樂小鳳，曹建宏，趙亞蒙，尹春曉，鞠延侖，張振文,3,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.香格里拉酒業(yè)股份有限公司，云南 迪慶 674400；3.陜西省葡萄與葡萄酒工程中心，陜西 楊凌 712100）

刺葡萄（Vitis davidiiFoex.）是葡萄科葡萄屬東亞種群的一種野生種質(zhì)資源，原產(chǎn)于湖南、云南、廣東、江西、浙江等省，是多年生落葉藤本植物[1]。刺葡萄作為湖南特色的種質(zhì)資源之一，具有優(yōu)良的品種特性，湖南省懷化市中方縣的刺葡萄也開始從鮮食往釀酒的方向發(fā)展[2]。

葡萄果實(shí)中的酚類物質(zhì)對葡萄酒顏色、口感、酒體和結(jié)構(gòu)起著重要的作用，酚類物質(zhì)的生物合成與積累主要受葡萄品種、土壤條件、氣候、產(chǎn)地、栽培方式[3-9]等因素的影響。產(chǎn)量的調(diào)控是影響釀酒葡萄果實(shí)與葡萄酒質(zhì)量的一項(xiàng)重要的栽培措施[10-13]，可通過疏花、疏果和冬剪等措施實(shí)現(xiàn)。葡萄新梢上結(jié)果過多，葡萄果實(shí)糖分和酚類物質(zhì)積累緩慢，養(yǎng)分的消耗過度易造成葡萄樹體的早衰，從而導(dǎo)致葡萄果粒不能正常生長和著色困難；葡萄新梢上結(jié)果過少，影響葡萄植株生殖生長與營養(yǎng)生長的平衡。每個(gè)葡萄品種的適宜產(chǎn)量不一，豆一玲等[14]對歐亞種釀酒葡萄霞多麗進(jìn)行不同負(fù)載量的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)降低葡萄負(fù)載量能提高漿果和葡萄酒品質(zhì)，產(chǎn)量過大則品質(zhì)表現(xiàn)較差；宋潤剛等[15]研究結(jié)果表明隨著山葡萄產(chǎn)量的增加，果穗質(zhì)量、果粒質(zhì)量和果實(shí)總糖含量大幅度降低；陳奕霖等[16]以山東煙臺(tái)地區(qū)歐亞種釀酒葡萄蛇龍珠為實(shí)驗(yàn)材料，研究不同產(chǎn)量水平對漿果品質(zhì)的影響，結(jié)果顯示，隨著產(chǎn)量的降低，果實(shí)的成熟期呈明顯縮短的趨勢，葡萄果皮的總酚和總花色素含量呈上升趨勢，且在一定的產(chǎn)量范圍內(nèi)，產(chǎn)量降低，單寧含量上升。目前，有關(guān)產(chǎn)量對釀酒葡萄果實(shí)品質(zhì)影響的報(bào)道較多[17-19]，對刺葡萄品系品質(zhì)的研究較少，探討刺葡萄的主要酚類物質(zhì)對刺葡萄酒釀造有著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)以刺葡萄品系中的甜葡萄品種為試材，研究不同產(chǎn)量對甜葡萄果實(shí)品質(zhì)及酚類物質(zhì)的影響，以期為湖南省刺葡萄酒的生產(chǎn)釀造提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)地位于湖南省懷化市中方縣桐木鎮(zhèn)，供試材料為刺葡萄品系中的甜葡萄品種，定植于2008年，棚架，株行距為3.5 m×5.5 m，常規(guī)管理。

甲酸、甲醇、鹽酸和乙腈均為分析級(jí)，所有花色苷單體標(biāo)準(zhǔn)樣和單體酚單體標(biāo)準(zhǔn)樣均為色譜純，購自美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀、UV-1700紫外-可見分光光度計(jì)美國Agilent公司；5804R低溫冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；KH200KDB超聲波振蕩器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；CentriVap 78100-40離心濃縮系統(tǒng)美國Labconco公司；FA2004型電子天平 上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)量管理和采樣

2014年和2015年，當(dāng)甜葡萄果粒發(fā)育到黃豆粒大小時(shí)，即花后兩周時(shí)進(jìn)行疏穗處理，高產(chǎn)為原有最高產(chǎn)量，每個(gè)結(jié)果枝果穗處理成平均2 穗，產(chǎn)量預(yù)測2 500 kg/667 m2（L3）；中產(chǎn)將每個(gè)結(jié)果枝果穗處理成平均1.5 穗，產(chǎn)量預(yù)測1 900 kg/667 m2（L2）；低產(chǎn)處理為將所有果枝均留1 穗，產(chǎn)量預(yù)測1 300 kg/667 m2（L1）。每個(gè)處理隨機(jī)選長勢一致的20 株葡萄植株，均重復(fù)3 次。葡萄成熟時(shí)（還原糖質(zhì)量濃度＞170 g/L），每個(gè)處理隨機(jī)采600 粒果實(shí)，3 次生物學(xué)重復(fù)。隨機(jī)取200 粒果實(shí)用于測定還原糖和總酸含量，剩余葡萄樣品存儲(chǔ)于-40 ℃冰箱，用于花色苷和單體酚的測定。

1.3.2 果實(shí)基本指標(biāo)的測定

采用斐林試劑熱滴定法測定還原糖含量[20]；酸堿滴定法測定總酸含量[21]。

1.3.3 果皮花色苷測定

每個(gè)處理隨機(jī)取200 粒果實(shí)，冷凍且避光狀態(tài)下剝皮，液氮速凍后打粉并置于冷凍干燥機(jī)中烘干，隨機(jī)稱取0.5 g干粉，用10 mL甲酸-甲醇溶液（2%）溶解，避光超聲10 min后25 ℃搖床振蕩提取30 min，4 ℃、8 000 r/min離心5 min，取上清液，以上提取步驟重復(fù)4 次，合并上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀31 ℃蒸干，殘?jiān)昧鲃?dòng)相溶解并定容至10 mL，-80 ℃保存?zhèn)溆?，樣品進(jìn)樣前用0.45 μm有機(jī)濾膜過濾，使用高效液相色譜-三重四極桿-離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測，分析條件參照文獻(xiàn)[22]。

1.3.4 果皮非花色苷單體酚類物質(zhì)測定

干粉制備過程與花色苷一致，非花色苷單體酚類物質(zhì)則稱取1.0 g干粉、添加5 mL蒸餾水和45 mL乙酸乙酯，25 ℃、150 r/min搖床中避光提取30 min，收集上清液，再重復(fù)提取3 次，合并上清液后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（30 ℃）蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜? mL，-40 ℃保存?zhèn)溆?，樣品進(jìn)樣前用0.45 μm有機(jī)濾膜過濾，使用高效液相色譜-三重四極桿-離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測，分析條件參照文獻(xiàn)[22]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，進(jìn)行Duncan檢驗(yàn)，P＜0.05，差異顯著。用Excel軟件制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)量對甜葡萄果實(shí)總酸和還原糖含量的影響

如圖1所示，2014年和2015年甜葡萄總酸含量隨產(chǎn)量增大而增加，L3產(chǎn)量葡萄的總酸顯著高于其他2 個(gè)處理，其中L1的葡萄總酸含量最低；甜葡萄的還原糖含量則隨產(chǎn)量增大而降低，2014年和2015年的甜葡萄L1的還原糖質(zhì)量濃度分別為193.87 g/L和187.66 g/L，與L3相比，分別提升了6.00%、6.90%。

表 1 產(chǎn)量對甜葡萄單體花色苷和含量的影響Table 1 Effect of different crop yields on anthocyanin composition and content of Tianputao berries

圖 1 不同產(chǎn)量的甜葡萄總酸（A）和還原糖（B）含量Fig. 1 Total acid (A) and reducing sugar (B) contents of Tianputao berries with different loading treatments

2.2 產(chǎn)量對甜葡萄果實(shí)單體花色苷含量的影響

如表1所示，各樣品均檢測到9 種花色苷，包括4 種基本花色苷，1 種咖啡酰化花色苷，4 種香豆?；ㄉ?。4 種基本花色苷包括花翠素-3,5-O-二葡萄糖苷、甲基花翠素-3,5-O-二葡萄糖苷、二甲花翠素-3,5-O-二葡萄糖苷和二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷。2014年，除花翠素-3,5-O-二葡萄糖苷之外，其他3 種基本花色苷含量均隨著負(fù)載量的增加而顯著降低；2015年，除二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷和甲基花翠素-3,5-O-二葡萄糖苷含量表現(xiàn)為隨負(fù)載量的增加而降低外，其他基本花色苷含量均為L2處理最高。2015年，甜葡萄果皮的咖啡酰化花色苷含量為L1處理最低，咖啡酰化花色苷約占單體花色苷總量的2.00%。在酰化花色苷中，二甲花翠素-3,5-香豆酰化二葡萄糖苷含量占比最大，表現(xiàn)為L1處理含量略低。由表1可知，年份對花色苷總量影響較大，2014年表現(xiàn)為L1含量最高，2015年則為L2含量較高；其中基本花色苷總量均表現(xiàn)為L3處理的葡萄含量最低。

2.3 產(chǎn)量對甜葡萄果實(shí)非花色苷單體酚類物質(zhì)含量的影響

表 2 不同產(chǎn)量的甜葡萄非花色苷單體酚類含量Table 2 Effect of different crop yields on non-anthocyanin monomeric phenolic compounds contents of Tianputao berries

如表2所示，其中羥基苯甲酸和羥基肉桂酸類物質(zhì)占非花色苷單體酚類物質(zhì)總量的比例小，黃酮醇類物質(zhì)占比高達(dá)99%。從兩年的非花色苷單體酚類物質(zhì)總量和黃酮醇類物質(zhì)含量看，L2處理的葡萄含量最高，其次是L1處理，L3產(chǎn)量的葡萄含量最低。2014年，L1、L2和L3處理的葡萄中分別檢測到13、11 種和12 種非花色苷單體酚類組分，山柰酚-3-O-葡萄糖苷和3-羥基肉桂酸只在L1處理的葡萄中檢測到，二氫山柰酚只在L3處理的葡萄中檢測到；除了原兒茶酸和香草酸在L1處理中含量最高，其他非花色苷單體酚類組分含量均表現(xiàn)為L2處理的葡萄顯著高于另外2 個(gè)處理，其中槲皮素-3-O-半乳糖苷、鼠李糖素-3-O-半乳糖苷和丁香亭-3-O-葡萄糖苷的含量在L1和L3之間差異不顯著。2015年，L1處理的葡萄中未檢測到3-羥基肉桂酸，除阿魏酸和二氫山柰酚外，其他非花色苷單體酚類含量均表現(xiàn)為L2＞L1＞L3，且差異顯著。2014年的非花色苷單體酚類組分含量略高于2015年，這可能是由于年份之間的差異造成的。

2.4 不同產(chǎn)量甜葡萄果實(shí)的主成分分析（principal component analysis，PCA）

圖 2 不同產(chǎn)量甜葡萄品質(zhì)的第1、2主成分得分散點(diǎn)圖Fig. 2 Scatter plot of the first two principal components for quality attributes of Tianputao berries with different crop yields

運(yùn)用SPSS軟件對兩年不同產(chǎn)量甜葡萄的還原糖、總酸、單體花色苷以及非花色苷單體酚類含量分別進(jìn)行PCA，并分別以前兩主成分作散點(diǎn)圖。由圖2可以看出，兩年間3 種產(chǎn)量下的甜葡萄分布范圍較為一致，分布較分散說明3 種產(chǎn)量下的甜葡萄品質(zhì)具有差異性。2014年，PC1貢獻(xiàn)率為59.126%，主要反映了還原糖、總酸和大部分單體花色苷以及非花色苷單體酚類的變異信息；PC2貢獻(xiàn)率為39.513%，反映了部分非花色苷單體酚類的變異信息。影響L1處理葡萄的成分主要分布在PC1的正方向和PC2的負(fù)方向，L1產(chǎn)量下果實(shí)的還原糖、甲基花翠素-3,5-O-二葡萄糖苷、二甲花翠素-3,5-O-二葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、花翠素-3,5-O-二葡萄糖苷、花翠素香豆?；咸烟擒铡⑸借头?3-O-葡萄糖苷、原兒茶酸、香草酸和3-羥基肉桂酸含量更高。影響L2處理葡萄的成分主要分布在PC1和PC2的正方向，L2產(chǎn)量下果實(shí)的花翠素-3,5-香豆酰化二葡萄糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、鼠李糖素-3-O-半乳糖苷、丁香亭-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸酐、槲皮素-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-鼠李糖苷含量更高。影響L3處理葡萄的成分主要分布在PC1和PC2的負(fù)方向，L3產(chǎn)量下果實(shí)的總酸、花翠素咖啡?；咸烟擒铡⒍谆ù渌?3,5-香豆?；咸烟擒蘸投渖借头雍枯^高。2015年，PC1貢獻(xiàn)率為67.857%，主要反映了部分單體花色苷以及非花色苷單體酚類的變異信息；PC2貢獻(xiàn)率為26.329%，反映了總酸、花翠素咖啡?；咸烟擒?、二甲花翠素-3,5-香豆酰化二葡萄糖苷、阿魏酸、3-羥基肉桂酸和二氫山柰酚的變異信息。3 種產(chǎn)量下的甜葡萄分布與2014年較為一致，L1產(chǎn)量下果實(shí)的還原糖、甲基花翠素-3,5-O-二葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷和花翠素-3,5-香豆酰化二葡萄糖苷含量較高；L2產(chǎn)量下果實(shí)的花翠素香豆酰化葡萄糖苷、甲基花翠素-3,5-香豆?；咸烟擒铡⒃瓋翰杷?、香草酸、鼠李糖素-3-O-半乳糖苷、鼠李糖素3-O-葡萄糖苷和丁香亭-3-O-葡萄糖苷的含量更高；L3產(chǎn)量下果實(shí)的總酸和二氫山柰酚含量較高。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過不同產(chǎn)量對甜葡萄果實(shí)還原糖、總酸、單體花色苷和非花色苷單體酚類的影響進(jìn)行研究，結(jié)果表明，相比于2 500 kg/667 m2的產(chǎn)量，1 300 kg/667 m2和1 900 kg/667 m2的產(chǎn)量顯著提高了果實(shí)的還原糖含量，并降低了總酸含量，這與前人研究結(jié)果一致[23]。較低產(chǎn)量促進(jìn)了果實(shí)成熟過程中呼吸作用對酸的消耗，從而降低了葡萄總酸的含量[24]。較高的還原糖含量可以有效提高酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)，從而增加酒的醇厚感；葡萄總酸含量降低能適當(dāng)?shù)臏p弱高酸度給葡萄酒帶來的刺激感，使葡萄酒更加平衡[12]?；ㄉ疹愇镔|(zhì)是葡萄果實(shí)和葡萄酒的主要呈色物質(zhì)，在很大程度上決定著葡萄果實(shí)和葡萄酒的品質(zhì)，由花色素作為糖苷配基或乙酰化的糖苷配基和糖結(jié)合生成，其修飾方式與甲基化和羥基化程度有關(guān)，甲基化則能加深葡萄酒的紅色色調(diào)，羥基化使葡萄酒往藍(lán)色色調(diào)轉(zhuǎn)變[25-26]。葡萄中的花色苷通常會(huì)在C6位與香豆酸、咖啡酸、乙酸發(fā)生?；磻?yīng)，從而有助于顏色的穩(wěn)定性[12]。花色苷在葡萄中是由類黃酮代謝途徑合成，主要由苯丙氨酸裂解酶、肉桂酸羥化酶、查爾酮合成酶、查爾酮異構(gòu)酶、黃烷酮-3-羥化酶、二氫黃酮醇還原酶、無色花色素雙加氧酶、甲基轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等相互作用合成的[27]，也受到MYB等相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的控制[19]。在葡萄中，花色苷的生物合成和積累主要受遺傳因素影響[28]，同時(shí)也受激素[29]和果實(shí)成熟度[30]等內(nèi)部影響，環(huán)境因素[31-32]（溫度和光照）和田間栽培措施[9,33]（調(diào)虧灌溉、干旱、摘葉、避雨）也決定著花色苷的生物合成與積累。本實(shí)驗(yàn)中，3 種產(chǎn)量下的刺葡萄果皮均檢測到9 種花色苷，低產(chǎn)量顯著提高了花色苷總量，這與King等[34]研究結(jié)果一致。相關(guān)研究也表明合理降低產(chǎn)量可以提高紅色葡萄漿果的花色苷含量，改善葡萄品質(zhì)，也可以顯著改善葡萄酒的感官品質(zhì)、結(jié)構(gòu)感和收斂性[35-38]。疏穗處理可能改善了植株的庫源關(guān)系以及漿果的微環(huán)境，從而有利于花色苷的合成和積累[39]。非花色苷單體酚類是葡萄中重要的生物活性物質(zhì)，主要包括羥基肉桂酸、羥基苯甲酸、黃酮醇、黃烷醇和芪類等[40]。黃酮醇類對酒的澀感也有一定影響，是葡萄酒的重要保健成分[41]，本研究中黃酮醇類物質(zhì)占非花色苷單體酚類比例高達(dá)99%以上，兩年結(jié)果表明，1 900 kg/667 m2產(chǎn)量下的葡萄非花色苷單體酚類總量和黃烷醇類物質(zhì)含量最高，2 500 kg/667 m2產(chǎn)量下最低，說明適量的疏穗可以有效提升葡萄非花色苷單體酚類物質(zhì)的含量，這與劉迪迪等[12]研究結(jié)果一致。Haselgrove等[42]認(rèn)為黃烷醇和黃酮醇等次生代謝物的濃度在一定程度上依賴于植株的產(chǎn)量。1 300 kg/667 m2產(chǎn)量下不利于葡萄黃酮醇的合成與積累，這可能是因?yàn)槭韫^多時(shí)導(dǎo)致葡萄植株?duì)I養(yǎng)生長過剩，消耗養(yǎng)分的同時(shí)還易造成葉幕郁閉，從而不利于相關(guān)代謝物的合成與積累[43-45]。

本實(shí)驗(yàn)通過對湖南省中方縣3 種產(chǎn)量模式下甜葡萄果實(shí)品質(zhì)和酚類物質(zhì)組成的分析發(fā)現(xiàn)，與2 500 kg/667 m2產(chǎn)量相比，1 900 kg/667 m2甜葡萄中花色苷組分和非花色苷單體酚類物質(zhì)含量顯著提高，適當(dāng)?shù)臏p少產(chǎn)量可以為釀造優(yōu)質(zhì)刺葡萄酒提供理論依據(jù)。