蔡瑋琦，左雯雯，陸 楊，黃勝良，李存玉,3，鄭云楓,3，彭國(guó)平,3,*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.江蘇融昱藥業(yè)有限公司，江蘇 淮安 223200；3.江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023）

紅糖是由甘蔗的汁液經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單加工后制作而成的產(chǎn)物，在不同地區(qū)有不同的名稱，如“jaggery（棕櫚糖）”、“panela”、“non-centrifugal sugar（非離心糖）”，并且生產(chǎn)工藝也略有不同[1]。在明代宋應(yīng)星所著的《天工開(kāi)物》卷六（《甘嗜》）中，就已詳細(xì)記述了種蔗、制白糖與紅糖的方法[2]?，F(xiàn)今，由于糖的過(guò)度攝入，導(dǎo)致了肥胖等一系列問(wèn)題，甚至產(chǎn)生成癮性[3]。人們開(kāi)始更多的將關(guān)注點(diǎn)放在了功能性紅糖、黑糖上，不僅具有甜味，且含有大量的生物活性成分，可以增強(qiáng)免疫力、保護(hù)細(xì)胞、降低糖尿病和高血壓的發(fā)病率等[4-6]。有學(xué)者已經(jīng)提出是否可以將紅糖作為白砂糖的替代品[7]，或開(kāi)發(fā)富含植物源性生物活性成分的糖類增值產(chǎn)品[8]，以期獲得更高的商品價(jià)值。

白砂糖與赤砂糖中所含的酚類物質(zhì)，主要是甘蔗中的天然色素，赤砂糖中的酚類物質(zhì)稍多，約為白砂糖的1～3 倍，但在實(shí)際生產(chǎn)加工過(guò)程中，糖廠會(huì)去除酚類化合物使產(chǎn)品更加穩(wěn)定[9]。紅糖與黑糖在熬制過(guò)程中，發(fā)生美拉德反應(yīng)，改善風(fēng)味和感官質(zhì)量的同時(shí)也更多的產(chǎn)生了具有抗氧化、抗炎等功能的多酚類和黃酮類的化合物[10-12]，并且由于黑糖熬制時(shí)間更久且含有豐富的鐵元素，使其呈現(xiàn)出黑褐的顏色[13]。如今，許多糖類的關(guān)聯(lián)產(chǎn)品應(yīng)運(yùn)而生，消費(fèi)者追求更高品質(zhì)的糖，但仍然無(wú)法區(qū)分市面上銷售的糖的種類[14]，相當(dāng)多關(guān)于糖類的錯(cuò)誤信息仍然需要糾正。

本研究在確立的紅糖質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上[15]，通過(guò)對(duì)紅糖、白砂糖、赤砂糖和黑糖的非糖部分進(jìn)行的指紋圖譜測(cè)定，并通過(guò)指紋圖譜結(jié)合模式識(shí)別（聚類分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交最小二乘法判別分析）進(jìn)行綜合分析[16-19]，將白砂糖、紅糖、赤砂糖以及黑糖進(jìn)行區(qū)分，以期為其質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)、生產(chǎn)以及消費(fèi)者的選擇提供依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、三氟乙酸（均為色譜純） 德國(guó)Merck公司；反-烏頭酸（批號(hào)：10210049）、順-烏頭酸（批號(hào)：10213040） 美國(guó)Alfa Aesar公司；重蒸水由Milli-Q超純水儀制得，其余試劑均為分析純。30 批次樣品信息見(jiàn)表1。

表 1 30 批紅糖樣品廠家及批號(hào)Table 1 Manufacturers and batch numbers of 30 batches of samples tested in this study

1.2 儀器與設(shè)備

Alliance e2695高效液相色譜儀（配有Waters 2998二極管陣列檢測(cè)器）、Empower 3色譜工作站 美國(guó)Waters公司；Triple TOFTM5600型質(zhì)譜儀 美國(guó)AB Sciex公司；FA1004型萬(wàn)分之一電子天平、Anke TGL-16B臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭電子儀器廠；B807438265十萬(wàn)分之一電子天平 美國(guó)Mettler-Toledo公司；KH-250B型超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

采用Durashell C18-AM親水性色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）進(jìn)行分析，以乙腈（A）-0.1%三氟乙酸（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫見(jiàn)表2，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

表 2 梯度洗脫條件Table 2 Gradient elution conditions

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取順-烏頭酸、反-烏頭酸對(duì)照品適量，加水溶解，即得。

1.3.3 供試品溶液的制備

取本品1 g，精密稱定，于具塞錐形瓶中，加水10 mL，超聲處理（功率250 W、頻率40 kHz）30 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液即得。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，正離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z50～2 000；噴霧電壓5 500 V；解簇電壓100 V；碰撞電壓40、20 V；離子源溫度600 ℃；霧化氣壓力413.7 kPa；輔助加熱氣壓力413.7 kPa；氣簾氣壓力275.8 kPa。

1.3.5 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性測(cè)定

稱取同一批次紅糖樣品6 份（S10），并按照1.3.3節(jié)供試品溶液制備方法進(jìn)行制備，取其中一份樣品連續(xù)進(jìn)樣6 次，取另一份樣品分別在0、2、4、8、12、24 h的不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣檢測(cè)，按照1.3.1節(jié)指紋圖譜色譜條件分別進(jìn)行檢測(cè)，選擇9號(hào)峰作為參照，并分別計(jì)算該樣品中共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間，并計(jì)算精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 相似度分析

經(jīng)測(cè)定精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性檢測(cè)RSD均小于3%，儀器良好。將30 批樣品按1.3.3節(jié)方法制備供試品溶液，在1.3.1節(jié)條件下進(jìn)樣，對(duì)其紫外色譜指紋圖譜相關(guān)參數(shù)進(jìn)行比較。將30 批圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2012版）”。結(jié)果，紅糖相似度大于0.995，白砂糖相似度均小于0.261，赤砂糖相似度為0.171～0.881，批次間的差異很大，而黑糖的相似度為0.800、0.983與0.983?？紤]到4 種糖之間成分差異性較大，而除赤砂糖外，同種之間差異較小。因此，不能建立同一指紋圖譜，而應(yīng)各自進(jìn)行分析比較。

2.2 指紋圖譜的建立

將30 批圖譜按類別分別導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2012版）”進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。紅糖（S1～S10）的相似度為0.994、1、0.999、0.983、1、1、0.999、1、0.959、0.989；白砂糖（S11～S17）的相似度為0.955、0.981、0.979、0.979、0.980、0.979、0.658；赤砂糖（S18～S27）的相似度為0.997、0.953、0.989、0.944、0.839、0.998、0.979、0.959、0.976、0.993；黑糖（S28～S30）的相似度為0.947、1、0.999?？梢钥闯觯N糖成分接近，而4 種糖間差異較大。

圖 1 4 類糖高效液相色譜指紋圖譜Fig. 1 HPLC fingerprints of 30 samples of four types of sugars

2.3 共有峰的標(biāo)定與分析

根據(jù)10 批紅糖樣品、7 批白砂糖樣品、10 批赤砂糖樣品以及3 批黑糖樣品分別生成相對(duì)應(yīng)的對(duì)照?qǐng)D譜，由于4 種糖在同類別中的差異不大，相似度很高，所以可以將對(duì)照?qǐng)D譜代替各類樣品進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)圖2。按保留時(shí)間排序，共有17 個(gè)峰。紅糖中共有峰13 個(gè)，白砂糖中共有峰1 個(gè)，赤砂糖中共有峰7 個(gè)，黑糖中共有峰17 個(gè)。其中2、5、6、7、9、14、16號(hào)峰為紅糖、赤砂糖和黑糖共有峰，紅糖和黑糖的6號(hào)和9號(hào)峰較高。根據(jù)圖譜可以看出，赤砂糖更接近于白砂糖，除糖類以外其他成分的含量很低；紅糖與黑糖基本類似，共有峰14 個(gè)，這與相似度結(jié)果基本一致。

圖 2 4 種糖對(duì)照?qǐng)D譜Fig. 2 Typical chromatograms of four types of sugars

2.4 聚類分析

將30 批樣品色譜圖數(shù)據(jù)量化后導(dǎo)入SIMCA 14.1統(tǒng)計(jì)軟件中，以“Single linkage”模式為距離計(jì)算方式，以“size”為分類方式，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類，結(jié)果見(jiàn)圖3。4 類糖基本可以單獨(dú)分類。當(dāng)歐氏距離為4.5時(shí)，黑糖就可以與其他3 類糖進(jìn)行區(qū)分，當(dāng)歐氏距離為4時(shí)，可以分出紅糖和白砂糖與赤砂糖（S11～S27）兩大類。并且，當(dāng)度量距離為0.5時(shí)，赤砂糖與白砂糖基本分開(kāi)，但S19、S21和S22均被歸類為白砂糖，所以再次證明了市場(chǎng)上的某些品牌的赤砂糖與白砂糖并無(wú)明顯差異。

圖 3 30 批樣品聚類樹(shù)狀圖Fig. 3 Dendrogram obtained from cluster analysis of 30 batches of samples

2.5 PCA結(jié)果

圖 4 30 批樣品PCA圖Fig. 4 PCA plot for 30 batches of samples

將30 批樣品色譜圖數(shù)據(jù)量化后導(dǎo)入SIMCA 14.1統(tǒng)計(jì)軟件中，若在該保留時(shí)間下無(wú)對(duì)應(yīng)色譜峰，則將峰面積定為0。PCA采用了無(wú)監(jiān)督模式識(shí)別，選擇前2 個(gè)PC進(jìn)行區(qū)分。具體結(jié)果見(jiàn)圖4。以中軸為分界，左側(cè)為白砂糖和赤砂糖；右側(cè)為黑糖與紅糖，且黑糖與紅糖也可以區(qū)分開(kāi)，以x軸為分界時(shí)，上方為黑糖，下方為紅糖。

2.6 正交最小二乘法判別分析

圖 5 變量重要性投影圖Fig. 5 VIP plots of OPLS-DA for brown sugar versus red granulated sugar and black sugar

通過(guò)聚類分析、PCA以及相似度分析后，可以看出白砂糖與赤砂糖并無(wú)太大區(qū)別，可以將其歸為一類。所以，為了更進(jìn)一步的看出紅糖與赤砂糖以及紅糖和黑糖之間的成分差異，選擇正交最小二乘法判別分析，生成變量重要投影，對(duì)這3 類糖進(jìn)行兩兩分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。以變異權(quán)重參數(shù)（variable importance in projection，VIP）值大于1作為標(biāo)準(zhǔn)，得出各標(biāo)定峰對(duì)于區(qū)分作出的貢獻(xiàn)程度。

在紅糖和赤砂糖的對(duì)比中，起主要區(qū)別作用的峰分別為峰9以及峰6（按影響大小排序），且2 個(gè)峰為紅糖與赤砂糖的共有峰。在紅糖和黑糖進(jìn)行對(duì)比時(shí)，峰13、峰10、峰15、峰11（按影響大小排序）的貢獻(xiàn)較大。4 個(gè)峰均為黑糖獨(dú)有峰。因此，可以據(jù)此6 個(gè)峰，對(duì)幾種糖類樣品進(jìn)行鑒別。

2.7 共有峰定性分析

為了進(jìn)一步確定共有峰成分，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[20-21]結(jié)合對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)。9號(hào)色譜峰成分：高分辨四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜給出其準(zhǔn)分子離子峰m/z175.2[M+H]+，確定其分子式為C6H6O6。1H核磁共振（nuclear magnetic resonance ，NMR）（D2O，500 MHz），δ3.890（1H，d，H-2），δ4.878（1H，dd, H-3），δ7.051（1H，s，H-1）。13C NMR（D2O，125 MHz），δ33.36（C-4），δ130.66（C-2），δ139.06（C-3），δ168.77（C-4），δ169.52（C-6），δ174.69（C-5）。上述1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)與SciFinder數(shù)據(jù)庫(kù)中的反-烏頭酸的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為反-烏頭酸，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖6。

圖 6 反-烏頭酸結(jié)構(gòu)圖Fig. 6 Structure of trans-aconitic acid

進(jìn)一步，采用反-烏頭酸和順-烏頭酸對(duì)照品進(jìn)行標(biāo)定，紅糖對(duì)照?qǐng)D譜中特征峰6號(hào)和9號(hào)的成分確認(rèn)，見(jiàn)圖7。

圖 7 紅糖、黑糖對(duì)照?qǐng)D譜特征峰的成分確認(rèn)Fig. 7 Confirmation of the characteristic peaks of brown sugar and black sugar

3 討論與結(jié)論

許多紅糖相關(guān)的產(chǎn)品不斷開(kāi)發(fā)出來(lái)，僅紅糖本身的分類較多，許多紅糖標(biāo)注古法制造，亦或是原生態(tài)紅糖，以求提高產(chǎn)品價(jià)值[7-8,22-23]。市場(chǎng)上主要存在的赤砂糖、紅糖以及黑糖，價(jià)格和質(zhì)量參差不齊，沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，為消費(fèi)者的選擇帶來(lái)了很大困擾。

本實(shí)驗(yàn)選擇課題組前期建立的藥用輔料紅糖紫外指紋圖譜[15]，較為全面地考察4 個(gè)不同品種市售的糖的成分以及含量，并且通過(guò)化學(xué)模式識(shí)別，判斷4 類糖成分是否有明顯差別。

結(jié)果表明，赤砂糖和白砂糖基本一致，與紅糖和黑糖的差異明顯，成分主要差異在峰6和峰9上。紅糖與黑糖成分類似，但仍能夠通過(guò)峰13、峰10、峰15、峰11（按影響大小排序）明顯區(qū)分。

白砂糖主要以甘蔗、甜菜或原糖為原料，通過(guò)榨汁、過(guò)濾等一步或兩步沉淀后得到的。而赤砂糖則是生產(chǎn)白砂糖時(shí)的副產(chǎn)品[24]，這類赤砂糖在市場(chǎng)上售賣時(shí)，也標(biāo)注為紅糖。古法或者純手工制作的紅糖從榨汁到過(guò)濾熬糖、起糖的整個(gè)過(guò)程沒(méi)有水參與，保留了甘蔗中豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)，口感香氣更佳[25-26]。黑糖則是熬制時(shí)間更久的紅糖，在相應(yīng)的國(guó)家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，黑糖的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)和要求比紅糖更高。Qu Ruijing等[27]在甘蔗汁的渾濁沉淀中分析出，其主要是多糖、蛋白質(zhì)、酯類、膠體和多酚，并有少量的無(wú)機(jī)元素，Wang Liwen等[28]發(fā)現(xiàn)甘蔗提取物中主要成分為表兒茶素的多酚物質(zhì)，可以抗組織纖維化。紅糖和黑糖在生產(chǎn)加工時(shí)，并不需要徹底精制或是沉淀過(guò)濾，其甘蔗原有的多酚類物質(zhì)保留較多，從生產(chǎn)工藝與化學(xué)模式識(shí)別的結(jié)果結(jié)合推測(cè)分析，不同糖的加工生產(chǎn)工藝以及熬制的時(shí)間可能是造成其成分差異以及藥理活性差異的原因之一。這為后續(xù)的進(jìn)一步研究提供了方向和思路。

幾種糖的差異以及區(qū)分已經(jīng)有較多研究[29]，但并沒(méi)有通過(guò)數(shù)據(jù)證實(shí)其從成分含量上的具體區(qū)別。并且，市面上也存在售假或者虛假宣傳的現(xiàn)象[30-31]，白砂糖與赤砂糖主要滿足的顧客需求與紅糖和黑糖有著明顯差異，廣大消費(fèi)者應(yīng)該注意所購(gòu)買的糖是否達(dá)到預(yù)期購(gòu)買愿望，滿足自身需求。

本實(shí)驗(yàn)建立紅糖、白砂糖、赤砂糖、黑糖的指紋圖譜，并通過(guò)化學(xué)模式識(shí)別（聚類分析、PCA和正交最小二乘法判別分析），發(fā)現(xiàn)白砂糖與赤砂糖較為相似，赤砂糖S19、S21和S22在聚類分析時(shí)可歸為白砂糖。赤砂糖與紅糖、黑糖之間的差異較大，通過(guò)峰6與峰9的含量高低可以進(jìn)行區(qū)分；紅糖與黑糖較為相似，有13 個(gè)共有峰，但可以通過(guò)是否有峰13、峰10、峰15、峰11（按影響大小排序）進(jìn)行區(qū)分。該方法為紅糖、白砂糖、赤砂糖、黑糖的鑒定、區(qū)分以及品質(zhì)評(píng)價(jià)提供了新的思路。