劉耀耀，劉哲，李珊，王金美，葉英,2*，曹效海*

1(青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧,810016)2(青海省青藏高原農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧,810016)

隨著食品科學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，食品安全逐漸成為食品工業(yè)中不可忽視的全球性問(wèn)題，由微生物引起的食品腐敗與疾病給世界各國(guó)造成了損失，目前廣泛應(yīng)用的化學(xué)防腐劑價(jià)格低廉，雖然可以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，但對(duì)人體有一定的致畸、致癌和致突變作用。蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)是一種內(nèi)生芽孢的革蘭氏陽(yáng)性桿狀菌，寄生于土壤中，污染多種食品，如大米、蔬菜、雞蛋、肉制品、乳制品等[1]，蠟樣芽孢桿菌是與食物中毒相關(guān)的食源性致病菌之一，能產(chǎn)生多種毒素[2]導(dǎo)致腹瀉和嘔吐等癥狀，因此尋找高效安全的天然保鮮劑來(lái)應(yīng)對(duì)食品腐敗菌具有重大意義。

狹果茶藨子(RibesstenocarpumMaxim)屬虎耳草科植物，全世界約有160種，青海省有11種，1個(gè)變種[3]。茶藨子為落葉灌木，生于山坡灌叢、云杉林和雜木林下或山溝中[4]。研究發(fā)現(xiàn)，茶藨子的化學(xué)成分主要為不飽和脂肪酸、有機(jī)酸、多糖、黃酮類化合物等[5]。前期研究發(fā)現(xiàn)，青藏高原狹果茶藨子提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等具有一定的抑制作用[6]，具有成為新型多功能食品添加劑的潛力，為了拓寬狹果茶藨子在食品防腐保鮮中的應(yīng)用，本研究以蠟樣芽孢桿菌為試驗(yàn)菌，探究青藏高原狹果茶藨子提取物對(duì)其抑菌作用及作用機(jī)理，以期為狹果茶藨子天然食品保鮮劑的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

狹果茶藨子產(chǎn)自青海大通東峽鄉(xiāng)；蠟樣芽孢桿菌(CMCC(B) 63303)，上海魯微科技有限公司；超微量ATP酶、蘋果酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、堿性磷酸酶試劑盒，南京建成生物科技有限公司；碘硝基氯化四氮唑藍(lán)(iodonitrotetrazolium chloride，INT)，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RF-6000熒光分光光度計(jì)，日本島津公司；Micro-GCM微生物生長(zhǎng)曲線儀，德國(guó)BMG公司；JSM-6610LV掃描電鏡，日本電子公司；MF1顯微細(xì)胞分析/菌落計(jì)數(shù)/抑菌圈測(cè)量聯(lián)用儀，杭州迅數(shù)科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 狹果茶藨子粗提物的制備

狹果茶藨子低溫烘干，粉碎，過(guò)60目篩，取1 000 g樣品加入95%乙醇回流提取2 h，提取2次，過(guò)濾后合并濾液并濃縮，得到總粗提物80 g，分別用乙酸乙酯、正丁醇萃取，制備乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物。

采用AB-8大孔樹(shù)脂進(jìn)一步分離純化乙酸乙酯提取物(40 g)，分別用蒸餾水、20%、40%、60%、80%、100%(體積分?jǐn)?shù))乙醇梯度洗脫，收集不同極性洗脫液，濃縮，低溫冷凍干燥，得組分DW1、DW2、DW3、DW4、DW5、DW6，其中DW1為19 g，4 ℃密封儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 抑菌活性測(cè)定

將蠟樣芽孢桿菌活化后，用無(wú)菌生理鹽水稀釋，比濁至0.5麥?zhǔn)蠁挝?，配制不同濃度狹果茶藨子提取物，并放入藥敏紙片浸泡12 h，采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，菌落計(jì)數(shù)器測(cè)量抑菌圈直徑[7]。

1.3.3 最低抑菌濃度和最低殺死濃度測(cè)定

參照KANG等[8]的方法測(cè)定最低抑菌濃度和最低殺死濃度。

1.3.4 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將細(xì)菌接至含有提取物的96孔板，使終濃度分別為1/16最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)、1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC、最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)，置于微生物生長(zhǎng)曲線檢測(cè)系統(tǒng)中培養(yǎng)35 h(37 ℃ 200 r/min)，每30 min測(cè)定1次，繪制生長(zhǎng)曲線[9]。

1.3.5 細(xì)胞膜膜蛋白測(cè)定

參照WANG等[10]的方法測(cè)定蠟樣芽孢桿菌細(xì)胞膜膜蛋白的熒光光譜。

1.3.6 堿性磷酸酶測(cè)定

參照SONG等[11]的方法測(cè)定堿性磷酸酶活性。

1.3.7 核酸及蛋白質(zhì)泄漏試驗(yàn)

參照LIU等[12]的方法測(cè)定核酸蛋白質(zhì)泄露。

1.3.8 ATP酶測(cè)定

參照WANG等[13]的方法測(cè)定蠟樣芽孢桿菌中Na+K+-ATP酶、Ca2+Mg2+-ATP酶、T-ATP酶的活性。

1.3.9 呼吸鏈脫氫酶測(cè)定

取培養(yǎng)4 h的蠟樣芽孢桿菌與1 mL提取物混合，37 ℃ 120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)1 h，菌懸液離心并用生理鹽水清洗，加入2.7 mL PBS 和0.3 mL INT混合后于室溫下避光暗處理1 h，490 nm[14]下測(cè)定吸光度值。

1.3.10 掃描電鏡觀察

參照LI等[15]的方法觀察細(xì)胞微觀變化。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌活性篩選

狹果茶藨子提取物對(duì)蠟樣芽孢桿菌抑菌效果如表1所示，抑菌圈直徑大小關(guān)系為乙酸乙酯提取物>正丁醇提取物>水提取物，抑菌活性與提取物濃度成正比，當(dāng)乙酸乙酯提取物質(zhì)量濃度為400 mg/mL時(shí)，抑菌圈直徑(19.21±0.11) mm，表現(xiàn)為高敏，效果明顯優(yōu)于正丁醇提取物和水提取物，說(shuō)明乙酸乙酯提取物為抑制蠟樣芽孢桿菌的有效活性部位。

表1 不同提取物濃度對(duì)蠟樣芽孢桿菌抑菌圈直徑的影響 單位：mm

乙酸乙酯提取物經(jīng)AB-8大孔吸附樹(shù)脂分離純化后，得到6個(gè)組分，其抑菌效果如表2所示，其中DW1組分抑菌活性最強(qiáng)，其次為DW2組分，其他組分則無(wú)抑菌作用；當(dāng)DW1質(zhì)量濃度為300 mg/mL時(shí)，抑菌圈直徑(18.54±0.52) mm，表現(xiàn)為高敏，與食品中常用的防腐保鮮劑丙酸鈉、山梨酸鉀、苯甲酸鈉和脫氫乙酸鈉比較，丙酸鈉與山梨酸鉀對(duì)蠟樣芽孢桿菌無(wú)抑制作用，苯甲酸鈉、脫氫乙酸鈉、青霉素和氨芐西林抑菌圈直徑均小于DW1，因此后期抑菌機(jī)制試驗(yàn)選用DW1組分進(jìn)行，抑菌效果DW1>脫氫乙酸鈉>苯甲酸鈉>山梨酸鉀=丙酸鈉，DW1抑菌效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥氨芐西林(10/10 μg)和青霉素(10 U)。

表2 不同組分對(duì)蠟樣芽孢桿菌抑菌圈直徑的影響 單位：mm

2.2 最低抑菌濃度和最低殺菌濃度

狹果茶藨子提取物對(duì)蠟樣芽孢桿菌具有較強(qiáng)抑制作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MIC為3.13 mg/mL，MBC為6.25 mg/mL，為MIC的2倍，空白對(duì)照無(wú)抑菌作用。

2.3 蠟樣芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果

狹果茶藨子提取物對(duì)蠟樣芽孢桿菌生長(zhǎng)影響如圖1所示，對(duì)照組遲緩期為1 h，隨后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，5 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，35 h內(nèi)未進(jìn)入衰亡期，MBC和MIC組吸光值變化較小，即細(xì)菌生長(zhǎng)較少，1/2 MIC組第16 h進(jìn)入生長(zhǎng)期，持續(xù)至26 h，1/4 MIC組2 h時(shí)進(jìn)入生長(zhǎng)期，12 h進(jìn)入穩(wěn)定期，1/8 MIC組與1/16 MIC與對(duì)照相差較小，抑制作用不明顯，結(jié)果表明，當(dāng)濃度為MIC和MBC時(shí)，提取物抑制蠟樣芽孢桿菌生長(zhǎng)繁殖，當(dāng)濃度為1/2 MIC和1/4 MIC時(shí)，表現(xiàn)為遲緩期和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)。

圖1 不同濃度狹果茶藨子提取物下蠟樣芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of B.cereus under different concentrations of R.stenocarpum extract

2.4 提取物濃度對(duì)蠟樣芽孢桿菌膜蛋白的影響

膜蛋白是細(xì)胞的重要組成部分，在物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)等方面具有重要功能。膜蛋白中含有苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)、酪氨酸(tyrosine，Tyr)和色氨酸(tryptophan， Trp)等氨基酸，可以在膜蛋白中發(fā)出熒光。KI是一種熒光淬滅劑，可以定性確定Phe、Trp、Tyr殘基在蛋白質(zhì)中的位置。圖2顯示了不同濃度KI處理蠟樣芽孢桿菌膜蛋白氨基酸殘基的熒光光譜，KI濃度從上到下依次為0.005、0.01、0.015、0.02、0.025、0.03 mol/L。結(jié)果表明，隨著KI濃度增加苯丙氨酸熒光淬滅效果明顯，色氨酸和酪氨酸熒光淬滅效果不明顯，表明色氨酸和酪氨酸殘基主要位于細(xì)胞膜內(nèi)部。圖3顯示了不同濃度狹果茶藨子提取物對(duì)蠟樣芽孢桿菌膜蛋白熒光光譜的影響，提取物濃度從上到下依次為1/32 MIC、1/16 MIC、1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC、MBC，結(jié)果表明，隨著提取物濃度增加，各氨基酸熒光強(qiáng)度均逐漸下降、當(dāng)濃度為MIC和MBC時(shí)，伴隨明顯紅移，這表明狹果茶藨子提取物可能與膜蛋白結(jié)合，改變了蠟樣芽孢桿菌細(xì)胞膜膜蛋白的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，使Phe、Trp 和Tyr 殘基變得更加親水[16]，導(dǎo)致細(xì)胞膜功能障礙和細(xì)胞損傷。

a-苯丙氨酸;b-色氨酸;c-酪氨酸圖2 不同濃度KI 下蠟樣芽孢桿菌膜蛋白氨基酸殘基熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra of amino acid residues of B.cereus membrane proteins under different concentrations of KI

a-苯丙氨酸;b-色氨酸;c-酪氨酸圖3 不同濃度狹果茶藨子提取物下蠟樣芽孢桿菌膜蛋白氨基酸殘基熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of amino acid residues of B.cereus membrane proteins under different concentrations of R.stenocarpum extract

2.5 堿性磷酸酶活力測(cè)定結(jié)果

堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)存在于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間，當(dāng)細(xì)胞壁被破壞，堿性磷酸酶會(huì)流出[17]。不同濃度狹果茶藨子提取物對(duì)蠟樣芽孢桿菌堿性磷酸酶活性影響如圖4所示，對(duì)照組AKP活性為1.11金氏單位/mg prot，MBC組AKP活性為3.60金氏單位/mg prot，是對(duì)照組的3.24倍，隨著提取物濃度的增大，AKP活性增加，說(shuō)明蠟樣芽孢桿菌細(xì)胞壁受損越嚴(yán)重，堿性磷酸酶流出越多。

圖4 不同濃度狹果茶藨子提取物下蠟樣芽孢桿菌AKP活力影響Fig.4 AKP activity of B.cereus at the different concentrations of R.stenocarpum extract

2.6 核酸及蛋白質(zhì)泄露結(jié)果

核酸和蛋白質(zhì)對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)、新陳代謝、維持細(xì)胞功能有重要作用，細(xì)胞膜損傷，胞內(nèi)物質(zhì)就會(huì)泄露，細(xì)胞膜的完整性對(duì)細(xì)菌發(fā)育至關(guān)重要[18]。狹果茶藨子提取物對(duì)蠟樣芽孢桿菌核酸及蛋白質(zhì)泄露影響結(jié)果如圖5所示，對(duì)照組核酸及蛋白質(zhì)幾乎不發(fā)生泄露，12 h內(nèi)OD280值、OD260值變化不大，經(jīng)狹果茶藨子提取物處理后，蠟樣芽孢桿菌核酸蛋白質(zhì)泄露與樣品濃度呈正相關(guān)，其中MBC組OD280值從0.01增加至0.16，OD260值從0.01增加至0.15，說(shuō)明隨著時(shí)間和濃度增加，蠟樣芽孢桿菌核酸及蛋白質(zhì)泄露程度加劇，即細(xì)胞膜破損越嚴(yán)重，進(jìn)而影響細(xì)胞生長(zhǎng)和新陳代謝，最終導(dǎo)致蠟樣芽孢桿菌死亡。

a-蛋白質(zhì)泄露;b-核酸泄露圖5 不同濃度狹果茶藨子提取物下蠟樣芽孢桿菌核酸及蛋白質(zhì)泄露Fig.5 Nucleic acid and protein leakage of B.cereus at different concentrations of R.stenocarpum extract

2.7 ATP酶活性測(cè)定結(jié)果

Na+K+-ATP酶即鈉鉀泵，能促進(jìn)ATP的水解，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈉/鉀離子濃度，為Na+、K+的跨膜運(yùn)輸提供能量，從而保持細(xì)胞的靜息電位；Ca2+Mg2+-ATP酶主要功能是建立跨膜的離子梯度、維持細(xì)胞內(nèi)外離子平衡及滲透壓平衡[19]。狹果茶藨子提取物對(duì)蠟樣芽孢桿菌ATP酶的影響結(jié)果如圖6所示，隨著提取物濃度升高，3種酶活性均升高，對(duì)照組Na+K+-ATP酶活性為11.99 U/mg prot，Ca2+Mg2+-ATP酶活性為3.79 U/mg prot，T-ATP酶活性為15.65 U/mg prot，MBC組Na+K+-ATP酶活性27.69 U/mg prot，為對(duì)照組的2.3倍，Ca2+Mg2+-ATP酶活性 8.34 U/mg prot，為對(duì)照組的2.2倍，T-ATP酶活性 59.47 U/mg prot，為對(duì)照組的3.8倍，以上數(shù)據(jù)表明，狹果茶藨子提取物能有效提高Na+K+-ATP酶、Ca2+Mg2+-ATP酶及T-ATP酶的活性，激活蠟樣芽孢桿菌膜結(jié)合離子通道，顯著破壞細(xì)胞膜，增加細(xì)胞膜的通透性；細(xì)菌通過(guò)改變細(xì)胞膜內(nèi)外離子濃度以抵抗不利環(huán)境的影響，保持細(xì)胞內(nèi)外電化學(xué)梯度的平衡[20]，這與LI等[21]的研究一致。

圖6 不同濃度狹果茶藨子提取物對(duì)蠟樣芽孢桿菌ATP活性的影響Fig.6 Effects of ATPase activity of B.cereus at different concentrations of R.stenocarpum extract

2.8 呼吸鏈脫氫酶活力測(cè)定結(jié)果

呼吸鏈脫氫酶是TCA循環(huán)中的關(guān)鍵酶，反映了細(xì)胞呼吸作用的強(qiáng)度和生成ATP的能力[22]。狹果茶藨子提取物對(duì)蠟樣芽孢桿菌呼吸鏈脫氫酶活性影響如圖7所示，圖中對(duì)照組OD值為3.12，MBC組OD值為1.08(僅為對(duì)照組的1/3)，呼吸鏈脫氫酶酶活性隨提取物濃度的升高而降低，說(shuō)明經(jīng)狹果茶藨子提取物處理后蠟樣芽孢桿菌中呼吸鏈脫氫酶活性顯著下降，提取物可能通過(guò)抑制蠟樣芽孢桿菌呼吸鏈脫氫酶活性，進(jìn)而抑制呼吸作用和能量供應(yīng)，最終導(dǎo)致菌體細(xì)胞死亡。

圖7 不同濃度狹果茶藨子提取物對(duì)蠟樣芽孢桿菌呼吸鏈脫氫酶活力影響Fig.7 Effects of respiratory chain dehydrogenase activity of B.cereus at different concentrations of R.stenocarpum extract

2.9 掃描電鏡觀察結(jié)果

不同濃度提取物對(duì)蠟樣芽孢桿菌微觀形態(tài)影響如圖8所示，對(duì)照組蠟樣芽孢桿菌呈桿狀，無(wú)異常凸起或凹陷，細(xì)胞形態(tài)完整，表面光滑，MBC組細(xì)胞褶皺，表面有嚴(yán)重凸起和凹陷，細(xì)胞嚴(yán)重變形，MIC組細(xì)胞呈桿狀，表面有褶皺，表面不光滑，1/2MIC組部分細(xì)胞有褶皺、但形態(tài)完整，變形程度MBC組>MIC組>1/2MIC組>對(duì)照組，即變形程度與提取物濃度呈正相關(guān)，提取物濃度越高，細(xì)胞變形越明顯。

a-MBC;b-MIC;c-1/2 MIC;d-對(duì)照?qǐng)D8 不同濃度狹果茶藨子提取物對(duì)蠟樣芽孢桿菌微觀形態(tài)影響Fig.8 SEM photomicrographs of B.cereus treated with different concentrations of R.stenocarpum extract

3 結(jié)論

本研究以青藏高原狹果茶藨子為原料，探討其對(duì)蠟樣芽孢桿菌的抑菌活性及作用機(jī)制，研究表明，狹果茶藨子提取物對(duì)蠟樣芽孢桿菌有明顯抑制作用，乙酸乙酯萃取物為抑制蠟樣芽孢桿菌的有效極性部位，且有效活性物質(zhì)主要存在于DW1組分中，當(dāng)其質(zhì)量濃度為300 mg/mL時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)(18.54±0.52) mm，表現(xiàn)為極敏；狹果茶藨子提取物對(duì)蠟樣芽孢桿菌的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度分別為3.13和6.25 mg/mL。初步抑菌機(jī)制試驗(yàn)表明，狹果茶藨子提取物可以改變蠟樣芽孢桿菌細(xì)胞膜膜蛋白的構(gòu)象，造成核酸和蛋白質(zhì)泄露，破壞細(xì)胞壁，導(dǎo)致堿性磷酸酶流出，通過(guò)抑制琥珀酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、呼吸鏈脫氫酶的活力抑制呼吸作用和能量代謝，同時(shí)提高Na+K+-ATP酶、Ca2+Mg2+-ATP酶活力，激活膜結(jié)合離子通道，細(xì)胞膜內(nèi)外離子濃度被改變以抵抗不利環(huán)境的影響；掃描電鏡結(jié)果表明狹果茶藨子提取物可導(dǎo)致蠟樣芽孢桿菌細(xì)胞嚴(yán)重變形，表面有異常凸起和凹陷，最終導(dǎo)致菌體細(xì)胞死亡。