陳聞達(dá)，李懿皞，朱晶，邵文琦，王蓓麗，2，郭瑋，2

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗科，上海200032；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院檢驗科，福建廈門361015)

流行病學(xué)調(diào)查指出，在未來一段時間內(nèi)，心血管疾病仍將是城鄉(xiāng)居民最主要死亡原因之一[1]。肌酸激酶(creatine kinase, CK)和CK同工酶MB(creatine kinase isozyme MB, CK-MB)是經(jīng)典的心肌標(biāo)志物，在急性心肌梗死等急性冠脈綜合征的診斷及心肌手術(shù)的術(shù)后監(jiān)測上有著較為廣泛和成熟的應(yīng)用[2]。免疫抑制法是當(dāng)下CK-MB臨床檢測中應(yīng)用較為廣泛的方法，由于常規(guī)試劑盒中僅加入抗人CK-M亞基單克隆抗體，在常規(guī)臨床檢測中可能會出現(xiàn)CK-MB含量大于CK的情況，即CK與CK-MB結(jié)果倒置現(xiàn)象(簡稱“CK結(jié)果倒置”)。為了改善這一情況，有部分廠商也選擇在試劑盒中添加抗人線粒體型CK(mitochondrial creatine kinase, MtCK)單克隆抗體，但目前尚無驗證這類試劑盒性能的報道。因此，本研究選擇了一款添加了抗人MtCK單克隆抗體的免疫抑制法CK-MB檢測試劑盒進(jìn)行性能驗證，同時對收集的CK結(jié)果倒置的標(biāo)本進(jìn)行回顧性分析。

1 對象和方法

1.1研究對象

1.1.1健康人對照組 選擇2020年8月至9月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院體檢中心體檢的表觀健康人50例作為健康人對照組。經(jīng)影像、超聲及體格檢查排除高血壓、冠心病、糖尿病、腫瘤等疾病，肝腎功能正常且免疫學(xué)檢查無腫瘤標(biāo)志物升高。所有標(biāo)本無明顯的溶血、脂血及黃疸。

1.1.2心血管疾病組 選擇2020年8月至9月就診于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院、確診為心血管疾病并進(jìn)行CK、CK-MB檢測的50例患者作為心血管疾病組。所有患者均已簽署知情同意書。此外，收集2020年8月至10月就診于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院進(jìn)行CK、CK-MB檢測并報告“CK濃度小于CK-MB濃度”的28例患者。

1.2主要儀器與試劑 日立公司7600-030型全自動生化分析儀及世諾公司CK-MB測定試劑盒用于驗證，羅氏公司cobas c702全自動生化分析儀及配套的CK-MB檢測試劑盒、CK檢測試劑盒用于對照；CK同工酶電泳采用法國Sebia公司的HYDRASYS電泳儀及專用的CK同工酶電泳試劑盒。

1.3標(biāo)本采集與處理 用BD含惰性分離膠促凝劑的真空血清采血管采集靜脈血標(biāo)本，室溫靜置30 min后，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min分離血清，分裝后凍存于-80 ℃。

1.4方法學(xué)性能驗證

1.4.1正確度驗證 選擇與校準(zhǔn)不同批號的校準(zhǔn)品(1水平)及2020年全國心肌標(biāo)志物室間質(zhì)評物202021、202022、202023、202024、202025(2至6水平)分別重復(fù)檢測3次，計算均值及相對偏倚，觀察相對偏倚是否在廠商聲明的可接受范圍(15%)內(nèi)。

1.4.2精密度驗證 選擇高、中、低3個水平的定值質(zhì)控品，每日分別檢測5次，連續(xù)檢測5 d，計算其不精密度，觀察其不精密度是否在廠商聲明的可接受范圍(7%)內(nèi)。

1.4.3線性范圍驗證 選取已知CK-MB活性的高值和低值標(biāo)本，按不同比例稀釋，配制成5個不同濃度的混合血清，每個濃度分別檢測3次，計算其均值作為實測值。根據(jù)CNAS-GL037要求進(jìn)行多項回歸分析，并對非線性系數(shù)作t檢驗，判斷非線性系數(shù)與0差異是否有統(tǒng)計學(xué)意義，如無差異則表示回歸方程為一階線性。

1.4.4最大稀釋比驗證 選取已知CK-MB活性的高值標(biāo)本1例，梯度稀釋至試劑盒聲明的最大稀釋倍數(shù)，得到5個不同濃度的稀釋標(biāo)本。每個稀釋標(biāo)本分別檢測3次，計算其均值及相對偏倚，觀察其相對偏倚是否在廠商聲明的可接受范圍(10%)內(nèi)。

1.4.5參考區(qū)間驗證 選擇2020年8月至9月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院體檢中心體檢的健康人50例作為參考區(qū)間驗證組。年齡18～65周歲，男女比例為1∶1。經(jīng)影像、超聲及體格檢查排除高血壓、冠心病、糖尿病、腫瘤等疾病，肝腎功能正常且免疫學(xué)檢查無腫瘤標(biāo)志物的升高。所有標(biāo)本無明顯的溶血、脂血及黃疸。觀察所有數(shù)據(jù)的第95百分位數(shù)是否位于廠商聲明的參考區(qū)間(≤12 IU/L)內(nèi)。

1.5臨床應(yīng)用評價 健康人對照組和心血管疾病組標(biāo)本分別用世諾公司CK-MB測定試劑盒進(jìn)行檢測，并評價對比試劑盒在心血管疾病患者中的應(yīng)用與診斷效能。

選取臨床報告“CK濃度小于CK-MB濃度”，即CK結(jié)果倒置的患者血清標(biāo)本28份，分別先用世諾公司CK-MB測定試劑盒進(jìn)行檢測，對比其檢測結(jié)果與羅氏公司CK-MB檢測試劑盒的結(jié)果，觀察患者CK結(jié)果倒置情況是否被糾正。隨后，用Sebia公司CK同工酶電泳試劑盒對上述標(biāo)本血清進(jìn)行檢測及驗證。

2 結(jié)果

2.1正確度驗證 1水平的定值校準(zhǔn)品的重復(fù)檢測均值為91 IU/L，與定值(90 IU/L)間的偏倚為1.11%，小于廠商聲明的可接受范圍(15%)。室間質(zhì)評物202021、202022、202023、202024、202025重復(fù)檢測的均值分別為13、84、159、50、127 IU/L，與各自靶值(12.44、82.03、165.33、49.13、120.05 IU/L)的相對偏倚分別為4.5%、2.4%、-3.8%、1.8%、5.8%，均位于室間質(zhì)評報告提供的允許范圍內(nèi)。

2.3線性范圍驗證 二階方程非線性系數(shù)b2及三階方程非線性系數(shù)b2、b3均與0差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明在1.6～1 050 IU/L范圍內(nèi)，試劑盒線性良好，符合廠商聲明的線性范圍。

2.4最大稀釋比驗證 選取已知CK-MB活性的標(biāo)本(1 046.7 IU/L)，經(jīng)1∶2、1∶4、1∶8和1∶10稀釋后分別進(jìn)行檢測，所得結(jié)果與理論值之間的相對偏倚分別為0%、0.9%、3.1%、6.5%和8.9%。所得結(jié)果的相對偏倚均小于廠商要求的相對偏倚(10%)，表明試劑盒滿足廠商聲明的最大稀釋比(1∶10稀釋)的性能要求。

2.5參考區(qū)間驗證 50例樣本結(jié)果分布于2～10 IU/L內(nèi)，第95百分位數(shù)值為9 IU/L，滿足廠商聲明的參考區(qū)間。

2.6臨床應(yīng)用評價

2.6.1對心血管疾病的檢測效能 健康人對照組年齡為(47.1±10.2)歲，男性36名，占72%；病例組年齡為(57.6±18.1)歲，男性36名，占72%。兩組患者世諾公司CK-MB測定試劑盒的檢測結(jié)果分別為(5.88±1.35) IU/L和(135.42±93.21) IU/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-9.826，P<0.01)。

2.6.2對CK結(jié)果倒置的校正情況 28例臨床報告為CK結(jié)果倒置的患者中,有10例經(jīng)世諾公司CK-MB測定試劑盒檢測后，結(jié)果得到校正，CK同工酶電泳結(jié)果也顯示患者存在明顯的巨CK-Ⅱ(主要組成為線粒體CK)條帶。但該10例中有2例患者CK倒置結(jié)果僅得到部分校正，糾正后CK結(jié)果仍然倒置但程度減輕。經(jīng)CK同工酶電泳結(jié)果顯示，患者體內(nèi)除巨CK-Ⅱ外，還存在CK-BB(見圖1A)；剩余18例的CK倒置結(jié)果未得到校正，CK同工酶電泳結(jié)果顯示，患者存在明顯的巨CK-Ⅰ條帶(見圖1B)，說明患者的CK結(jié)果倒置情況主要由巨CK-Ⅰ導(dǎo)致。表明采用添加了MtCK抑制劑的CK-MB檢測試劑盒能較好地糾正由于MtCK的存在引起的CK倒置情況，而由巨CK-Ⅰ等其他亞型的CK同工酶存在引起的CK結(jié)果倒置，則可能仍需通過CK同工酶電泳的方式進(jìn)行辨認(rèn)。

注：A,得到部分糾正的CK倒置患者CK同工酶電泳結(jié)果，結(jié)果顯示患者除存在明顯的巨CK-Ⅱ(線粒體型CK)條帶；B,未得到糾正的CK倒置患者CK同工酶電泳結(jié)果，結(jié)果顯示患者存在明顯的巨CK-Ⅰ條帶。橫坐標(biāo)為相對位置，峰的高度表示對應(yīng)位置的吸光度大小。

3 討論

目前試劑盒中常采用免疫抑制法檢測CK-MB活性。臨床實踐表明，這一檢測方法常能得到CK-MB活性高于總CK活性即CK結(jié)果倒置的情況[3-5]。這類患者常需通過額外的CK-MB質(zhì)量法或CK同工酶電泳檢測來得到可靠的結(jié)果。臨床研究表明，引起CK結(jié)果倒置很大一部分的原因在于巨CK、MtCK等異常CK同工酶的存在[4-6]。因此，增加這類CK同工酶的抑制性抗體以使CK-MB活性檢測更加準(zhǔn)確至關(guān)重要。

MtCK是存在于細(xì)胞線粒體內(nèi)膜、外膜間隙中的CK同工酶家族成員，其與CK-BB、CK-MM和CK-MB等一同在組織細(xì)胞能量代謝過程中扮演重要角色。MtCK可分為廣泛型(ubiquitous MtCK，uMtCK)和肌節(jié)型(sarcomeric MtCK)2種不同亞型，前者廣泛表達(dá)于肝臟、腦、腎臟等組織器官中，而后者僅見于橫紋肌[7]。在炎癥性疾病或腫瘤疾病中，由于大量的組織損傷及后續(xù)細(xì)胞凋亡過程的發(fā)生，MtCK被釋放入血。目前常規(guī)試劑盒采用免疫抑制法檢測的原理，添加的抑制性抗體無法抑制血液中多余的MtCK的活性，所以MtCK常能引起這類患者CK-MB活性假性增高。近年來，也有許多研究發(fā)現(xiàn)了MtCK與肝炎、結(jié)直腸癌、肝癌等疾病的相關(guān)性[7-10]。

本研究選擇添加MtCK抑制性抗體的CK-MB檢測試劑盒進(jìn)行相關(guān)的性能驗證及臨床應(yīng)用評價。在臨床應(yīng)用方面，添加了MtCK抑制抗體的試劑盒對臨床心血管疾病的輔助診斷無明顯影響。而對CK倒置患者標(biāo)本的檢測結(jié)果表明，運用添加了MtCK抑制抗體的試劑盒能較好地糾正由于巨CK-Ⅱ存在導(dǎo)致的CK結(jié)果倒置，從而能更好地為臨床提供參考，其結(jié)果也得到了CK同工酶電泳的驗證。由于巨CK-Ⅰ、過多的CK-BB等其他CK同工酶亞型存在而導(dǎo)致的CK倒置情況可能仍需CK同工酶電泳來進(jìn)行確認(rèn)。然而電泳方法對于臨床工作來說速度較慢，操作較為不便，對操作人員的要求也較高。此外，臨床對CK的來源也相當(dāng)需要關(guān)注，尤其需要防止心源性CK-MB升高的誤診和漏診。因此，需要一些更加快速簡便的方法對CK結(jié)果倒置的原因進(jìn)行分辨。王愛華等[11]利用多種方法對巨CK、CK及其亞型進(jìn)行分辨，其中熱失活方法可使CK-BB、CK-MB快速失活，適用于分辨CK-BB型的CK結(jié)果倒置，而CK-MB型可通過其他方法，如單克隆抗CK-MB抗體法直接檢測。熱失活法結(jié)合目前成熟的商業(yè)化CK和CK同工酶試劑，可以較快地對CK亞型進(jìn)行分辨，但對于巨CK的快速分型，目前技術(shù)條件仍不成熟。