石墨化炭黑用量較少,分層填裝時出現(xiàn)了柱內(nèi)不同位置的高度不一致所致。

由實驗數(shù)據(jù)可知,中性氧化鋁1.80 g、硅酸鎂0.15 g、石墨化炭黑0.05 g制成的2 g/6 mL固相萃取小柱性能最佳,確定為大麻中3種酚類成分測定專用固相萃取柱。該小柱對大麻乙酸乙酯-甲醇提取液樣品中CBD、CBN和Δ9-THC的回收率分別為98.9%、95.7%、99.2%,對葉黃素、葉綠素a和葉綠素b的去除率分別為96.3%、99.2%和95.5%,對總糖的去除率為98.5%,對脂肪酸甘油酯的去除率為96.9%,對重金屬離子的平均去除率為85.4%。

2.4 商品固相萃取小柱的應(yīng)用效果

分別選用迪科馬科技有限公司制造的用于調(diào)味品中蘇丹紅分析的商品ProElut SDH復(fù)合型專用固相萃取柱(1 g/6 mL)及天津艾杰爾-飛諾美公司制造的用于茶葉和中草藥農(nóng)殘分析的商品Cleanert TPT和Cleanert TPH復(fù)合型專用固相萃取柱(1 g/6 mL),對大麻提取液進行凈化,實驗數(shù)據(jù)見表2。

表 2 商品固相萃取小柱對3種大麻酚類化合物、色素、總糖、總脂肪酸酯及金屬離子的去除率

實驗數(shù)據(jù)可見,3種小柱對大麻提取液的凈化效果均不夠理想,同時對3種大麻酚也具有很強的吸附作用,不能準確定量。

2.5 標準曲線與樣品檢測結(jié)果

按照1.6節(jié)進行實驗,以目標物的峰面積(y)對質(zhì)量濃度(x)進行線性回歸分析,在0.5～50 mg/L的線性范圍內(nèi),測得標準溶液CBD、CBN、Δ9-THC的線性良好。

由色譜峰面積得到大麻提取液中CBD、CBN和Δ9-THC的濃度,并計算大麻中3種大麻酚的含量。按3倍噪聲對應(yīng)的樣品濃度測定檢出限。實驗結(jié)果見表3。

取5份0.1 mL大麻提取液(每份中CBD、CBN和Δ9-THC的質(zhì)量均為1.624、0.390 0和5.144 μg)于5個試劑瓶中,分別加入0.02、0.05、0.1、0.2、0.4 mL標準溶液(CBD、CBN和Δ9-THC含量均為100 mg/L);另取4份0.5 mL大麻提取液(每份中CBD、CBN和Δ9-THC的質(zhì)量均為8.125、1.950和25.72 μg)于4個試劑瓶中,分別加入0.02、0.05、0.1、0.2 mL標準溶液(CBD、CBN和Δ9-THC含量均為100 mg/L),用提取溶劑定容至1 mL。按1.5節(jié)步驟操作,平行測定5次。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)計算加標回收率,實驗結(jié)果見表4。

表 3 CBD、CBN和Δ9-THC的線性回歸方程和檢出限

表 4 CBD、CBN、Δ9-THC的加標回收率和相對標準偏差(n=5)

3 結(jié)論

中性氧化鋁、硅酸鎂和石墨化炭黑具有不同的表面特征,以1.80 g+0.15 g+0.05 g混合后裝填成2 g/6 mL專用固相萃取小柱,對乙酸乙酯-甲醇溶劑提取大麻花葉的混合液中的葉綠素、多糖、重金屬離子和脂肪酸酯具有優(yōu)良的吸附性能,實現(xiàn)了對色譜分析樣品的凈化,通過UHPLC測定大麻二酚、大麻酚和Δ9-四氫大麻酚含量,分析時間短,測定結(jié)果準確、靈敏度高。