王臣榮，劉 晶，劉 群*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京海淀 100193；2.農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流行病學(xué)與人畜共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部國(guó)家動(dòng)物寄生原蟲實(shí)驗(yàn)室，北京海淀 100193)

大多數(shù)真核生物都嚴(yán)格依賴基因的表達(dá)來調(diào)控其生命周期。例如，瘧原蟲和弓形蟲通過調(diào)控基因的表達(dá)以確保其正確的增殖和分化?；虮磉_(dá)調(diào)控通常在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控，而基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控比轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控更快，所以機(jī)體在應(yīng)對(duì)各種環(huán)境變化上，基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控被認(rèn)為是一種快速有效的策略。

在真核細(xì)胞中，基因的表達(dá)通常通過mRNA 3端非翻譯區(qū)(3′UTR)來調(diào)控。許多mRNA 3′UTR含有與RNA結(jié)合蛋白(RBP)結(jié)合的調(diào)控元件。RBP通過作用于RNA的代謝在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用[1]。RBP通常具有保守的基序或結(jié)構(gòu)域，例如RNA識(shí)別基序、五肽重復(fù)序列、鋅指、KH結(jié)構(gòu)域、DEAD/DEAH框以及Pumilio/FBF結(jié)構(gòu)域(Puf域)。在真核生物中Puf家族(果蠅Pumilio蛋白和秀麗隱桿線蟲Fem-3結(jié)合因子合稱)是一大類保守的RBP家族。Puf主要通過結(jié)合mRNA 3′UTR中的特定識(shí)別序列來控制其穩(wěn)定性和翻譯，從而控制各種生理過程[2]。

Puf家族至少由3個(gè)亞家族組成：①經(jīng)典Puf蛋白，其結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)類似于一個(gè)新月形結(jié)構(gòu)，該新月形結(jié)構(gòu)以序列特異性方式與單鏈RNA結(jié)合。Puf蛋白結(jié)合3′UTR中含有-UGU-的核心特異性序列進(jìn)而調(diào)節(jié)靶mRNA的表達(dá)，并且Puf蛋白的靶mRNA的種類或功能在進(jìn)化上較為保守；②Puf-A亞家族結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)L形，其通過與磷酸骨架的相互作用與RNA/DNA結(jié)合；③Nop9亞家族結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)C形，其通過識(shí)別序列和RNA的結(jié)構(gòu)元件來調(diào)控基因的表達(dá)。經(jīng)典Puf蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)中，而Puf-A和Nop9蛋白主要位于核仁中，并在核糖體生物發(fā)生中起作用[3-4]。但是Puf-A和Nop9蛋白在哺乳動(dòng)物和原蟲中的功能和機(jī)制尚未見研究報(bào)道。

各種真核生物中都表達(dá)Puf蛋白，但表達(dá)Puf蛋白的數(shù)目不同。在秀麗隱桿線蟲和克氏錐蟲中分別發(fā)現(xiàn)了11個(gè)和10個(gè)Puf蛋白。在惡性瘧原蟲、弓形蟲和人中也分別鑒定出2個(gè)Puf蛋白[5-6]。已經(jīng)有報(bào)道對(duì)Puf蛋白的多種生物學(xué)功能方面進(jìn)行研究，本論文僅對(duì)已報(bào)道的哺乳動(dòng)物和原蟲中Puf蛋白的定位、功能及其作用機(jī)制進(jìn)行總結(jié)和分析，以期為原蟲新藥或疫苗的開發(fā)提供新思路。

1 不同物種來源Puf蛋白的定位

富含各種基序的3′UTR控制其mRNA的命運(yùn)。帶有相同基序的不同mRNA可能以相似的方式受到調(diào)控[7]。這些mRNA與不同的RNA結(jié)合蛋白(RBP)相互作用形成無膜核糖核蛋白(RNP)顆粒。RNP顆?？赡芸刂七@些mRNA的命運(yùn)，RNP顆粒一般包括應(yīng)激顆粒和加工體。研究表明形成應(yīng)激顆粒的弓形蟲表現(xiàn)出更高的體外生存能力，并且應(yīng)激顆粒的大小和數(shù)量會(huì)影響其體外生存能力，因?yàn)樵S多mRNA在應(yīng)激顆粒中被抑制翻譯，而對(duì)寄生蟲存活很重要的mRNA被增強(qiáng)翻譯。加工體中富含mRNA衰減因子和翻譯抑制的mRNA。研究發(fā)現(xiàn)PUM1/2定位于RNP顆粒，在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的應(yīng)激顆粒中發(fā)現(xiàn)PUM1和PUM2，并且PUM1/2也在P體中被發(fā)現(xiàn)，同時(shí)PUM2的過表達(dá)可以誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒的形成[8-9]。弓形蟲擁有2個(gè)Puf蛋白，但其細(xì)胞內(nèi)定位尚未研究。Puf蛋白的無序區(qū)域及mRNA的基序?qū)NP顆粒形成至關(guān)重要[10]，但是尚不清楚Puf的顆粒定位及顆粒溶解是否影響其功能。

2 Puf蛋白的功能

2.1 參與生命過程中不同階段的轉(zhuǎn)換

瘧原蟲編碼3個(gè)Puf蛋白(Puf1，Puf2和Puf3)[11]。其中Puf2在配子細(xì)胞和子孢子階段起著重要作用，PfPuf2或PbPuf2的敲除促進(jìn)了有性階段的分化，進(jìn)而產(chǎn)生更多的雄性配子細(xì)胞[12]。PbPuf2的敲除增強(qiáng)了UIS2磷酸酶的表達(dá)，進(jìn)而抑制了瘧原蟲子孢子eIF2α的磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致瘧原蟲子孢子喪失了感染活性[13]。弓形蟲的緩殖子與瘧原蟲的子孢子特性相似，而弓形蟲Puf蛋白是否在緩殖子形成過程中發(fā)揮作用尚未見報(bào)道。

2.2 參與核糖體生成與rRNA加工

Puf蛋白在rRNA加工和核糖體生成中起重要作用。酵母NOP9是一種含有Pum重復(fù)序列的蛋白質(zhì)，其對(duì)pre-18S rRNA的加工至關(guān)重要。人源Nop9影響18S小亞基核糖體RNA的產(chǎn)生，惡性瘧原蟲PfPuf3也參與核糖體的生成。人源Puf-A會(huì)影響90S核糖體前體的裝配。布氏錐蟲PUF7的沉默導(dǎo)致rRNA加工受抑制?？梢姴煌颬uf蛋白在體核糖體生成與rRNA加工過程中的發(fā)揮著重要且保守的作用。

2.3 其他功能

最近研究表明Puf蛋白可以調(diào)控靶mRNA的定位。酵母Puf5通過過氧化物酶體影響PEX14 mRNA的定位。Puf還在調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定及DNA修復(fù)中發(fā)揮作用，例如布氏錐蟲PUF9穩(wěn)定其靶轉(zhuǎn)錄本(LIGKA，PNT1，PNT)，當(dāng)DNA受損時(shí)，Pum1蛋白的表達(dá)量降低，進(jìn)而激活DNA修復(fù)途徑對(duì)DNA進(jìn)行修復(fù)[14]。小鼠肌細(xì)胞Pum2和秀麗隱桿線蟲肌細(xì)胞Puf8的敲除會(huì)影響線粒體的功能[15]。Pum1和Pum2會(huì)抑制細(xì)胞周期抑制基因Cdkn1b的表達(dá)來控制小鼠身體和器官的大小[16]，由此可見，不同物種Puf蛋白除了發(fā)揮其保守功能外，還參與調(diào)控其他許多生物學(xué)過程。

3 Puf蛋白調(diào)控靶mRNA的作用機(jī)制

在瘧原蟲和弓形蟲中，基因的翻譯主要發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)、線粒體和頂質(zhì)體。瘧原蟲大部分基因在細(xì)胞質(zhì)中翻譯，大約50個(gè)基因在頂質(zhì)體中被翻譯，只有3個(gè)基因在線粒體中被翻譯。由于經(jīng)典Puf蛋白的胞質(zhì)定位，因此本文聚焦于胞質(zhì)中基因的翻譯調(diào)控。Puf蛋白調(diào)節(jié)mRNA的機(jī)制對(duì)于理解其功能至關(guān)重要。mRNA 5端帽和3端多聚腺苷尾巴對(duì)mRNA的翻譯起著重要的調(diào)控作用，它們分別與eIF4E和poly(A)結(jié)合蛋白(PABP)結(jié)合，5＇端帽和3＇端多聚腺苷尾巴也可阻止mRNA的降解，將其去除后會(huì)引發(fā)mRNA降解。

3.1 靶向翻譯抑制

翻譯起始是基因翻譯中的限速步驟。翻譯起始的阻斷主要通過真核起始因子(eIFs)磷酸化修飾。基因的翻譯機(jī)制在瘧原蟲和弓形蟲之間是高度保守的，eIF2α、eIF2β和eIF2γ共同形成eIF2復(fù)合物。eIF2能夠結(jié)合GTP，隨后與甲硫氨酸t(yī)RNA相互作用形成43S啟動(dòng)復(fù)合物，當(dāng)43S啟動(dòng)復(fù)合物結(jié)合起始密碼子后，eIF2結(jié)合的GTP被水解，然后eIF2B催化GDP轉(zhuǎn)換為GTP，而eIF2α磷酸化阻止GDP轉(zhuǎn)換為GTP。因此，eIF2α磷酸化可以阻止翻譯起始。

Puf蛋白可以調(diào)節(jié)eIF2α特異性磷酸酶的表達(dá)。僅當(dāng)瘧原蟲eIF2α去磷酸化時(shí)，瘧原蟲子孢子的潛伏期才被破壞進(jìn)而進(jìn)入肝內(nèi)期。瘧原蟲eIF2α特異性磷酸酶尚未被鑒定，但磷酸酶抑制劑處理瘧原蟲子孢子增強(qiáng)了其eIF2α的磷酸化，這意味著瘧原蟲子孢子中可能存在eIF2α特異性磷酸酶。進(jìn)一步研究證實(shí)瘧原蟲確實(shí)存在eIF2α特異性磷酸酶UIS2，Puf2缺失導(dǎo)致子孢子UIS2 mRNA水平升高。這些數(shù)據(jù)表明Puf2抑制瘧原蟲子孢子中eIF2α特異性磷酸酶表達(dá)[17]。同時(shí)Puf2的敲除導(dǎo)致瘧原蟲子孢子中的eIF2α特異性磷酸酶活性過早活化，導(dǎo)致其過早轉(zhuǎn)化為肝內(nèi)期裂殖子。綜上所述，Puf2可以抑制瘧原蟲子孢子中eIF2α特異性磷酸酶的表達(dá)。

Puf蛋白可以與eIF4E競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合mRNA 5端帽結(jié)構(gòu)。eIF4E與mRNA 5＇端帽結(jié)合對(duì)于翻譯起始也是必需的。因?yàn)榉g起始需要mRNA環(huán)化，而eIF4G與eIF4E和Poly(A)結(jié)合蛋白(PABP)結(jié)合能夠促進(jìn)了mRNA的環(huán)化。研究發(fā)現(xiàn)非洲爪蟾Pum2與eIF4E競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到mRNA 5＇端帽，這樣Pum2就可通過阻止起始復(fù)合物的組裝來抑制翻譯，但是原蟲是否存在此機(jī)制尚未見報(bào)道。

Puf蛋白調(diào)控PABP與eIF4G的相互作用。PABP在翻譯調(diào)控中發(fā)揮著多種作用，從保護(hù)mRNA 5端帽到與CNOT復(fù)合物相互作用來調(diào)控mRNA的翻譯。eIF4G和eIF4A通過eIF4E與5端帽結(jié)合，eIF4G可以結(jié)合PABP進(jìn)而導(dǎo)致mRNA發(fā)生環(huán)化進(jìn)而啟動(dòng)翻譯[18]。酵母Puf5p和秀麗隱桿線蟲FBF-2可以干擾Pab1p-eIF4G的相互作用進(jìn)而抑制靶mRNA翻譯。盡管在瘧原蟲子孢子的應(yīng)激顆粒中發(fā)現(xiàn)了Puf2和PABP，但尚不清楚瘧原蟲Puf蛋白是否干擾eIF4G與PABP相互作用。

Puf蛋白與其他蛋白質(zhì)或microRNA的相互作用。果蠅胚胎Nos促進(jìn)Pum與靶mRNA的結(jié)合。與Pum2或Nos3的單一作用相比，Pum2和Nos3共同作用對(duì)SIAH1的抑制更明顯，這表明Nos3可以加強(qiáng)Pum2對(duì)靶mRNA的抑制作用[19]。惡性瘧原蟲7-Helix-1與已知的翻譯阻遏物(例如DOZI，CITH和Puf2)互作[20]，但是它們的功能是否疊加尚不清楚。TgAlba1和TgAlba1是RNA結(jié)合蛋白，TgAlba2的翻譯需要TgAlba1的表達(dá)。人源Pum1對(duì)p27的抑制作用是通過miRNA-miR-221和miR-222來實(shí)現(xiàn)的。

Puf蛋白可以調(diào)節(jié)靶mRNA的定位。酵母Puf6可以調(diào)節(jié)ASH1 mRNA的定位進(jìn)而調(diào)控翻譯。Puf3可協(xié)助靶mRNA定位于線粒體[21]。

3.2 靶向mRNA的降解

去腺苷酶可以降解mRNA的多聚腺苷尾，這通常是mRNA降解中的限速步驟。該過程涉及CNOT復(fù)合物的活性，CNOT復(fù)合物是高度保守的多亞基復(fù)合物，其可協(xié)助調(diào)控基因的表達(dá)。CNOT包含兩個(gè)進(jìn)化上保守的去腺苷酶Ccr4，CAF1及支架蛋白Not1。CNOT去除多聚腺苷尾后，mRNA的環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致去帽激活因子DHH1與Not1締合，進(jìn)而招募DCP1-DCP2去帽復(fù)合物[22]。

mRNA去腺苷化后進(jìn)行脫帽和降解。酵母Puf5p可以結(jié)合Pop2p，隨后將Ccr4p募集到目標(biāo)mRNA并對(duì)其去腺苷化。線蟲和人的Pum也和Pop2p相互作用，釀酒酵母Puf3可以通過募集CNOT和DHH1p來激活靶mRNA的去腺苷化[23]，推測(cè)Puf與CCR4-NOT復(fù)合物互作是一種保守的機(jī)制。但在原蟲中未發(fā)現(xiàn)此種機(jī)制，有待于進(jìn)一步研究。

總之，Puf可以通過多種機(jī)制來影響目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性，例如，①通過抑制翻譯起始復(fù)合物的形成，與其他蛋白質(zhì)和microRNA的相互作用以及靶向mRNA的定位來抑制翻譯。②通過與CCR4-NOT去腺苷酶復(fù)合物的相互作用進(jìn)行去腺苷化進(jìn)而引起的靶mRNA降解，Puf還可以增加靶標(biāo)mRNA的穩(wěn)定性并增強(qiáng)翻譯，其機(jī)制需要進(jìn)一步闡明。

4 Puf蛋白活性的調(diào)控

Puf活性可以被胞質(zhì)非編碼RNA(ncRNA NORAD)調(diào)節(jié)，NORAD轉(zhuǎn)錄本富含Puf結(jié)合基序并被認(rèn)為是Puf競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制劑。缺乏NORAD轉(zhuǎn)錄本，Puf在有絲分裂和線粒體功能中的活性將增強(qiáng)[24]。同時(shí)Puf蛋白也可以抑制NORAD的表達(dá)，這表明Puf-NORAD存在反饋回路[25]。

Puf蛋白還能夠結(jié)合靶mRNA基序之外的序列。Puf結(jié)合靶mRNA的“UGU”核心基序進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行調(diào)控。但是核心基序外部序列的變化也可能導(dǎo)致Puf對(duì)靶mRNA的差異調(diào)節(jié)。人源Pum1的目標(biāo)識(shí)別序列與Pum2的不同，這可能是由于核心基序外部序列不同所致[26]。

在轉(zhuǎn)錄和翻譯后水平上調(diào)節(jié)Puf蛋白。肌肉細(xì)胞增強(qiáng)因子2已被證明在果蠅中調(diào)節(jié)Pum啟動(dòng)子活性，還發(fā)現(xiàn)Mef2誘導(dǎo)miR-134的表達(dá)進(jìn)而下調(diào)Pum 2，藥物也可以調(diào)控果蠅Pum啟動(dòng)子的活性[27]。果蠅Pum還受一類保守的RNA結(jié)合蛋白Fox(Rbfox1)的調(diào)控。Rbfox1的缺失會(huì)導(dǎo)致Pum mRNA和蛋白質(zhì)水平增加。

翻譯后修飾來調(diào)節(jié)Puf蛋白的活性。當(dāng)葡萄糖缺失時(shí)，酵母Puf3發(fā)生的磷酸化，而Puf3的磷酸化可將靶mRNA的命運(yùn)從降解轉(zhuǎn)化為翻譯激活[28]。由此可見，轉(zhuǎn)錄因子、非編碼RNA、RBP和磷酸化修飾參與Puf蛋白活性的調(diào)控。

5 展望

雖然基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是消耗能量的，但其可以快速地對(duì)外界壓力做出反應(yīng)來緩解壓力。當(dāng)然蛋白修飾對(duì)刺激能做出更快的反應(yīng)，但是其消耗能量更多及過早表達(dá)某些蛋白會(huì)阻止某些原蟲的階段轉(zhuǎn)化。Puf蛋白家族是真核生物中重要的基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，其可以參與調(diào)控不同的生物學(xué)過程，同時(shí)Puf的表達(dá)也受許多信號(hào)的調(diào)節(jié)。論文重點(diǎn)概述了人和原蟲中經(jīng)典Puf蛋白的定位、生物學(xué)功能以及作用機(jī)制，希望能夠?yàn)樵xPuf蛋白的研究提供可借鑒的資料，以期為原蟲新藥或疫苗的開發(fā)提供新思路。