呂晶南，余方友

(1. 蘇州大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇蘇州215004；2. 同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200082)

2019新型冠狀病毒(2019-nCoV)的暴發(fā)，使分子生物學(xué)技術(shù)在臨床感染性疾病診斷、治療、療效評(píng)價(jià)及預(yù)防等方面得到前所未有的重視和飛速發(fā)展。本文就近年來基于核酸檢測(cè)技術(shù)鑒定病原體進(jìn)行系統(tǒng)化討論，同時(shí)也對(duì)這些方法在臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用時(shí)可能遇到的挑戰(zhàn)和機(jī)遇進(jìn)行闡述。

1 呼吸道感染

1.1病毒 呼吸道病毒的感染對(duì)全球流行病公共衛(wèi)生可引起嚴(yán)重的威脅，如1918年甲型流感大流行，2003年嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征(SARS)冠狀病毒暴發(fā)，2009年甲型H1N1流感引起的大流行，2012年阿拉伯半島出現(xiàn)由冠狀病毒引起的中東呼吸綜合征(MERS)，2019年2019-nCoV的暴發(fā)。值得注意的是，僅基于體征和癥狀區(qū)分病毒來源較困難，同時(shí)不同病毒感染采取的治療方案不同，因此，呼吸道病毒對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1]。目前，食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn)的多重呼吸道病毒組合能夠檢測(cè)多達(dá)20種不同的病毒靶標(biāo)[2]。

Luminex xMAP檢測(cè)是一種基于多重RT-PCR的檢測(cè)方法，采用多色熒光標(biāo)記的微球(珠)雜交，可同時(shí)檢測(cè)和鑒定12種呼吸道病毒和亞型[2]：首先通過多重RT-PCR擴(kuò)增病毒的保守區(qū)域，然后通過含有生物素的脫氧核苷酸延伸反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物被生物素標(biāo)記，與顏色編碼微球上的病毒特異性探針進(jìn)行雜交，檢測(cè)熒光信號(hào)。

Verigene系統(tǒng)(Nanosphere公司)通過PCR擴(kuò)增結(jié)合納米金顆粒標(biāo)記的探針，與排列在載玻片上的捕獲寡核苷酸靶序列進(jìn)行雜交。探針捕獲目標(biāo)片段后，信號(hào)隨即放大。FDA已批準(zhǔn)Verigene系統(tǒng)用于檢測(cè)甲型流感病毒、甲型流感病毒H3亞型、甲型流感病毒2009 H1N1亞型、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒(RSV)A和B亞型[3]。該系統(tǒng)已開發(fā)出用于檢測(cè)13種病毒和3種細(xì)菌靶標(biāo)的多重呼吸道檢測(cè)組合(部分見表1)。

FilmArray用于同時(shí)檢測(cè)和鑒定17種病毒和3種細(xì)菌呼吸道病原體(部分見表1)：使用多重兩步RT-PCR，對(duì)靶擴(kuò)增子進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析，以檢測(cè)每種組合中的分析物[4]。該系統(tǒng)完全封閉，因此不會(huì)出現(xiàn)交叉污染。

eSensor系統(tǒng)采用基于電化學(xué)檢測(cè)的DNA微陣列技術(shù)，基于夾心測(cè)定原理，可檢測(cè)14種不同類型和亞型的呼吸道病毒(部分見表1)[5]。由于該檢測(cè)需要對(duì)樣品進(jìn)行PCR后處理，因此必須注意避免由擴(kuò)增子交叉污染引起的假陽(yáng)性。

1.2百日咳鮑特菌(Bordetellapertussis) 鮑特菌屬中有4種可引起人類呼吸系統(tǒng)疾?。喊偃湛弱U特菌、副百日咳鮑特菌、支氣管敗血鮑特菌、霍氏鮑特菌。百日咳是由百日咳鮑特菌引起的高度傳染性呼吸道疾病。高達(dá)20%的副百日咳鮑特菌感染可能引起百日咳樣疾病，更常見于幼兒[6]。支氣管敗血鮑特菌常發(fā)生在免疫受損的個(gè)體中，常有牲畜接觸史[7]?；羰硝U特菌是最近發(fā)現(xiàn)的與人類百日咳樣疾病相關(guān)的病原微生物[8]。鮑特菌屬4個(gè)種都在人類呼吸道疾病中發(fā)揮重要作用[9]。

表1 FDA批準(zhǔn)的檢測(cè)呼吸道病毒組合參數(shù)

分子檢測(cè)(nucleic acid amplification tests，NAATs)可有效用于鮑特菌屬間的鑒別[9]。通過檢測(cè)多拷貝插入序列(insertion sequence，IS)來提高特異性。IS481是百日咳鮑特菌最有效的多拷貝靶點(diǎn)，也可見于霍姆鮑特菌及支氣管膿毒鮑特菌。因此，以IS481作為唯一的靶位來檢測(cè)百日咳鮑特菌存在一定的局限性，特別是在暴發(fā)流行中，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。IS1002見于百日咳鮑特菌和副百日咳鮑特菌，而霍姆鮑特菌或支氣管膿毒鮑特菌中不存在IS1002。IS1001見于副百日咳鮑特菌以及支氣管膿毒鮑特菌。針對(duì)上述3種ISs多拷貝靶點(diǎn)的組合可鑒別感染相關(guān)的鮑特菌屬。百日咳毒素啟動(dòng)子區(qū)域(pertussis toxin operon, PT)常用于檢測(cè)百日咳鮑特菌。該靶點(diǎn)同時(shí)見于副百日咳鮑特菌和支氣管膿毒鮑特菌中，但在這2種菌中由于啟動(dòng)子區(qū)域存在突變，導(dǎo)致該蛋白質(zhì)不表達(dá)?？傊ㄟ^增加特異性擴(kuò)增靶點(diǎn)(如采用雙重或三重PCR方法)可提高NAATs檢測(cè)百日咳鮑特菌的檢出率[9]。

1.3結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis) 目前，F(xiàn)DA批準(zhǔn)2種NAATs可用于直接檢測(cè)臨床標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌，分別是結(jié)核分枝桿菌擴(kuò)增直接檢測(cè)試劑(MTD檢測(cè)，Hologic/Gen-Probe)和Xpert MTB/RIF試劑(Cepheid公司)。MTD檢測(cè)基于轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的核糖體RNA擴(kuò)增，可用于檢測(cè)抗酸桿菌涂片陽(yáng)性和涂片陰性呼吸道標(biāo)本。Xpert MTB/RIF使用半巢式實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的DNA以及與利福平耐藥性相關(guān)的突變基因rpoB。該檢測(cè)系統(tǒng)使用一次性檢測(cè)盒，GeneXpert儀器可自動(dòng)進(jìn)行核酸提取、擴(kuò)增及檢測(cè)，敏感性為95%，特異性為99%[10]。

2 中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染

1型和2型單純皰疹病毒(herpes simplex virus, HSV)可引起各種臨床綜合征，包括皮膚黏膜、眼睛、中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及生殖系統(tǒng)的感染。其中引起的腦炎臨床癥狀與其他病毒引起的腦炎，如西尼羅河病毒、圣路易斯腦炎病毒和東部馬腦炎病毒引起的腦炎，臨床癥狀比較相似，不易區(qū)分。細(xì)胞培養(yǎng)或活檢是診斷HSV腦炎的金標(biāo)準(zhǔn)。腦脊液(CSF)培養(yǎng)對(duì)成人HSV腦炎的診斷敏感性低于10%。檢測(cè)CSF中HSV抗原或抗體的敏感性和特異性分別為75%～85%和60%～90%[11]。由于傳統(tǒng)方法的局限性，高敏感性檢測(cè)腦炎患者腦脊液中HSV DNA的方法得到廣泛關(guān)注，其中也包括二代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing,NGS)[12]。

FDA已經(jīng)批準(zhǔn)了幾種用于檢測(cè)生殖道標(biāo)本中HSV DNA的商品化試劑，但對(duì)于腦脊液樣本FDA僅批準(zhǔn)了1種，即Simplexa HSV 1和2 Direct Kit(Focus Diagnostics公司)。該試劑提供作為分析物特異性試劑(analyte-specific reagents，ASRs)的引物和探針，使用實(shí)驗(yàn)室自建檢測(cè)方法(laboratory developed tests, LDT)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)HSV DNA的靶點(diǎn)包括：編碼聚合酶，糖蛋白B，糖蛋白D或胸苷激酶的基因。這些靶點(diǎn)應(yīng)具有特異性，即引物不能擴(kuò)增與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的其他皰疹病毒的DNA，如巨細(xì)胞病毒、水痘帶狀皰疹病毒、6型人皰疹病毒和愛潑斯坦-巴爾病毒。宏基因組二代測(cè)序(metagenome next-generation sequencing,mNGS)能夠用較少的樣本量，通過其高通量、深度測(cè)序的特點(diǎn)快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)感染相關(guān)的病原體。2020年Osterman等[13]應(yīng)用 mNGS對(duì)1例48歲疑似病毒性腦炎患者的腦脊液進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該重癥患者感染1型人類皰疹病毒(HHV-1)。mNGS不僅可以快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出常見的病原體， 同時(shí)也可對(duì)病原體進(jìn)行定量研究。Liu等[12]應(yīng)用mNGS診斷出1例患有HSV腦炎的1歲患兒，經(jīng)阿昔洛韋治療后，癥狀消失，同時(shí)檢測(cè)患兒腦脊液中HSV1 DNA定量從4 290下降至0。研究表明，腦脊液 mNGS對(duì)常見的皰疹病毒感染的腦炎確診以及治療效果的評(píng)估具有重要的臨床價(jià)值。

3 血流感染

目前已有多種基于核酸擴(kuò)增的方法，可有效縮短鑒定血培養(yǎng)中病原菌所需的時(shí)間。其中FDA批準(zhǔn)的檢測(cè)方法包括肽核酸熒光原位雜交(peptide nucleic acid-fluorescence in situ hybridization，PNA FISH)、RT-PCR以及基于巢式PCR的血培養(yǎng)鑒定板[14]。

PNA FISH探針是一種DNA探針，其中帶負(fù)電荷的糖磷酸骨架被帶中性電荷的肽骨架取代。這種中性電荷結(jié)構(gòu)使探針與靶核酸結(jié)合時(shí)不存在靜電排斥作用，因此雜交更加緊密、快速[15]。該技術(shù)可用于快速鑒定金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、腸球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌及念珠菌(包括白念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶假絲酵母、光滑念珠菌和克柔念珠菌)，操作簡(jiǎn)便，30 min后通過熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

對(duì)疑似金黃色葡萄球菌感染的菌血癥患者，萬古霉素是標(biāo)準(zhǔn)治療方案。因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)臨床微生物實(shí)驗(yàn)室，50%或更多分離的菌株為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)；然而，萬古霉素對(duì)甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(methicillin sensitiveStaphylococcusaureus，MSSA)的效果不及甲氧西林。因此，在血流感染中快速鑒別MRSA和MSSA十分重要。Xpert MRSA/SA BC(Cepheid公司)和GeneOhm StaphSR (BD Diagnostics公司)是FDA批準(zhǔn)的2種real-time PCR試劑盒，可直接用于鑒別陽(yáng)性血培養(yǎng)中的MRSA和MSSA[16-17]。

Verigene革蘭陽(yáng)性和革蘭陰性細(xì)菌鑒定板(Nanosphere公司)以及FilmArray血培養(yǎng)鑒定(BCID)系統(tǒng)(BioFire Diagnostics公司)可直接檢測(cè)血培養(yǎng)中病原微生物[18-20]。

FilmArray BCID可同時(shí)在一塊板上聯(lián)合檢測(cè)包括革蘭陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭陰性細(xì)菌以及多種酵母菌在內(nèi)的24種病原菌和3種抗菌藥物耐藥基因。該鑒定板可以鑒定出陽(yáng)性血培養(yǎng)中80%～90%病原微生物，并檢測(cè)對(duì)甲氧西林耐藥的葡萄球菌，對(duì)萬古霉素耐藥的腸球菌以及產(chǎn)碳青霉烯酶的革蘭陰性腸桿菌科細(xì)菌[20]。

Verigene BCID系統(tǒng)采用納米金基因芯片法可直接從陽(yáng)性培養(yǎng)瓶中鑒定病原微生物，不需要進(jìn)行核酸擴(kuò)增[18]。當(dāng)血培養(yǎng)瓶出現(xiàn)陽(yáng)性報(bào)警時(shí)，根據(jù)革蘭染色結(jié)果選擇不同的血培養(yǎng)鑒定板。Verigene革蘭陽(yáng)性菌血培養(yǎng)鑒定板已被批準(zhǔn)測(cè)定12個(gè)屬或種的細(xì)菌以及3種耐藥基因。Verigene革蘭陰性菌血培養(yǎng)鑒定板可以在2.5 h內(nèi)檢測(cè)8個(gè)屬或種和9個(gè)耐藥基因。革蘭陽(yáng)性菌血培養(yǎng)鑒定板可以檢測(cè)mecA、vanA和vanB基因，革蘭陰性菌血培養(yǎng)鑒定板可以檢測(cè)6種不同的β-內(nèi)酰胺酶基因。檢測(cè)真菌的Verigene鑒定板正在開發(fā)中，該鑒定板可以檢測(cè)白念珠菌、杜氏假絲酵母、光滑念珠菌、克魯斯念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶假絲酵母、隱球菌和新型隱球菌[21-22]。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)通過使用蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)病原體進(jìn)行鑒定。陽(yáng)性的血培養(yǎng)瓶中的病原體可直接應(yīng)用該方法進(jìn)行鑒定[23]。

二代測(cè)序可在血液中檢測(cè)出大量非致病微生物序列，同時(shí)現(xiàn)有研究尚未給出單純基于測(cè)序結(jié)果判斷污染菌或致病菌的標(biāo)準(zhǔn)，因此對(duì)測(cè)序結(jié)果的判讀常需結(jié)合臨床綜合判斷。

4 胃腸道感染

腸道病毒(Enterovirus，EV)是一組屬于微核糖核酸科的單鏈RNA病毒。目前，人類腸道病毒被分為7個(gè)種類。EV感染的診斷通常基于臨床表現(xiàn)和NAATs。

目前，有2種腦脊液EV檢測(cè)試劑盒通過了FDA的認(rèn)證，分別是：NucliSENS EasyQ(bioMérieux公司)和Xpert EV(Cepheid公司)[24]。但是，NucliSENS Easy Q EV試劑盒不能通過商業(yè)渠道獲得。Xpert EV的敏感性為97%，特異性達(dá)100%[25-26]，且操作簡(jiǎn)單，經(jīng)過自動(dòng)化的核酸提取、擴(kuò)增和檢測(cè)，2.5 h內(nèi)即可出檢測(cè)結(jié)果。

艱難梭菌(Clostridiumdifficile)是一種革蘭陽(yáng)性產(chǎn)芽胞厭氧桿菌，定植后可引起腹瀉等癥狀?？咕幬锏氖褂脤?dǎo)致腸道菌群紊亂，有助于該菌在腸道中定植。目前，已有15種不同的檢測(cè)平臺(tái)獲得了FDA批準(zhǔn)，包括實(shí)時(shí)PCR、環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增、解旋酶依賴性擴(kuò)增和基因芯片技術(shù)等多種不同方法。通過檢測(cè)多種靶基因，包括tcdA、tcdB、tcdA和tcdC，其中后兩者可以用于鑒定核糖體型027菌株[27-28]。

傳染性胃腸炎(infectious gastroenteritis, IGE)是全球發(fā)病率和死亡率的主要原因。在美國(guó)，每年大約發(fā)生1.788億例IGE，其中有474 000例患者接受住院治療以及5 000例患者死亡[11,29]。常見的檢測(cè)方法，包括抗原檢測(cè)、培養(yǎng)、蟲卵和寄生蟲的顯微鏡檢查，以及單靶位點(diǎn)的NAATs，都用來檢測(cè)與IGE有關(guān)的病原體或毒素。此外，診斷方法的選擇需要根據(jù)患者的年齡、疾病嚴(yán)重程度、免疫功能低下狀態(tài)、腹瀉的持續(xù)時(shí)間和類型、旅行史和患病季節(jié)時(shí)間來決定[30]。通常來說，由于臨床醫(yī)生對(duì)每種診斷方法的適用范圍不夠了解，因此可能會(huì)漏檢[31]。 FDA已經(jīng)批準(zhǔn)了5個(gè)用于檢測(cè)腸道病原體組的試劑盒。

Prodesse ProGrastro SSCS(Hologic/Gen-Probe)使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)鑒定沙門菌屬、志賀菌屬和彎曲桿菌屬，同時(shí)可以在不同大腸埃希菌的混合物中鑒別產(chǎn)志賀毒素1(stx1)和志賀毒素2(stx2)2種大腸埃希菌[32]。

BD MAX EBP使用單個(gè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR來檢測(cè)病原體和毒素，包括：志賀菌屬、腸道侵襲性大腸埃希菌、彎曲桿菌屬以及毒素stx1/stx2。與Prodesse ProGrastro SSCS分析不同的是，BD MAX可以自動(dòng)完成從樣品制備到靶基因擴(kuò)增和檢測(cè)的所有步驟[32-33]。

Luminex xTAG GPP通過多重PCR技術(shù)和液珠陣列檢測(cè)包括彎曲桿菌屬、艱難梭菌、大腸埃希菌O157、產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌、沙門菌屬、志賀菌屬、霍亂弧菌、腺病毒40/41、諾如病毒GⅠ/GⅡ、輪狀病毒A、隱孢子蟲屬、溶組織內(nèi)阿米巴和賈第鞭毛蟲[34]。雖然該系統(tǒng)檢測(cè)通量高，但仍需手工進(jìn)行核酸提取，這樣增加交叉污染，引起假陽(yáng)性。另外，該系統(tǒng)耗時(shí)較長(zhǎng)。

多重PCR技術(shù)和金納米顆粒微陣列可用于檢測(cè)5種細(xì)菌、2種毒素和2種病毒，包括Verigene彎曲桿菌屬、沙門菌屬、志賀菌屬、弧菌屬、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、stx1、stx2、諾如病毒和輪狀病毒[35]。這是一個(gè)簡(jiǎn)單易用的一體化的檢測(cè)系統(tǒng)，但因?yàn)橐淮沃荒苓\(yùn)行一個(gè)樣本，所以其輸入輸出量有限。

Film Array通過多重PCR技術(shù)和熔解曲線可同時(shí)檢測(cè)12種細(xì)菌、5種病毒和4種原蟲，包括彎曲桿菌屬、艱難梭菌毒素A/B、類志賀鄰單胞菌屬、沙門菌屬、弧菌屬、霍亂弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、腸道聚集大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌、產(chǎn)志賀樣毒素大腸埃希菌、大腸埃希菌O157、腺病毒F 40/41、星狀病毒、諾如病毒GⅠ/GⅡ、輪狀病毒A、沙波病毒、隱孢子蟲屬、環(huán)孢子蟲、溶組織內(nèi)阿米巴和藍(lán)氏賈第鞭毛蟲[36]。這是目前檢測(cè)病原體較全面的方法。與所有Film Array產(chǎn)品類似，使用簡(jiǎn)單，可在約1 h內(nèi)提供檢測(cè)結(jié)果，主要的缺點(diǎn)是輸出量低和高成本。

5 結(jié)語

每種檢測(cè)方法都有不同的優(yōu)缺點(diǎn)，只有多種分子生物學(xué)方法聯(lián)合應(yīng)用，并與傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定相結(jié)合，才有助于感染性疾病的診斷。