黃丕苗，王智榮,2，陳湑慧，楊兵，施月，闞建全,2,3*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)2(中匈食品科學(xué)聯(lián)合研究中心，重慶，400715) 3(農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室(重慶)，重慶，400715)

白鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)為我國四大淡水魚之一，2018年的產(chǎn)量達到385.9萬t[1]。白鰱主要棲息于江河干流及附屬水體的上層，以浮游植物為食，具有生長速度快、繁殖能力強、抗病性強、價格低等優(yōu)點[2]。白鰱魚肉富含蛋白質(zhì)、多不飽和脂肪酸和維生素，肉質(zhì)細膩易消化，在滿足人們生活需求和豐富膳食結(jié)構(gòu)等方面有重要作用[3-4]。但白鰱具有較重的土腥味和魚腥味等缺點，降低了消費者對白鰱的可接受性，這嚴重制約了白鰱加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[5]。淡水魚的腥味物質(zhì)主要來源是魚體吸附環(huán)境中微生物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，以及多不飽和脂肪酸和氧化三甲胺在微生物和內(nèi)源酶的作用下氧化分解，生成具有強烈腥味的醛酮類物質(zhì)和三甲胺(trimethylamine，TMA)[6]。目前針對魚肉的脫腥方法主要有物理法、化學(xué)法和生物法。其中，生物法主要為發(fā)酵脫腥法，但發(fā)酵過程中會產(chǎn)生其他氣味，會影響魚肉本身的風味，適用于發(fā)酵魚制品，應(yīng)用范圍受限。化學(xué)法包括有機溶劑萃取法和酸堿鹽法等，操作簡單且具有較好的脫腥效果，但易造成化學(xué)物質(zhì)殘留，對水產(chǎn)品品質(zhì)影響較大[7]。隨著消費者保健意識的增強，綠色純天然的脫腥劑將越來越受到關(guān)注。迷迭香提取物富含迷迭香酸等活性成分，具有抑菌、抑制脂肪氧化和改善食品風味等優(yōu)點[8]。姚曉波等[9]發(fā)現(xiàn)迷迭香提取物對鱸魚進行浸泡處理后，鱸魚中己醛等腥味物質(zhì)含量降低并有效改善了鱸魚的風味。MARTINEZ-ZAMORA等[10]研究表明迷迭香提取物可以有效降低魚肉餅中的TMA含量和改善魚肉餅的風味。

本文以白鰱為研究對象，選用迷迭香提取物浸泡液對白鰱魚肉進行浸泡脫腥處理，以感官評價、TBA值和TMA值作為脫腥效果評價指標，同時，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HS-SPME-GC-MS)技術(shù)測定白鰱魚肉脫腥前后揮發(fā)性成分的變化情況，旨在尋找一種方便快捷和安全高效的白鰱魚肉脫腥方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白鰱(1.40～1.50 kg)，購于重慶市北碚區(qū)永輝超市，將活魚帶水運輸?shù)綄嶒炇?，及時宰殺處理。迷迭香提取物(食用級)，購于西安圣青生物科技有限公司。

分析純試劑：三氯乙酸、碳酸鉀和無水甲苯，成都市科隆化工試劑廠；2-硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)，源葉生物有限公司；1,1,3,3-四乙氧基丙烷，山東西亞化學(xué)有限公司；苦味酸，臺山市眾城化工有限公司；三甲胺鹽酸鹽，阿拉丁試劑(上海)有限公司。色譜純試劑：2-辛醇(99.5%，內(nèi)標)，阿拉丁試劑(上海)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S 型磁力攪拌器，河南予華儀器有限公司；SQP 電子分析天平，德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；Synergy H1 全功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；固相微萃取裝置(配有50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭)，美國 Supelco 公司；QP 2010 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

將新鮮白鰱宰殺，“三去”(去頭、去鱗、去內(nèi)臟)，清水清洗干凈后切成2 cm×2 cm×1 cm的方塊，用迷迭香提取物浸泡液對白鰱魚肉進行浸泡脫腥處理，完成后進行TBA值、TMA值和腥味值測定。

1.3.2 迷迭香提取物浸泡脫腥處理的單因素試驗

隨機選取預(yù)處理后的白鰱魚肉塊，稱重，然后進行迷迭香提取物的脫腥浸泡試驗。稱取一定量的白鰱肉去腥，分別研究了不同濃度的迷迭香提取物浸泡液(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L)、不同料液比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6，g∶mL)、不同浸泡時間(0、20、30、40、50、60 min)對白鰱魚肉TBA值、TMA值以及腥味值的影響。

1.3.3 Box-Benhnken 試驗設(shè)計

結(jié)合單因素試驗的結(jié)果，根據(jù) Box-Benhnken 的中心組合實驗設(shè)計原理，以迷迭香提取物質(zhì)量濃度、料液比、浸泡時間為響應(yīng)變量，以TBA值、TMA值、腥味值為響應(yīng)值進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。Box-Benhnken 試驗因素水平表見表1。

表1 Box-Benhnken 試驗因素與水平表Table 1 Box-benhnken response surface and test factor level table

根據(jù)表1的試驗設(shè)計及各因素水平，運用Design-Expert (Version 8.0.6)產(chǎn)生17組相關(guān)試驗，其中5個為中心點實驗，12個為析因?qū)嶒灒唧w實驗設(shè)計列于結(jié)果部分(表2)。同時運用上述軟件對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，按公式(1)擬合出多元二次數(shù)學(xué)回歸模型：

(1)

1.3.4 評價指標的測定

1.3.4.1 TBA值測定

參考NIAN等[11]的方法，稱取2 g脫腥前后的白鰱魚肉，置于50 mL離心管中，加入5%三氯乙酸溶液20 mL，常溫下靜置30 min，離心(7 500 r/min，10 min)，后取上清液，上清液用超純水定容到50 mL。然后取5 mL上述溶液于試管中，加入5 mL的TBA(0.02 mol/L)振蕩混勻，置于沸水浴中20 min，結(jié)束后冷卻至室溫，反應(yīng)液在532 nm處測定吸光值，并作空白試驗。以1,1,3,3-四乙氧基丙烷制備標準曲線，結(jié)果表示為mg 丙二醛(malondialdehyde，MDA)/kg樣品。

1.3.4.2 TMA值測定

參考YU等[12]的方法，稱取3 g脫腥前后的白鰱魚肉樣品，置于50 mL離心管中，加入7.5%三氯乙酸溶液27 mL，離心(8 000 r/min，10 min)后取上清液，上清液用超純水定容到50 mL。然后取5 mL上述溶液與1 mL甲醛溶液，10 mL甲苯和3 mL飽和碳酸鉀溶液振蕩混勻，常溫下靜置20 min。取5 mL上層甲苯溶液于試管中，加入0.02%苦味酸甲苯溶液5 mL，將其充分混勻，在410 nm處測吸光值，并做空白試驗。以三甲胺制備標準曲線，結(jié)果以mg/kg樣品表示。

1.3.4.3 腥味值測定

(1)感官評價人員的選擇

在西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院招募志愿者，將三甲胺稀釋為不同濃度梯度(10～1 000 mg/L)的供試液，測試受評人員(身體健康，無嗅覺障礙)的腥味敏感度，最終篩選出8名嗅覺靈敏的感官分析人員(4男4女，年齡20～28歲)。對這些感官評價人員進行定期感官評定訓(xùn)練，使他們熟悉嗅覺語言和嗅覺評價方[13]。

(2)感官評價方法

參照SHOKRI等[14]的方法并做適當修改，感官評價人員對魚肉的腥味進行5分制感官評定。以100 mg/L的TMA水溶液為標準參照，定義腥味強度為5分。氣味強度進行如下評級：1，非常微弱；2，弱；3，正常；4，強勁；5，非常強勁。

1.3.4.4 揮發(fā)性成分測定

取3 g魚肉置于20 mL螺口頂空樣品瓶中，再向瓶內(nèi)加入100 μg/mL的2-辛醇標準品1 μL作為內(nèi)標物，最后加入7 mL的250 g/L的NaCl溶液及磁轉(zhuǎn)子，密封。將已活化好的DVB/CAR/PDMS萃取頭插入頂空瓶當中，在60 ℃下平衡15 min后開始萃取，相同條件頂空吸附30 min，萃取完成后在GC-MS進樣口解吸5 min，進行氣質(zhì)測定。

氣相色譜條件：采用DB-5MS毛細管(30 m×0.25 mm，0.25 μm)色譜柱。升溫程序：柱初溫度40 ℃，保持2 min，先以5 ℃/min升溫到150 ℃，1.5 ℃/min升溫到165 ℃，再以15 ℃/min升溫到210 ℃，最后以10 ℃/min升溫到250 ℃，保持5 min，進樣口溫度250 ℃；載氣(氦氣)流速為1.2 mL/min。

質(zhì)譜條件如下：接口溫度280 ℃；電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；質(zhì)量掃描范圍：30～500 m/z。

樣品中各揮發(fā)性成分的含量Ci(μg/kg)按公式計算：

(2)

式中：ρ，內(nèi)標物的質(zhì)量濃度，μg/mL；V，內(nèi)標物體積，μL；Si，各揮發(fā)性組分的峰面積；S，內(nèi)標物質(zhì)的峰面積；m，樣品的質(zhì)量，g；1 000，換算系數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每個樣品3次重復(fù)測定，采用SPSS 19.0進行ANOVA單因素方差分析及Ducan檢驗(P<0.05)，以平均值±標準偏差表示。圖表繪制采用Origin 8.6軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 迷迭香提取物濃度對白鰱魚肉脫腥效果的影響

迷迭香提取物濃度單因素試驗時，固定料液比1∶3(g∶mL)，浸泡時間30 min。由圖1可知，TBA值、TMA值和腥味值都隨著迷迭香提取物濃度的增加呈先下降后趨于平穩(wěn)的變化趨勢。TBA值越高代表脂肪氧化產(chǎn)生的醛酮類物質(zhì)越多，醛酮類物質(zhì)會使白鰱魚肉產(chǎn)生腥味，因此TBA值和腥味是緊密聯(lián)系的[15]?？瞻捉M的TBA值為0.631 mg MDA/kg，1.5 g/L組的TBA值為空白組的59.97%，可見迷迭香提取物能有效抑制脂肪氧化，從而降低白鰱魚肉腥味。原因可能是迷迭香提取物中的迷迭香酸等活性成分可以取代自由基作用于不飽和脂肪酸，達到抑制脂肪氧化的效果[16]。LAN等[17]也發(fā)現(xiàn)迷迭香提取物可以有效抑制大黃魚的脂肪氧化并改善大黃魚風味。TMA是主要由微生物分解氧化三甲胺所生成的，是導(dǎo)致水產(chǎn)品腥味的主要化合物之一[18]。空白組的TMA為1.900 mg/kg，1.5 g/L組的TMA值為空白組的77.37%，可見迷迭香提取物能有效減少白鰱的TMA含量，從而降低白鰱腥味程度。原因可能是迷迭香提取物含有迷迭香酸、鼠尾草酸等活性成分，使微生物的活性降低，從而減緩了微生物分解氧化三甲胺的過程。YU等[12]用天然提取物丁香精油能減少TMA的含量并改善草魚風味。腥味值的降低可能是因為迷迭香提取物中的活性成分脫除了白鰱魚肉中醛酮類腥味物質(zhì)。TBA值和TMA值在迷迭香提取物濃度大于1.5 g/L時變化不顯著，且提取物濃度過大時，會破壞白鰱魚肉本身的風味和對白鰱魚肉的色澤產(chǎn)生一定影響。因此，選擇質(zhì)量濃度1.5 g/L為后續(xù)響應(yīng)面試驗的中心點。

圖1 迷迭香提取物濃度對白鰱魚肉脫腥效果的影響Fig.1 Effect of rosemary extract concentration on the deodorization effect of silver carp注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.1.2 料液比對白鰱魚肉脫腥效果的影響

料液比單因素試驗時，固定迷迭香提取物的質(zhì)量濃度為1.5 g/L，浸泡時間30 min。由圖2可知，TBA值、TMA值和腥味值都隨著料液比的增加呈先下降后趨于平穩(wěn)的變化趨勢。當料液比為1∶3(g∶mL)時，TBA、TMA值和腥味值分別為0.364 mg MDA/kg、1.567 mg/kg和2.25。隨著迷迭香提取物溶液用量的增加，對TBA值和TMA值無顯著性變化。因此，選擇料液比1∶3(g∶mL)為后續(xù)響應(yīng)面試驗的中心點。

圖2 料液比對白鰱魚肉脫腥效果的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratio on deodorization of silver carp

2.1.3 浸泡時間對白鰱魚肉脫腥效果的影響

浸泡時間單因素試驗時，固定迷迭香提取物質(zhì)量濃度為1.5 g/L，料液比1∶3(g∶mL)。由圖3可知，TBA值和TMA值隨著脫腥浸泡時間的延長呈先下降后上升的變化趨勢，TBA值和TMA值上升的原因可能是隨著浸泡時間的延長，迷迭香提取物浸泡液中活性成分活力降低及內(nèi)源酶的作用時間延長[19]。浸泡時間為40 min時TBA值最小。浸泡時間為30 min時TMA值最小，且浸泡時間為30～50 min時TMA值無顯著性變化，60 min時TMA值反而上升。浸泡時間為40 min時的腥味值趨于穩(wěn)定，再延長浸泡時間腥味值無顯著性變化。張海燕等[20]研究表明浸泡時間過長對魚肉的質(zhì)地也會產(chǎn)生不良影響。因此，選擇浸泡時間40 min為后續(xù)響應(yīng)面試驗的中心點。

圖3 浸泡時間對白鰱魚肉脫腥效果的影響Fig.3 Effect of soaking time on deodorization of silver carp

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

采用Box-Behnken 設(shè)計試驗，以迷迭香提取物濃度、料液比和浸泡時間為響應(yīng)變量，以TBA值、TMA值、腥味值為響應(yīng)值進行響應(yīng)面優(yōu)化。試驗結(jié)果以及回歸模型方差分析見表2和表3。

表2 響應(yīng)面試驗方案和結(jié)果Table 2 Response surface test plan and results

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

各因素F值可以反映出各因素對試驗指標的重要性，F(xiàn)值越大表明對試驗指標影響越大，結(jié)合表3得出，按照各因素對TBA值影響程度大小排序為：濃度>料液比>浸泡時間。按照各因素對TMA值和腥味值影響程度大小排序均為料液比>濃度>浸泡時間。TBA值、TMA值和腥味值的響應(yīng)面見圖4，可以看出TBA值隨各因素的變化幅度較大，濃度、料液比和浸泡時間的兩兩之間交互作用顯著。TMA值隨各因素的變化幅度較大，濃度和料液比，濃度和浸泡時間的交互作用不顯著，浸泡時間和料液比的交互作用顯著。腥味值隨各因素的變化幅度較大，濃度、料液比和浸泡時間的兩兩之間交互作用顯著。

a-TBA值響應(yīng)值；b-TMA值響應(yīng)值；c-腥味值響應(yīng)值圖4 各因素交互作用對TBA值、TMA值和腥味值的影響Fig.4 Effects of interaction between two factors on TBA value, TMA value and fishy taste value

優(yōu)化得到的脫腥條件為迷迭香提取物的質(zhì)量濃度為1.7 g/L，料液比1∶3.4(g∶mL)，浸泡時間41 min，在上述條件下，模型預(yù)測TBA值為0.348 mg MDA/kg，TMA值為1.506 mg/kg，腥味值為1.82。為了驗證模型的可行性，在上述去腥條件下進行3次驗證試驗，測得TBA值為(0.349±0.016) mg MDA/kg，TMA值為(1.550±0.056) mg/kg，腥味值為1.81±0.07。該結(jié)果與模型預(yù)測值基本一致，可見模型能很好地預(yù)測迷迭香提取物對白鰱魚肉的脫腥效果，模型結(jié)果可靠。

2.3 脫腥前后白鰱魚肉揮發(fā)性成分的測定與分析

由表4可知，通過HS-SPME-GC-MS測定分析，空白組和迷迭香處理組分別檢測出24種和14種揮發(fā)性成分，經(jīng)過迷迭香提取物處理后，白鰱魚肉中揮發(fā)性成分的數(shù)量及含量都有所下降。

醛類化合物是脂質(zhì)氧化降解的二級產(chǎn)物，閾值較低，對魚腥味的影響較大[21]。由表4可知，經(jīng)過迷迭香提取物處理后，醛類物質(zhì)種類從7種減少到4種，總量從14.40 μg/kg減少到1.92 μg/kg，下降率為86.67%。己醛主要由亞油酸和亞麻酸氧化分解產(chǎn)生，對魚腥味的貢獻是所有醛類之中最大的[22]。庚醛、辛醛、壬醛、癸醛和E-2-辛烯醛也被證實是產(chǎn)生魚腥味的主要化合物[23]。脫腥后，己醛和庚醛下降率為100%，辛醛、壬醛、E-2-辛烯醛和癸醛的含量均呈下降趨勢，辛醛下降率為70.37%，壬醛下降率為51.43%，癸醛下降率為42.11%以及E-2-辛烯醛下降率為77.36%。這表明，經(jīng)過迷迭香提取物處理可以減少醛類物質(zhì)含量，降低魚腥味。

在空白組中檢測到6種醇類物質(zhì)，分別為己醇、庚醇、1-辛烯-3-醇、1,7-辛二烯-3-醇、2-辛烯-1-醇和十一醇，其中1-辛烯-3-醇含量最高。脫腥后，僅檢測出1-辛烯-3-醇和1,7-辛二烯-3-醇，醇類物質(zhì)總量從31.59 μg/kg減少到5.64 μg/kg。1-辛烯-3-醇呈蘑菇味和魚腥味，對白鰱的腥味有較大貢獻[24]。脫腥后，1-辛烯-3-醇由原來的13.78 μg/kg下降到2.76 μg/kg，同樣說明，迷迭香提取物去除腥味物質(zhì)效果明顯。

在空白組中檢測到6種烴類物質(zhì)，其中5種烷烴類物質(zhì)，1種烯烴類物質(zhì)，而烷烴類物質(zhì)含量較高。這些物質(zhì)可能是不飽和脂肪酸發(fā)生氧化反應(yīng)而產(chǎn)生的[25]。烷烴類化合物的閾值較高，對風味影響較小。烯烴類化合物在一定條件下會發(fā)生反應(yīng)生成醛和酮，是形成魚腥味的潛在物質(zhì)[26]。脫腥后，白鰱魚肉中的烴類物質(zhì)也有不同程度的減少。

酮類和酯類物質(zhì)的閾值較高，對魚腥味的貢獻較小[27]。白鰱檢測出2,5-辛二酮和2-壬酮這2種物質(zhì)，含量較少，對魚肉的風味貢獻也較小。脫腥后，2,5-辛二酮含量減少，2-壬酮被完全去除。白鰱檢測出3種酯類物質(zhì)和1種肟類物質(zhì)經(jīng)過處理后均有不同程度的減少。

表4 白鰱魚肉脫腥前后揮發(fā)性成分的變化Table 4 Changes of volatile components of silver carp with and without deodorization

3 結(jié)論

本文以迷迭香提取物為研究對象，探討其對白鰱魚肉的脫腥效果，以及脫腥前后的揮發(fā)性物質(zhì)變化。結(jié)果顯示，響應(yīng)面法優(yōu)化的最優(yōu)脫腥條件：迷迭香提取物質(zhì)量濃度為1.7 g/L，料液比1∶3.40(g∶mL)，浸泡時間41 min。在此條件下脫腥，TBA值、TMA值和腥味值均顯著降低。對魚腥味有重要貢獻的腥味物質(zhì)，如己醛、庚醛、辛醛、壬醛和1-辛烯-3-醇等含量也顯著降低，分別降低了100%、100%、70.37%、51.43%和79.97%。本文說明迷迭香提取物處理可以有效抑制白鰱魚肉的脂肪氧化并改善白鰱魚肉風味，對推動白鰱加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有積極意義。