曾俊祥，高莉梅，余悠悠，潘秀軍

(上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院檢驗科，上海 200092)

糞便鈣衛(wèi)蛋白(fecal calprotectin, FC)是一項較為理想的評估腸道黏膜炎癥的非侵襲性標志物，目前被廣泛用于炎癥性腸病患者的鑒別診斷、病情評估及療效監(jiān)測等方面，從某種角度而言，F(xiàn)C的結(jié)果是臨床治療決策的重要條件，F(xiàn)C結(jié)果的誤差往往會延誤炎癥性腸病患者尤其是患兒的治療[1]。但由于糞便成分復雜，F(xiàn)C在檢測過程中有較多影響實驗結(jié)果的因素，特別是分析前階段[2]，被認為是分析誤差的主要來源，但國內(nèi)對此認識極少。因此，本研究試分析萃取方式、離心條件對不同性狀糞便的FC測定結(jié)果的影響，以期進一步優(yōu)化檢測流程，為規(guī)范糞便FC檢測實驗操作提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1標本來源 收取2020年4月至2020年6月期間在上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院進行糞便FC項目檢測后的剩余標本370例，排除由于量過少不適合進行多次提取的標本后，最后得到357例，置于-20 ℃凍存。

1.2試劑與儀器 糞便鈣衛(wèi)蛋白檢測試劑盒及配套采樣管(ELISA法，瑞士BüHLMANN公司)、糞便標本采樣保存管(廈門為正生物公司)；Multiskan Ascent酶聯(lián)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，VORTEX旋渦混合儀(江蘇康健醫(yī)療用品公司)，Multiskan Ascent 酶聯(lián)儀(美國 Thermo Fisher Scientific 公司) 。

1.3樣本處理

1.3.1樣本性狀評估 按照布里斯托大便分類量表(Bristol stool scale，BSS)，將標本性狀分為水樣(BSS=7)、膠凍(BSS=5、6)、軟糊(BSS=3、4)、堅硬(BSS=1、2)。

1.3.2樣本采樣 采樣前，所有標本在室溫下保存4 h復溫。選取4類不同性狀的大便標本各3例，分別進行稱量法和采樣器采樣法采樣。(1)稱量法采樣：由于堅硬便標本難以均質(zhì)化，在標本不同位置采用多點采樣法，而其他性狀標本使用一次性攪拌棒進行徹底勻漿，采樣后置于清潔試管中，應用Metler AG-160分析天平稱量每支試管采樣前后的重量，依次標號并記錄。(2)采樣管采樣：分別用檢測試劑盒配套采樣管(采樣管A)、糞便標本采樣保存管(采樣管B)采樣。

1.3.3抽提及萃取 (1)稱量法萃?。喊凑諜z測試劑說明書，以每毫克標本加入50 mL萃取液的比例，根據(jù)各標本質(zhì)量，依次加入對應體積萃取液進行萃取。(2)采樣管法萃?。簢栏癜凑蛰腿」懿僮髡f明書進行。

1.3.4混勻與溶解 所有樣本在加入萃取液后，在VORTEX旋渦混合儀上渦旋震蕩15 min，使其充分溶解混勻后備用。

1.4FC檢測 按照試劑盒說明書進行操作，采用ELISA法進行FC檢測。

1.5研究方法

1.5.1采樣方式對糞便FC檢測結(jié)果影響 隨機選取4類不同性狀的糞便標本各10例，同時用稱量法和采樣器采樣法分別進行采樣、萃取，混勻溶解完畢后同時采用ELISA法進行檢測。以稱量法結(jié)果作為標準，分別計算采樣管A、B的結(jié)果偏移度，公式：平均偏移度=(采樣管A/B結(jié)果-稱量法結(jié)果)/稱量法結(jié)果×100%。

1.5.2離心條件對糞便FC檢測結(jié)果影響 所有樣本進行性狀評估后，隨機抽取10例標本(每種形狀樣本至少1例)，每例平均分為4份，采用稱重法進行采樣、萃取，在檢測前分別以2 000 r/min離心5 min、3 000 r/min離心5 min、4 000 r/min離心5 min、3 000 r/min離心10 min這4種條件進行離心，檢測離心前、后結(jié)果。

1.5.3離心對不同性狀糞便FC檢測結(jié)果的影響 每種性狀的標本隨機選取各10例，按照上一步離心條件結(jié)果進行離心操作，計算不同性狀標本離心后結(jié)果偏移度，公式：(離心后結(jié)果-離心前結(jié)果)/離心前結(jié)果×100%。

1.5.4離心對高、中、低值區(qū)間糞便FC檢測結(jié)果的影響 標本分別按照不離心和離心進行操作，檢測FC結(jié)果。對結(jié)果進行回顧性分析，按照離心前(不離心)結(jié)果分為高值區(qū)段(>800 μg/g)、中值區(qū)段(200～800 μg/g)、低值區(qū)段(<200 μg/g)，計算不同值區(qū)間段標本離心后結(jié)果偏移度，公式：(離心后結(jié)果-離心前結(jié)果)/離心前結(jié)果×100%。

2 結(jié)果

2.1采樣方式對糞便FC檢測結(jié)果影響 隨機選取4類不同性狀的大便標本共12例，同時使用2種商用化采樣器及人工稱重法采樣，并將按2種采樣方式后檢測的FC結(jié)果進行了比較。裝置A所得結(jié)果較稱量法所得結(jié)果平均偏移度為27.2%，裝置B達到57.5%。采樣裝置對于水樣便和堅硬便的提取效果較稱重法結(jié)果差距較大。見圖1。

2.2離心條件對糞便FC檢測結(jié)果影響 抽取10例標本，每例平均分為4份，以不同離心條件進行離心，各離心條件下離心后FC結(jié)果、未離心結(jié)果比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。而離心的轉(zhuǎn)速(2 000 r/minvs. 3 000 r/minvs. 4 000 r/min)之間、離心時間(3 000 r/min 5 minvs. 3 000 r/min 10 min)之間結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，故選擇2 000 r/min離心5 min作為最終離心條件。

表1 離心條件對鈣衛(wèi)蛋白檢測結(jié)果的影響

2.3離心對不同性狀糞便FC檢測結(jié)果的影響 隨機選取每種性狀標本各10例，離心前后FC濃度的結(jié)果及人工稱重法提取的結(jié)果見表2。水樣、糊狀、膠凍、堅硬4種不同性狀糞便離心后FC結(jié)果平均偏移度為-0.6%、-24.1%、-30.3%、-37%。離心前、后水樣便FC結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而其他性狀的糞便結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。除水樣便，其他3種性狀標本采樣管法采集時離心前的結(jié)果與稱量法結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，離心后的結(jié)果與稱重法結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明離心后的結(jié)果更加接近稱重法的結(jié)果。

表2 不同性狀糞便鈣衛(wèi)蛋白離心前后檢測結(jié)果影響

2.4離心對高、中、低值區(qū)間糞便FC檢測結(jié)果的影響 對常規(guī)檢測結(jié)果回顧性分析，按照結(jié)果分為3個區(qū)間段，各區(qū)段離心前、后結(jié)果見表3。離心后中值和高值區(qū)段較離心前FC結(jié)果出現(xiàn)下降，而低值區(qū)段結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3 離心前后對低、中、高值區(qū)段糞便鈣衛(wèi)蛋白檢測結(jié)果影響

3 討論

稱重法采樣是FC檢測標準的采樣方法，但該操作步驟復雜，費時費力，目前大多采用商品化采樣管對糞便進行萃取，但采樣管本身沒有標準，因此廠家根據(jù)實際情況各自設(shè)計或交付代工廠生產(chǎn)，各類采樣管的內(nèi)部構(gòu)造、精密度不盡一致[3-4]。FC的檢測方法最早是R?seth等[5]報道的，2000年在此基礎(chǔ)上T?n等[6]進行了方法改進，后續(xù)不斷改良。現(xiàn)今較為認可的檢測流程為樣本勻漿、稱量法采樣、等比萃取、離心、樣本孵育、樣本測定。而商品化試劑盒最大的不同主要在于簡化分析前操作流程，除了替換掉稱量法，還省去離心步驟，盡管此舉便于臨床推廣，但如此也會帶來分析誤差。

采樣管基本原理是使用固定的容積，以等同于固定的糞便重量。這是基于所有糞便具有同樣的密度，而不同性狀的糞便顯然密度不一，使用均一的采樣管，勢必無法確保采樣的準確性。本研究比較了不同采樣管采樣的FC結(jié)果，發(fā)現(xiàn)2種采樣管與稱量法結(jié)果均存在一定偏移。值得注意的是，采樣裝置對于水樣便和堅硬便的提取效果較稱重法結(jié)果差距較大，考慮的原因主要是萃取裝置的采樣棒對稀便黏附性差，因此采樣量不足；而堅硬便的密度過大，同時采樣棒容易黏附多余的糞便進入萃取體系，導致采樣量偏多。

本研究發(fā)現(xiàn)離心后較離心前的FC結(jié)果有所降低，分析其原因可能是糞便中某些有形成分如膽原等造成非特異性吸附，影響檢測結(jié)果，離心后取上清液可減少這類殘留物，同時我們的結(jié)果提示離心后FC結(jié)果與稱量法更為接近，進一步佐證并強調(diào)離心這個步驟的重要性。但改變離心條件前后FC結(jié)果差異并無統(tǒng)計學意義，因此，建議糞便在用采樣裝置采樣后均應進行離心操作。

本研究為橫斷面研究，無法前瞻性地按照標準入組病例，而實際上患者的年齡、飲食、服藥情況等諸多因素均會影響實驗檢測結(jié)果，我們在之前也有過相關(guān)報道[7-8]，后續(xù)我們會繼續(xù)關(guān)注檢測結(jié)果的解讀及分析后研究。

本研究結(jié)果表明，按照現(xiàn)有商品化采樣管的方法，對硬度較大及液態(tài)的糞便采樣具有較大誤差。對此我們建議，對于液態(tài)稀便不宜使用采樣管，而應使用定量移液管，堅硬糞便應先用銼刀進行樣本均質(zhì)操作后再進行采樣操作。盡管國外Roche?、Immunodiagnostik AG?等采樣裝置宣稱更精準穩(wěn)定，但迫于成本等因素制約，在國內(nèi)常規(guī)應用難度極大。因此，我們呼吁有必要對國內(nèi)商品化采樣裝置的制作工藝、樣本性狀針對性等細節(jié)方面進行進一步改良。同時，對于采樣好的標本，均應進行離心操作以降低非特異性反應導致的結(jié)果偏差。應做好分析前處理，以確保FC結(jié)果的可靠性，讓其更具有臨床參考價值。