劉晗璐，張九凱，韓建勛，孫瑞雪，陳 穎，劉 冰

（1.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；2.食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，教育部食品營養(yǎng)與安全重點實驗室，天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457）

果汁是一種廣受全世界消費者喜愛的食品。純果汁不僅能夠提供人體所需的多種維生素和礦物質，同時還富含類黃酮和多酚等生物活性物質，具有預防氧化應激和抵抗炎癥的作用，有助于防治相關慢性疾病[1-2]。近年來，隨著我國經濟的持續(xù)發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，國內消費者對果汁的消費偏好逐漸從低濃度果汁飲料向中高濃度純果汁轉移[3]。市面上的純果汁分為非濃縮復原（not from concentrate，NFC）果汁和復原（from concentrate，F(xiàn)C）果汁兩類。2015年正式實施的國家標準GB/T 31121—2014《果蔬汁類及其飲料》中明確規(guī)定NFC果汁是以水果為原料，采用機械方法制成的可發(fā)酵但未發(fā)酵的未經濃縮的汁液制品；FC果汁是在濃縮果汁中加入其加工過程中除去的等量水分復原而成的制品。NFC果汁的加工程度較低，且多采用低溫貯藏和冷鏈運輸，因此產品的風味和營養(yǎng)價值都更接近新鮮水果，在我國的需求量及消費量正在逐年增長[4]。由于生產和冷鏈物流成本較高，市面上NFC果汁的零售價格約是FC果汁的2～3 倍，一些商家為牟取巨額利潤會使用低成本的FC果汁冒充NFC果汁。

國內外研究者已圍繞NFC和FC果汁鑒別展開了研究。δ值是重同位素原子豐度與輕同位素原子豐度比值在樣品中的測量值與標樣的比值，植物的蒸騰作用使得其組織內部水的D和18O發(fā)生富集，而復配濃縮汁時添加的地下水會影響FC果汁中水的δD和δ18O，有研究應用穩(wěn)定同位素比值質譜法檢測NFC和FC果汁，結果發(fā)現(xiàn)NFC果汁中水的δD和δ18O明顯高于地下水，且區(qū)別于FC果汁[5-6]。Lerma等[7]觀察到殺菌、濃縮、加水調配等關鍵商業(yè)化加工步驟會顯著降低果汁中可鑒定蛋白質數(shù)量，同時可能改變果汁的營養(yǎng)特性，在此研究基礎上建立了一種評估橙汁以及橙味飲料蛋白質組學特征的分析程序，有助于驗證商業(yè)產品的真實性。不同于對特定檢測指標和大分子物質的分析，W?odarska等[8]基于同步熒光光譜獲得了商業(yè)NFC和FC蘋果汁的代謝指紋圖譜，經對比發(fā)現(xiàn)兩者的熒光光譜存在差異，其中非酶褐變產物的熒光信號是區(qū)分FC和NFC果汁的重要原因。此外，Goodner等[9]利用電子鼻識別NFC和FC橙汁的氣味組成，然后對所采集數(shù)據(jù)進行判別因子分析，結果顯示2 種橙汁得到充分分離，模型的區(qū)分能力良好。

代謝組學是一種旨在識別和量化小分子代謝物的新型研究手段，它從整體角度出發(fā)，運用現(xiàn)代檢測技術對食品中盡可能多的代謝產物進行分析檢測，已在果汁摻假鑒別中得到了廣泛應用[10-14]。造成NFC果汁和FC果汁風味和營養(yǎng)成分差異的主要原因一方面在于NFC果汁在原料選用時的嚴格性，另一方面則在于加工工藝的不同，F(xiàn)C果汁需要經過濃縮，還原復配和二次殺菌的復雜加工，并且NFC果汁在生產時往往采用較溫和的殺菌技術[15]。小分子代謝物是食品本身的重要組分，它決定了食品的營養(yǎng)、質地、風味、味道和顏色，這些物質在加工過程中可能發(fā)生變化，可以通過代謝組學對它們進行監(jiān)測和評估[16-18]。

橙汁是世界上消費最廣泛的果汁之一，其銷量占全球果汁的一半以上。橙汁是最受我國消費者喜愛的純果汁口味，占比達46.5%[19]。本研究采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）聯(lián)用技術結合化學計量學方法，對自制NFC和FC橙汁的小分子代謝物進行分析，旨在探明經過不同加工工藝后2 種橙汁間的成分差異，以期為NFC果汁鑒偽研究提供參考，為促進我國果汁飲料行業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展作出貢獻。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4 種加工用甜橙（Citrus sinensis(L.) Osbeck），包括2 個早熟甜橙品種哈姆林、早金和2 個中熟品種錦橙、特羅維塔，甜橙果實由重慶派森百橙汁有限公司提供，產自重慶忠縣，于2018年12月采收。

甲醇、水（質譜級） 美國Honeywell公司；甲酸（質譜級），標準品：蕓香柚皮苷（≥98%）、柚皮苷（≥95%）、香蜂草苷（≥98%）、枸橘苷（≥98%）、橙皮苷（≥97%）、新橙皮苷（≥95%）、橙皮素（≥98%）、芹菜素6,8-二-C-葡萄糖苷（又稱維采寧-2）（≥95.0%） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

TripleTOF 6600四極桿串聯(lián)飛行時間質譜儀 美國AB SCIEX公司；LC-20XR超高效液相色譜系統(tǒng) 日本島津公司；5920R型冷凍高速離心機 德國Eddendorf公司；渦旋振蕩器 德國IKA公司；數(shù)顯糖度計廣州愛宕科學儀器有限公司；UM5破碎機 德國Stephan公司；迷你均質機 加拿大ATS公司；R3088旋轉蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司；1083型恒溫振蕩水浴器 德國GFL公司。

1.3 方法

1.3.1 NFC和FC橙汁的制備

果汁樣品制備于中華全國供銷合作總社濟南果品研究院。

NFC橙汁的制備：挑選飽滿、無病害的甜橙鮮果，清洗干凈后切瓣，剝去橙皮，果肉進行破碎和榨汁，使用干凈紗布過濾除去果渣果籽，果汁進行均質和脫氣操作后分為3 份，分別采用不同的熱力殺菌條件進行處理，包括巴氏殺菌（中心溫度80 ℃、10 min）、高溫短時殺菌（中心溫度90 ℃、30 s）和超高溫瞬時殺菌（125 ℃、5 s），殺菌灌裝后迅速冷卻至20 ℃，然后測定和記錄NFC橙汁的糖度值。

FC橙汁的制備：將NFC橙汁置于真空旋轉蒸發(fā)儀濃縮至（65±1）°Brix，再使用純凈水復配至原始糖度值，水浴加熱殺菌（中心溫度80 ℃、10 min）后進行熱灌裝。全部果汁樣品灌裝后迅速冷卻至室溫后冷藏，并于1 周內完成樣品制備和儀器分析，剩余樣品置于-20 ℃條件下儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品前處理

將NFC橙汁（n=12）和FC橙汁（n=12）以12 000 r/min離心20 min，取上清液，使用純凈水稀釋10 倍，渦旋混合充分，經0.22 μm聚四氟乙烯膜過濾器過濾，轉移至1.5 mL進樣小瓶中，等待上機檢測。每個樣品做3 次平行重復。

1.3.3 UPLC-QTOF-MS分析條件

色譜條件：色譜柱使用美國Phenomenex公司的Kinetex C18反相色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流動相A為水（含0.1%甲酸），流動相B為甲醇（含0.1%甲酸）；梯度洗脫程序：0～2 min，98% A、2% B；2～14 min，98%～5% A、2%～95% B；14～17 min，5% A、95% B；17.1～20 min，98% A、2% B；柱溫40 ℃，進樣量2 μL，流速0.3 mL/min。

質譜條件：采用電噴霧電離源，在正離子和負離子模式下采集數(shù)據(jù)，噴霧電壓分別為5 500 V和-4 500 V。工作氣為氮氣，霧化氣、輔助加熱氣和氣簾氣壓力分別為50、55、35 psi，離子源溫度550 ℃，碰撞能量為35 V，碰撞能量范圍±15 V。建立信息關聯(lián)采集方法結合動態(tài)背景扣除，設置一級質譜質量掃描范圍m/z100～1 000，二級質譜質量掃描范圍m/z50～1 000，在每個循環(huán)內同時進行10 個MS/MS掃描（每個50 ms）。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理與化學計量學分析

使用MarkerView 1.3.1軟件進行數(shù)據(jù)預處理。使用自動算法對保留時間0.5～18 min、m/z100～1 000的數(shù)據(jù)進行挖掘，將得到的峰值數(shù)據(jù)集輸出并導入SIMCA 15.0軟件，進行無監(jiān)督的主成分分析（principal component analysis，PCA）和有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）。Origin 9.0軟件用于箱形圖繪制。

1.3.5 差異化合物篩選與鑒定

根據(jù)OPLS-DA模型的變量投影重要性（variable importance in the project，VIP）篩選潛在差異化合物，將母離子精確質荷比輸入PeakView 1.2軟件中提取相應的離子峰，排除二聚體、加合峰和空白樣品峰，結合t檢驗結果篩選出P＜0.05的差異化合物。

物質鑒定借助PeakView軟件的Formula Finder功能和MS-FINDER 3.16軟件，將未知化合物的一級和二級離子碎片信息輸入軟件中，對可能的分子式和化學結構進行預測和推導計算，將實驗譜圖與HMDB（http://www.hmdb.ca/）、MoNA（https://mona.fiehnlab.ucdavis.edu/）和Metlin（https://metlin.scripps.edu/）等網絡數(shù)據(jù)庫和相關文獻記載進行對比，結合標準品驗證，確定物質結構。

2 結果與分析

2.1 NFC和FC橙汁的UPLC-QTOF-MS代謝指紋圖譜分析

圖 1 橙汁樣品的總離子流圖Fig. 1 UPLC-QTOF-MS total ion current chromatograms of orange juice samples

基于高通量的UPLC-QTOF-MS方法分別在負離子和正離子模式下對NFC和FC橙汁樣品進行檢測，得到不同樣品的總離子流圖（圖1）。負離子模式下化合物的出峰時間主要集中在0.5～1.5 min和7～10 min。由正離子模式掃描所得到的總離子流圖中離子峰的數(shù)量要多于負離子模式，主要在0.5～2.0、5.5～10 min和14.5～17 min出峰?？梢钥闯鲈谪撾x子和正離子2 種掃描模式下，NFC和FC橙汁樣品的峰形基本一致，但是有部分化合物離子峰的相對豐度存在差異。為了獲得盡可能全面的橙汁樣品代謝物信息，后續(xù)分析將圍繞著2 種模式的數(shù)據(jù)進行。

2.2 NFC和FC橙汁的化學計量學分析

使用MarkerView軟件處理利用UPLC-QTOF-MS技術在正離子和負離子模式下采集的原始數(shù)據(jù)。進行峰識別和對齊后，得到一個包含母離子質荷比，保留時間和離子相對豐度的數(shù)據(jù)矩陣，選擇矩陣中的單一同位素峰并去除空白離子峰后，分別在正離子和負離子模式下提取到1 705 個和956 個峰，然后將數(shù)據(jù)集導入SIMCA軟件進行PCA和OPLS-DA。

圖 2 負離子（A）和正離子（B）模式下NFC和FC橙汁樣品的PCA得分圖Fig. 2 PCA score plots of NFC and FC orange juice samples in the negative ion (A) and the positive ion modes (B)

PCA夠降低復雜多變量數(shù)據(jù)集的維度，并對其進行可視化，同時盡可能地保留原始數(shù)據(jù)中存在的信息[20]。不同離子的相對豐度數(shù)值存在巨大差異，會顯著影響PCA的數(shù)據(jù)方差，因此在分析前對數(shù)據(jù)執(zhí)行Pareto縮放以降低各個變量間的豐度差異。PCA結果顯示，在得分圖中藍色的NFC橙汁樣品點和綠色的FC橙汁樣品點分布有所離散，說明兩者的代謝成分存在一定差異，但是不能實現(xiàn)完全分離。組內樣本點分布較為分散，這可能是受到甜橙品種、成熟度、生長氣候和殺菌條件等因素的影響。R2和Q2是數(shù)據(jù)模型質量參數(shù)，數(shù)值越接近1說明模型的擬合效果和預測能力越好。本實驗中，使用負離子模式數(shù)據(jù)生成的PCA模型的質量（R2=0.806，Q2=0.524）優(yōu)于正離子模式（R2=0.608，Q2=0.331），樣品的聚類分離效果也相對更好（圖2）。

為充分提取2 組樣本間的差異信息，進一步采用有監(jiān)督的OPLS-DA數(shù)據(jù)。由于在建立模型時預先提供了分組信息，可以有效降低組內個體差異對模型的影響，有利于排除無關變量而將組間差異放大，增強模型的解釋能力。本實驗以降低品種和殺菌等條件的影響，放大NFC和FC橙汁的組間差異為前提，建立了OPLS-DA模型。如圖3所示，NFC和FC橙汁的樣品點分布在不同區(qū)域并且明顯分為2 個簇，實現(xiàn)了對2 類樣品的完全區(qū)分，結果表明2 種果汁樣品在代謝物種類和（或）含量上存在差異。在OPLS-DA中，主要通過參數(shù)指標和Q2對模型質量進行評估，負離子模式下= 0.959，Q2（cum）=0.902；正離子模式下模型擬合參數(shù)=0.974，Q2（cum）=0.921，說明根據(jù)2 種采集模式所得數(shù)據(jù)建立的OPLS-DA模型都擬合了較多的變量信息，且具有良好的預測能力。

圖 3 負離子（A）和正離子（B）模式下NFC和FC橙汁樣品的OPLS-DA得分圖Fig. 3 OPLS-DA score plots of NFC and FC orange juice samples in the negative ion (A) and positive ion modes (B)

置換檢驗可驗證模型的有效性，防止發(fā)生過度擬合。若原始模型的預測能力（即Q2值）大于左邊任何一個Y變量隨機排列模型的Q2值，在y軸上的截距小于0，可以認為模型質量較好，沒有過擬合。圖4是200 次循環(huán)迭代置換檢驗的結果，Q2的回歸直線與y軸的交點在負半軸，負離子模式R2（0.0，0.522）和Q2（0.0，-0.654），正離子模式R2（0.0，0.668）和Q2（0.0，-0.574），說明建立的OPLS-DA模型穩(wěn)健可靠。

圖 4 OPLS-DA模型的200 次循環(huán)置換檢驗結果Fig. 4 Model validation using permutation test with 200 cycles

2.3 差異化合物的篩選與鑒定

VIP反映了每個變量對各組樣本分類判別的影響和解釋能力，通常認為數(shù)值大于1時，變量對組間分離具有顯著貢獻[21]。本研究以VIP值高于1.3為條件，根據(jù)OPLS-DA模型的VIP值篩選潛在差異化合物，然后對其進行t檢驗，將P小于0.05的物質認為是NFC和FC橙汁的差異化合物。

由篩選得到的差異化合物使用PeakView軟件的FormulaFinder插件進行分子式預測，計算依據(jù)是母離子的精確質荷比、同位素豐度比以及二級離子碎片信息，用于分子式計算的元素設置如下：C（n≤50）、H（n≤100）、N（n≤10）、O（n≤20）、P（n≤15）和S（n≤5），質量偏差范圍設置在5×10-6。然后利用MS Finder軟件解析未知物可能的化學結構，該軟件從鍵離解能、精確質量數(shù)、MS/MS碎片信息以及氫重排規(guī)則等方面綜合考慮，按照加權分數(shù)對鑒定結果進行排序，排名靠前說明未知物是該化合物的可能性更高[22]。為了進一步驗證鑒定結果，將實驗MS/MS譜圖與代謝物數(shù)據(jù)庫中的參考譜圖以及相關文獻報道進行對比和推導。在正離子和負離子模式下經過篩選和鑒定后共得到16 種差異化合物，精確質荷比、保留時間、二級碎片離子和分子式等信息見表1。

表 1 NFC和FC橙汁的差異標記化合物信息表Table 1 Overview of differential marker compounds between NFC and FC orange juices

以幾種黃酮糖苷化合物為例，對未知物的鑒定過程進行說明。黃酮苷具有典型的MS/MS碎裂模式，根據(jù)準分子離子所丟失片段的精確質量可以判斷其結構組成[23]。在正離子模式下檢測到化合物M6，保留時間為8.62 min，一級質譜中[M+H]+的精確質量數(shù)為581.187 1，計算得到分子式為C27H32O14，二級質譜圖中準分子離子[M+H]+丟失鼠李糖或葡萄糖基碎片得到離子[M+H-146]+m/z435和[M+H-162]+m/z419，以及同時失去二糖基團形成的柚皮素苷元離子[A+H]+m/z273。結合色譜分離的保留時間可以實現(xiàn)對同分異構體的區(qū)分，在苷元相同的情況下，蕓香糖苷化合物的極性大于新橙皮糖苷化合物，前者的出峰時間早于后者[24]，最終結合標準品驗證鑒定為蕓香柚皮苷（柚皮素7-O-蕓香糖苷）。采用這種方法還鑒定出化合物M7為枸橘苷（異櫻花素7-O-新橙皮糖苷），M8為橙皮苷（橙皮素7-O-蕓香糖苷）。

通過觀察化合物M10的二級質譜圖發(fā)現(xiàn)，在負離子模式下準分子離子峰[M-H]-失去一分子H2O得到碎片[M-H-18]-m/z575，同時還有一系列C-糖苷類化合物的特征離子碎片[M-H-90]-m/z503，[M-H-120]-m/z473，[M-H-120-90]-m/z383和[M-H-240]m/z353[25]，通過譜庫檢索匹配結合標準品驗證，確定該化合物為芹菜素6,8-二-C-葡萄糖苷，是柑橘類中常見的一種黃烷酮糖苷[26]。

2.4 NFC和FC橙汁的代謝差異分析

在本研究中，樣品組的區(qū)別不是基于某些僅存在于其中一組的特征化合物，而是基于它們的含量差別（離子峰的相對豐度）。FC橙汁中各個差異化合物的相對豐度相比于NFC橙汁均呈現(xiàn)下降趨勢，根據(jù)箱形圖可以直觀表達各化合物在NFC和FC橙汁樣品中的豐度變化（圖5）。綜合鑒定結果發(fā)現(xiàn)，差異化合物以類黃酮、有機酸及其衍生物和生物堿為主。其中包括8 種類黃酮物質，分別為橙皮素、異櫻花苷、橙皮素7-O-葡糖苷、蕓香柚皮苷、枸橘苷、橙皮苷、芹菜素6,8-二-C-葡萄糖苷和麥黃酮7-O-新橙皮苷。類黃酮是甜橙中主要的生物活性成分之一，它具有很強的抗氧化活性，已被證明對人體的健康具有諸多益處[27]。溫度對類黃酮物質的穩(wěn)定性和生物活性具有一定影響，影響程度的大小與化合物的結構有關，如羥基化程度和位置、取代基的存在[28]。Lu Qing等[29]研究發(fā)現(xiàn)經過長時間加熱后血橙汁的總黃酮量降低了22.06%，芹菜素6,8-二-C-葡萄糖苷、橙皮苷和香蜂草苷等含量均下降10%以上，與本研究結果類似，說明加工過程中的熱處理會對FC果汁中的類黃酮物質造成顯著影響，降低果汁的營養(yǎng)價值。同時，一些黃烷酮（如橙皮苷）屬于苦味化合物，它們含量高低還影響著水果及果汁的感官品質[30]。

Citbismine C和Hallacridone為啶酮類生物堿，兩者均是自蕓香屬植物的植物組織中分離得到[31-32]。吖啶酮類是含有氮元素的大環(huán)共軛化合物，已被證明具有抗腫瘤、抗癌、抗菌和酶抑制等生物活性[33]。Hallacridone在NFC樣品組內含量差異較大，這可能是受到甜橙品種和成熟度等因素的影響，在經過加熱濃縮后FC橙汁中該物質的含量顯著減少，成分損失較大。

另一類重要的差異物是有機酸類，包括脫氫抗壞血酸、檸檬酸（或異檸檬酸）和阿拉伯酸等6 種成分，它們在FC果汁加工工藝條件下受到的損失要高于NFC。阿拉伯酸是含有羧酸基團的糖酸衍生物，KEGG分析表明其參與抗壞血酸和醛糖代謝途徑，被作為途徑中L-阿拉伯糖酸脫水酶的底物。檸檬酸和異檸檬酸互為異構體，在MS/MS鑒定中沒能對這2 種物質做出區(qū)分，但這2 種有機酸都是用于評估橙汁真實性和品質的重要標記物[34]。相比于異檸檬酸，檸檬酸的化學性質要更加穩(wěn)定，是橙汁中含量最高的有機酸，顯著影響著果汁的風味特征[35]。不同于先前的文獻報道主要圍繞橙汁中抗壞血酸的熱損失含量變化、降解動力學規(guī)律等進行研究[30,36-37]，本研究發(fā)現(xiàn)脫氫抗壞血酸受加工操作的影響，在FC橙汁中含量出現(xiàn)明顯降低。脫氫抗壞血酸由抗壞血酸氧化產生，與抗壞血酸具有相同的生理活性。根據(jù)抗壞血酸的降解途徑可知，若可逆形成的脫氫抗壞血酸繼續(xù)發(fā)生氧化，會使內酯環(huán)斷裂產生2,3-二酮古洛糖酸，而這一反應不可逆[38]。因此，脫氫抗壞血酸含量的降低也從側面反映了在濃縮和二次殺菌過程里抗壞血酸成分的流失。

圖 5 NFC和FC橙汁的差異標記化合物比較Fig. 5 Comparison of differential marker compounds between NFC and FC orange juices

3 結 論

本研究使用UPLC-QTOF-MS技術測定NFC和FC橙汁樣品中盡可能多的代謝組成分，利用OPLS-DA模型實現(xiàn)了對2 種果汁的區(qū)分，以OPLS-DA的VIP值高于1.3和t檢驗結果P小于0.05為條件，篩選和鑒定出包括類黃酮、有機酸類和生物堿類等在內，共16 個豐度具有顯著差異的化合物，經過對比發(fā)現(xiàn)，這些差異物在FC橙汁中的含量均低于NFC橙汁。為盡可能貼近工業(yè)上的實際生產工藝，本實驗采用了巴氏殺菌、高溫短時殺菌和超高溫瞬時殺菌3 種熱殺菌方式分別對NFC橙汁進行處理，但在分析時未就殺菌條件進行比較，而是通過建立有監(jiān)督的OPLS-DA模型放大NFC和FC橙汁間的差異，專注于探究經過濃縮復配加工后橙汁樣品中代謝組分發(fā)生的共有變化，結果證明代謝組學分析方法可以用于闡明NFC和FC橙汁間的代謝物差異，并為NFC橙汁鑒別提供方法和數(shù)據(jù)參考。