周曉君，軒斷斷，張冠男，牛莉娜，蘇嶼，譚奇燕，鄧垂文，王旭明

(1.海南醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室海南醫(yī)學(xué)院—香港大學(xué)熱帶傳染病聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，海口571199；2.海南省人民醫(yī)院 海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院檢驗(yàn)科，?？?570311；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院風(fēng)濕免疫科 國家皮膚與免疫疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京100730)

活潑瘤胃球菌(Ruminococcusgnavus)為專性厭氧、無孢子、無動(dòng)力或有動(dòng)力、革蘭陽性球菌，屬于人類、牛、綿羊和山羊等腸道正常菌群。革蘭陽性厭氧球菌(gram-positive anaerobic cocci, GPAC)約占臨床厭氧致病菌的25%～30%[1]。國外有關(guān)活潑瘤胃球菌感染的報(bào)道偶見[2]，但國內(nèi)相關(guān)報(bào)道罕見。本研究對1例結(jié)腸息肉摘除后患者血培養(yǎng)中分離的活潑瘤胃球菌進(jìn)行多種方法的鑒定，以輔助臨床診斷治療。

1 材料與方法

1.1臨床資料 患者女，55歲，1個(gè)月前于外院行結(jié)腸鏡檢查，提示“升結(jié)腸可見一大小約2.5 cm×2.0 cm隆起突變，中央凹陷”，因“大便性狀改變半年，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸息肉1個(gè)月”于2020年8月3日入院就診。入院檢查：體溫36.5 ℃，清蛋白38.3 g/L，C反應(yīng)蛋白、腎功能相關(guān)生化指標(biāo)正常，血常規(guī)正常。行結(jié)腸息肉摘除術(shù)后第6天，患者發(fā)熱，寒顫，體溫39.2 ℃，清蛋白37.3 g/L，C反應(yīng)蛋白29.22 mg/L，降鈣素原0.275 ng/mL，血液檢查：白細(xì)胞14.97×109/L，中性粒細(xì)胞比例90.4%，不排除感染。留2套血培養(yǎng)檢查。血培養(yǎng)第3天2瓶厭氧血培養(yǎng)瓶報(bào)告陽性，涂片可見革蘭陽性球菌，呈單個(gè)或鏈狀排列。需氧瓶未見報(bào)告陽性警告，結(jié)合患者癥狀，考慮血源性感染。根據(jù)《國家抗微生物治療指南》和β-內(nèi)酰胺類抗生素/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)方制劑臨床應(yīng)用專家共識(shí)(2020年版)[3]，給予頭孢哌酮鈉/他唑巴坦抗感染治療，每次2 g，每天2次，靜脈滴注。血培養(yǎng)第4天報(bào)告：血培養(yǎng)有厭氧菌活潑瘤胃球菌生長。繼續(xù)抗感染7 d，患者無寒顫發(fā)熱，白細(xì)胞正常，C反應(yīng)蛋白正常，術(shù)后恢復(fù)順利，給予出院。

1.2主要試劑與儀器 哥倫比亞血瓊脂平板、不加抗生素巧克力平板、厭氧培養(yǎng)基(鄭州安圖生物公司)，質(zhì)控菌株大腸埃希菌 ATCC 8739(法國生物梅里埃公司)，DNA提取試劑盒Wizard Genomic DNA Purification Kit(美國Promega公司)，PCR擴(kuò)增引物由廣州天一輝遠(yuǎn)公司合成；Vitek 2 Compat全自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)及配套厭氧菌及棒狀桿菌鑒定卡(ANC)、Vitek MS微生物MALDI-TOF MS鑒定儀及靶板、基質(zhì)液和甲酸(法國生物梅里埃公司)，PCR儀(美國Eppendorf公司)，DYY-6G型電泳儀(北京六一儀器廠)，ABI 3730XL自動(dòng)測序儀(美國Applied Biosystem公司)。

1.3細(xì)菌培養(yǎng) 抽取血培養(yǎng)陽性肉湯，直接涂片革蘭染色鏡檢，同時(shí)接種于哥倫比亞血平板，巧克力平板(不加抗菌藥物)和厭氧血平板，5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃溫育24 h，哥倫比亞血平板、巧克力平板(不加抗菌藥物)均無細(xì)菌生長，厭氧血平板可見灰白色半透明菌落。將初代厭氧血平板菌落進(jìn)行耐氧試驗(yàn)，獲得專性厭氧菌并進(jìn)行革蘭染色鏡檢，觸酶試驗(yàn)觀察生化反應(yīng)特性。用Vitek 2 Compact全自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)及ANC卡進(jìn)行生化鑒定試驗(yàn)。

1.4基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)鑒定 用無菌接種環(huán)取菌并均勻涂于靶板，加入1 μL α-氰基-4-羥基肉桂酸+乙腈(CHCA)基質(zhì)液，待完全干燥后，使用MALDI-TOF MS鑒定，將所得質(zhì)譜圖與MALDI-TOF MS RUO數(shù)據(jù)庫中的質(zhì)譜圖進(jìn)行匹配。

1.516S rRNA基因檢測 取厭氧哥倫比亞血平板上的菌落按Wizard Genomic DNA Purification kit說明書提取基因組DNA。PCR擴(kuò)增基因組DNA 16S rRNA基因，按試劑盒說明書操作，正向引物：5′-AG

TTTGATCMTGGCTCAG-3′，反向引物：5′-GGTTACC

TTGTTACGACTT-3′。反應(yīng)體系: DNA提取物1 μL,10 μmol/L上、下游引物各1 μL,2×PCR Mix 10 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，使用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)分析。將瓊脂糖凝膠分離的目的條帶，用PG溶膠液溶膠，磁珠純化吸附DNA，酒精去雜質(zhì)，最后洗脫液(水)溶出DNA，得到純化好的目的基因。由廣州天一輝遠(yuǎn)公司在ABI 3730XL自動(dòng)測序儀上進(jìn)行雙脫氧鏈終止法(Sanger法)測序，結(jié)果用GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。用MEGA5軟件構(gòu)建分離菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1細(xì)菌培養(yǎng) 專性厭氧血平板培養(yǎng)24 h后可見直徑約1 mm的圓形、灰白色、半透明、濕潤、邊緣光滑的菌落，無溶血環(huán)(圖1)。細(xì)菌革蘭染色陽性，著色弱，球形或類球形，單個(gè)、成對或鏈狀排列(圖2)，觸酶試驗(yàn)陰性，H2S試驗(yàn)陽性,分解葡萄糖，ANC卡生化試驗(yàn):α-阿拉伯糖苷酶、d-2脫氧核糖、蔗糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-麥芽糖、七葉苷水解試驗(yàn)為陽性，ID信息置信水平結(jié)果顯示：不能鑒定的細(xì)菌。

圖1 厭氧平板培養(yǎng)24 h的菌落形態(tài)

圖2 菌落涂片革蘭染色

2.2細(xì)菌鑒定 分離菌株的MALDI-TOF MS質(zhì)譜圖與RUO數(shù)據(jù)庫中已有的活潑瘤胃球菌質(zhì)譜圖比較，吻合度最高，鑒定為活潑瘤胃球菌，置信度為83.7%，見圖3。菌落基因組16S rRNA PCR產(chǎn)物為1 446 bp,測序結(jié)果與已知活潑瘤胃球菌 ATCC 29149T序列號(hào)(NR 036800.1)16S rRNA基因同源性為99%，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示分離菌與活潑瘤胃球菌ATCC 29149T位于同一分支(圖4)，鑒定為活潑瘤胃球菌，登錄號(hào)為MT998949.1。

圖3 分離菌株的MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果

圖4 分離菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

3 討論

活潑瘤胃球菌屬于胃瘤菌屬，可以引起過敏、狼瘡性腎炎、脊椎關(guān)節(jié)炎和炎癥性腸病，其與克羅恩病發(fā)生最為密切[4]。其致病機(jī)制不明，可能與人體B細(xì)胞反應(yīng)相關(guān)[5]，也可能通過2,7-唾液酸酐產(chǎn)生并代謝N-乙酰神經(jīng)氨酸，清除黏蛋白中的唾液酸獲得營養(yǎng)優(yōu)勢[6]有關(guān)。

本分離菌株經(jīng)耐氧試驗(yàn)證實(shí)該菌只在厭氧條件下生長，初步判斷為厭氧菌。細(xì)菌生化等手工鑒定方法操作繁瑣，鑒定時(shí)間長而且也只能鑒定出有限菌株。Vitek 2 Compat全自動(dòng)生化鑒定結(jié)果顯示為不能鑒定的細(xì)菌，可能原因有：該菌為專性厭氧菌，生化反應(yīng)不活潑；菌株生化譜不典型；不符合Vitek 2數(shù)據(jù)庫中的菌株分類群。近年來，隨著MALDI-TOF MS在臨床廣泛應(yīng)用，越來越多的疑難菌種被鑒定。本研究使用MALDI-TOF MS檢測分離株，得到的質(zhì)譜圖與RUO數(shù)據(jù)庫中已有的活潑瘤胃球菌質(zhì)譜圖比較，置信度為83.7%，與前研究一致。Fontanals等[7]發(fā)現(xiàn)血培養(yǎng)陽性標(biāo)本經(jīng)過處理，可以直接通過MALDI-TOF MS鑒定菌株。Fernández-Caso等[8]利用MALDI-TOF MS能夠較好地鑒定出活潑瘤胃球菌。隨著基因組學(xué)的興起，分子生物學(xué)檢測方法倍受關(guān)注，雖然16S rRNA檢測價(jià)格昂貴，但是準(zhǔn)確度高。本研究通過分離菌株16S rRNA測序，結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中Blast比對，顯示該菌與活潑瘤胃球菌ATCC 29149T(序列號(hào)NR036800.1)的同源性為99%，由分離株的系統(tǒng)進(jìn)化樹可知，該分離菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株活潑瘤胃球菌ATCC 29149T位于同一分支，鑒定為活潑瘤胃球菌，登錄號(hào)為MT998949.1。

綜上，本文患者分離菌株經(jīng)MALDI-TOF MS與16S rRNA基因檢測，鑒定為Ruminococcusgnavus。MALDI-TOF MS和16S rRNA是當(dāng)前Ruminococcusgnavus臨床菌株有效的鑒定方法，2種方法具有較好的應(yīng)用前景。菌種快速鑒定不但可以對致病性病原菌進(jìn)行快速診斷，輔助臨床診斷治療，為臨床用藥提供依據(jù)；又可以監(jiān)測致病菌菌種分布情況。此外，菌種快速準(zhǔn)確鑒定為早期預(yù)防公共衛(wèi)生突發(fā)性病原傳染性疾病提供了科學(xué)根據(jù)，同時(shí)為鑒別診斷提供了篩查手段。