趙培 劉晶 于芳 于悅卿 高偉 路永剛 李永輝 帖彥清

(1.河北省人民醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 050051；2.河北省人民醫(yī)院內分泌科，河北 石家莊 050051；3.河北省疾病預防控制中心，河北 石家莊 050051)

近年來石家莊市空氣污染嚴重，特別是PM2.5顆粒物含量高，心血管疾病多發(fā)，這兩種現象可能有因果關系，引起了廣泛的社會關注[1-2]。動脈粥樣硬化是心血管疾病的主要病理學改變，被認為是一種慢性炎癥性疾病，循環(huán)中的白細胞參與該慢性炎癥反應。研究認為PM2.5能夠避開呼吸系統(tǒng)屏障進入血液循環(huán)，擾亂先天免疫機制[3-4]。在PM2.5的刺激下血管內皮細胞損傷，引起與動脈粥樣硬化相關的各種炎癥因子、趨化因子及黏附因子的釋放，在這些細胞因子的作用下，循環(huán)中的單核細胞遷移到病變血管內膜處并向內皮下移動分化為巨噬細胞，吞噬周圍的脂質成分等相關物質形成泡沫細胞，同時在適宜的微環(huán)境作用下促進血管動脈粥樣硬化斑塊的進展[5]。本研究旨在探討PM2.5能否加速ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展并探討其相關分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SPF級8周齡體質量(20±2)g、ApoE-/-小鼠購自卡文斯實驗動物有限公司(中國常州)[生產許可證號SCXK(蘇)2016-0010]，飼養(yǎng)于河北省人民醫(yī)院臨床研究中心SPF級動物房(溫度：20～24 ℃，濕度：45%～55%)，每籠5～6只。采用高脂飲食喂養(yǎng)8周(含21%脂肪、19.5%酪蛋白和1.25%膽固醇)。動物實驗在河北省人民醫(yī)院實驗動物中心[SYXK(冀)2015-0065]進行。該動物實驗經過了河北省人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的批準(201922)，實驗嚴格遵循3R原則給予人道關懷。PM2.5準備：采用TH-150D型智能中流量空氣總懸浮顆粒物采樣器24 h連續(xù)中流量采樣進行細顆粒物(PM2.5)的收集。將收集的PM2.5采用液氮冷凍干燥成粉末后于黑暗中4 ℃下儲存。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與造模處理 將ApoE-/-小鼠隨機分為PM2.5組(n=16)和對照組(n=16)。小鼠PM2.5用量參考石家莊地區(qū)正常成人每天PM2.5吸入量(2017年石家莊平均PM2.5為65 μg/m3)。每天將10 mg的PM2.5粉末懸浮在4.8 mL的生理鹽水中，PM2.5組每只小鼠每天氣管滴注0.3 mL PM2.5混懸液一次，對照組氣管滴注相同劑量的生理鹽水。

1.2.2 小鼠全血重金屬測定 小鼠眼球取血，采用電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS， Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)測定全血的重金屬含量，同時測定小鼠氣管滴注所用的PM2.5混懸液的重金屬含量。

1.2.3 主動脈根部斑塊面積及成分分析 主動脈根部切成5 μm的石蠟切片進行Movat染色，評估斑塊大小。天狼星紅染色后，評價斑塊內的膠原含量的變化?？筸ac-2、α-肌動蛋白抗體免疫組化染色檢測斑塊內的巨噬細胞Mφ(galectin-3/MAC-2)、平滑肌細胞(β-actin)的變化。

1.2.4 降主動脈斑塊內部炎癥因子基因表達檢測 使用Trizol兩步法抽提降主動脈的總RNA，按照逆轉錄試劑說明書進行實時熒光定量PCR。斑塊內部相關因子及內參基因熒光定量PCR反應引物序列，見表1。

2 結果

2.1 小鼠血液中重金屬含量測定 PM 2.5組全血中重金屬含量顯著升高，特別是鋁、釩和鐵(表2)；PM2.5組小鼠的全血重金屬比例與PM2.5混懸液相似(表3)。表明PM2.5重金屬顆粒可以通過氣管滴注法進入ApoE-/-小鼠循環(huán)系統(tǒng)。

表2 兩組小鼠血液中重金屬含量比較

表3 PM2.5混懸液重金屬的成分和含量(μg/L)

2.2 PM2.5對斑塊的影響 PM2.5處理后動脈根部斑塊面積顯著增加，斑塊中巨噬細胞數量增加，斑塊中的膠原含量降低(P<0.05)，平滑肌數量無明顯變化(P>0.05)，見圖1、表4。提示PM2.5促進ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化發(fā)展。

圖1 PM2.5處理對小鼠斑塊面積以及細胞成分的影響

表4 兩組主動脈根部斑塊面積及成分比較

2.3 PM2.5對動脈粥樣斑塊中炎癥因子基因表達的影響 與對照組比較，PM2.5組IL-6、Lp-PLA2、MCP-1及ICAM-1、iNOS和IL-12的表達顯著增加(P<0.05)，CD206和Arg-1表達下降(P<0.05)(表5)。

3 討論

動脈粥樣硬化是一種以脂質堆積和纖維斑塊形成為特征的在動脈管壁發(fā)生的慢性、低水平的炎癥性疾病。白細胞，主要是單核細胞和巨噬細胞，是先天炎癥免疫的主要組成部分，是抵御異物的第一道防線[6]。近年來大氣污染中PM2.5成分可看作是一種觸發(fā)人體炎癥免疫反應的一種異物。研究[7-8]發(fā)現，短期暴露于高濃度或長期暴露于低濃度PM2.5是AS進展的一個危險因素，在持續(xù)的PM2.5刺激下，這種免疫炎癥反應可能變得持續(xù)和慢性，但其作用機制尚未完全闡明。

表5 兩組降主動脈炎癥性因子基因表達比較

Lp-PLA2是磷脂酶超家族中的亞型之一，也被稱為是血小板活化因子乙酰水解酶，由血管內膜中的巨噬細胞、T細胞和肥大細胞分泌。Lp-PLA2可水解氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)中的氧化磷脂，生成脂類促炎物質，如溶血卵磷脂和氧化游離脂肪酸，這些物質可導致血管內皮損傷，刺激產生粘附因子和細胞因子，這些物質可通過趨化炎癥細胞進一步產生自我強化的循環(huán)，生成更多促炎物質，加速AS的進展[9]。秦召敏等[10]研究發(fā)現Lp-PLA2是冠心病發(fā)生的危險因素，而且與冠心病的嚴重程度呈正相關。本研究發(fā)現，PM2.5處理后，ApoE-/-小鼠血管動脈硬化斑塊內Lp-PLA2表達增強，這可能與PM2.5刺激ApoE-/-小鼠血管內膜中巨噬細胞活化，分泌產生更多的Lp-PLA2有關。

細胞間黏附分子-1 (intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)，又叫做CD54，屬于黏附分子中免疫球蛋白超家族(IGSF)中的成員，是介導黏附反應重要的一個黏附分子。ICAM-1 在靜息的血管內皮細胞上呈低水平表達，通過與血管內皮細胞表面上的特異性受體結合而發(fā)揮其生物學活性。作為白細胞和內皮細胞跨膜的蛋白質，ICAM1在穩(wěn)定細胞間相互作用和促進白細胞和內皮細胞的遷移起到重要作用。有研究[11]發(fā)現，ICAM-1與正常血壓糖尿病患者動脈粥樣硬化程度呈正相關。國內外多項研究[12-13]表明，PM2.5能夠直接引起血管內皮細胞的損傷，而血管內皮細胞受損是動脈粥樣硬化起始的條件之一，受損的血管內皮細胞能夠促使細胞黏附分子(如ICAM-1)的表達增加，細胞粘附分子及其受體之間的相互作用將信號傳遞到單核細胞中，并導致單核細胞遷移到血管內皮下，攝取ox-LDL，變?yōu)榧せ畹木奘杉毎?，并分化為泡沫細胞，參與動脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展。

激活的巨噬細胞能夠分泌IL-6，其能夠通過激活核因子-κB(nuclear factor，NF-κB)，使炎癥介質和細胞因子的基因轉錄增強，可促使斑塊內單核/巨噬細胞、內皮細胞和平滑肌細胞等分泌MCP-1[14]，從而促使更多的單核細胞聚集、浸潤，并遷移至血管內皮下吞噬脂質，形成泡沫細胞，從而加速AS的進展[15]。MCP-1又能活化白細胞并介導其產生炎性介質IL-6，并促進內皮細胞更多地分泌趨化因子MCP-1，形成瀑布效應，最終導致AS病變的發(fā)生、發(fā)展[16]。王冬蓮等[17]研究發(fā)現血清MCP-1水平與AS嚴重程度有關，并反映了病情的嚴重程度，可以作為初步預測急性冠脈事件和判斷AS嚴重程度的參考指標。急性感染、慢性炎癥性疾病、肥胖和生理應激反應均可促進IL-6的釋放，動脈粥樣硬化始于內皮損傷，炎癥參與動脈粥樣硬化整個過程[18]。Zamani等[18]證實IL-6可以促進動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展和破裂。張濤等[19]研究發(fā)現，在99例高血壓患者中，IL-6水平較高的一組患者頸動脈斑塊內-中膜厚度及斑塊面積均高于對應低水平組患者。

在動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過程中，血管內皮屏障首先被破壞，并進一步表達粘附因子和受體，導致白細胞(特別是單核細胞)進一步的聚集和活化。循環(huán)白細胞(特別是單核細胞)遷移至損傷的血管內皮細胞處不可逆地分化為巨噬細胞[20]。已知巨噬細胞有兩種亞型，第一種為經典活化性，這類巨噬細胞能夠合成大量的促炎細胞因子(iNOS、IL-12)，促炎細胞因子刺激白細胞的募集、活化、分化和存活，能夠促進動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展；第二種是替代活化型的巨噬細胞(M2)，其分泌的細胞因子(Arg-1和CD206)具有抗動脈粥樣硬化的作用。為探知PM2.5對巨噬細胞亞型的影響，我們進一步檢測了動脈斑塊內iNOS、IL-12、Arg-1和CD206的表達，發(fā)現iNOS和IL-12表達上調(P<0.05)，Arg-1和CD206的表達下調(P<0.05)，表明在PM2.5的作用下，斑塊內巨噬細胞更多地轉化為M1型，促進了動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。

4 結論

PM2.5暴露加速了ApoE-/-小鼠模型動脈粥樣硬化的進展，這可能與PM2.5刺激ApoE-/-小鼠血管內皮細胞損傷，分泌產生更多的黏附因子、趨化因子和炎癥因子(Lp-PLA2、IL-6、MCP-1、ICAM1)并促進血管內膜中巨噬細胞更多地轉化為M1型有關。