李虹嬌，黃梓聰，吳希陽，丁 郁，唐書澤

（暨南大學理工學院，廣東 廣州 510632）

阪崎腸桿菌（Cronobacter sakazakii）是一種食源性致病菌，其主要感染源為嬰幼兒配方乳粉。近年來，世界各地多次發(fā)現(xiàn)嬰幼兒配方乳粉中阪崎腸桿菌的污染事件。2014年，國家食品藥品監(jiān)督管理總局對國內(nèi)100 家乳粉生產(chǎn)企業(yè)的全部嬰幼兒配方乳粉產(chǎn)品和部分進口產(chǎn)品進行抽樣檢驗，不合格的批次占到了3.07%，涉及國內(nèi)生產(chǎn)嬰幼兒配方乳粉企業(yè)和4 家進口乳粉經(jīng)銷商[1]。2018年，歐盟食品飼料類快速預警系統(tǒng)通報，荷蘭一嬰兒配方乳粉生產(chǎn)企業(yè)在自檢中發(fā)現(xiàn)使用了一批疑似受到阪崎腸桿菌污染的乳清粉，導致3 個品牌、5 個批次的嬰兒配方乳粉存在阪崎腸桿菌污染風險[3]。由于其感染嬰兒后有極高的病死率[2]，引起廣泛關注。阪崎腸桿菌對溫度、酸堿都有較高耐受性，有研究表明其在pH 1.18及72 ℃均有較高的存活率[3-4]，并且阪崎腸桿菌容易獲得抗生素耐藥性[5]，使其在乳粉加工過程中增加了污染的可能性和控制的難度。因此，尋求有效方法控制阪崎腸桿菌在食品加工過程中的污染非常必要。

噬菌體是專門感染細菌的一類病毒，具有嚴格的宿主特異性[6-7]，其抑菌作用安全可靠，因此其可作為一種安全控制細菌污染的有效方式。近年來，國內(nèi)外關于噬菌體在食品中對不同食源性致病菌控制的有關研究多有報道[8-9]，其中包括殺滅食品中的沙門氏菌[10-11]、單核細胞性李斯特菌[12]以及金黃色葡萄球菌[13]的噬菌體。相比之下，對阪崎腸桿菌噬菌體的研究較少，尤其在食品應用領域。Kim等[14]最早分離出2 株阪崎腸桿菌噬菌體，在此之后，有研究將阪崎腸桿菌噬菌體應用于嬰幼兒配方乳粉中抑制宿主菌生長[15-17]。噬菌體在乳制品中的應用僅僅表現(xiàn)為對宿主菌殺滅效果的評估，鮮見其可以裂解除宿主以外的阪崎腸桿菌。在國內(nèi)，目前僅有趙貴明等[18]分離出多株阪崎腸桿菌噬菌體，但沒有在食品中對其殺菌效力的評估的報道。本研究通過從河涌水中分離和篩選出能裂解多株阪崎腸桿菌的烈性噬菌體，觀察分析其生物學特性并將其應用于乳制品中抑制2 種不同的菌，旨在為阪崎腸桿菌的生物防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣本取自廣東廣州天河區(qū)河涌污水，阪崎腸桿菌菌株及來源：ATCC25944、ATCC12868來自廣東海關；ATCC29004、ATCCBAA894、12-2、18-7、18-13、18-8、14-15來自西北農(nóng)林科技大學。

LB肉湯培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；DNaseI、RNaseA 上海碧云天生物技術有限公司；EcoRII酶 美國Thermo Fisher Scientific公司；蛋白酶K 德國Merck公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 天津大茂化學試劑廠；乙酸鈉（3 mol/L，pH 5.0，無菌） 北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司。

營養(yǎng)瓊脂半固體培養(yǎng)基為LB肉湯培養(yǎng)基中添加0.5%瓊脂配制而成；SM緩沖液由10 mol/L Tris-HCl（pH 7.5）、100 mol/L NaCl、10 mol/L MgSO4組成，使用時，121 ℃高溫滅菌20 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與設備

ST16R大型冷凍高速離心機 美國Thermo公司；5417R小型冷凍高速離心機 德國Eppendorf公司；M200PRQ酶標儀 瑞士Tecan公司；7000FA100 KV透射電子顯微鏡 日本日立高新技術公司。

1.3 方法

1.3.1 阪崎腸桿菌噬菌體分離與純化

參照趙貴明等[18]的方法，取廣州市天河區(qū)河涌污水樣品100 mL，進行過濾去除污水中的雜質(zhì)，加入阪崎腸桿菌ATCC25944過夜培養(yǎng)物6 mL，37 ℃培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)液經(jīng)過0.45 μm的無菌濾膜過濾除菌。取濾液20 μL滴加到雙層平板上，于37 ℃培養(yǎng)3～4 h后觀察空斑。取雙層平板上透亮、寬直徑的瓊脂塊加入5 mL SM緩沖液中，放入4 ℃過夜，次日7 012×g、4 ℃離心10 min。將上清液用0.45 μm無菌濾膜過濾除菌。取濾液100 μL加入10 mL LB肉湯中，再加入500 μL宿主菌液混勻，37 ℃培養(yǎng)4～5 h，之后將培養(yǎng)液7 012×g、4 ℃離心10 min，將其依次用0.45 μm與0.22 μm濾膜過濾，濾液分裝4 ℃?zhèn)溆?。之后取上述濾液100 μL適當稀釋，與宿主菌做雙層平板，得到單個噬菌斑。重復3～5 次直至獲得大小形態(tài)一樣的噬菌斑。

1.3.2 噬菌體濃縮

將噬菌體原液加入到超濾管（15 mL 100 kDa Millipore）中，4 ℃、5 000×g離心20 min，用SM緩沖液少量反復沖洗濾膜，將洗脫液置于4 ℃，用于DNA提取與電鏡觀察。

1.3.3 噬菌體基因組提取及酶切

參照Higuera等[19]的核酸提取方法，取濃縮噬菌體樣品1 mL于2 mL離心管中，加入40 μL DNaseI（10 mg/mL）和20 μL RNaseA（10 mg/mL），振蕩混勻，于37 ℃水浴加熱30 min，之后加入3 μL蛋白酶K（25 g/L），振蕩混勻，65 ℃水浴加熱15 min，加入20% SDS至終質(zhì)量分數(shù)為5%，振蕩混勻，65 ℃水浴加熱45 min，用苯酚-氯仿（1∶1）溶液抽提上述溶液，抽提直至中間沒有明顯白色蛋白層之后，加入-20 ℃預冷的2 倍體積無水乙醇以及1/10體積的乙酸鈉溶液（3 mol/L，pH 5.0），在-20 ℃沉淀30 min，9 600×g、4 ℃離心5 min，去掉上清液，用70%乙醇溶液洗滌沉淀，輕輕倒去上清液并用干凈的吸水紙吸去水分，空氣中晾干，將其溶于TE溶液中。提取的核酸用EcoRI限制性核酸內(nèi)切酶進行酶切，對酶切產(chǎn)物以1%的瓊脂糖凝膠做電泳分析?？筛鶕?jù)酶切結果計算噬菌體基因組大小。

1.3.4 噬菌體最佳感染復數(shù)（multiplicity of infection，MOI）測定

分別按照MOI為1 000、100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1將噬菌體與對數(shù)期早期的相應宿主菌分別加入到LB肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、130 r/min培養(yǎng)3.5 h，10 956×g離心10 min，取上清液作噬菌體效價測定[20-21]。實驗重復3 次，每次設2 個平行。

1.3.5 噬菌體一步生長曲線測定

將噬菌體與宿主菌按照最佳MOI（MOI=0.001）加入到LB肉湯中，37 ℃吸附培養(yǎng)20 min之后， 18 516×g離心10 min，用LB肉湯洗滌沉淀2 次之后，將其倒入37 ℃預熱的LB肉湯培養(yǎng)基中，充分混勻重懸沉淀，迅速置于37 ℃、130 r/min的搖床上，每隔10 min取樣，18 516×g離心2 min，取上清液測定效價[22-23]。實驗重復3 次，每次設2 個平行。

1.3.6 電鏡觀察

采用磷鎢酸染色法[24]，輕取銅網(wǎng)，先浸沒于高效價噬菌體原液中10 min，之后用濾紙吸去多余液體。再將銅網(wǎng)置于2%的磷鎢酸染料中染色10 min，吸去多余液體，自然晾干至完全干燥。在透射電鏡100 kV下觀察噬菌體形態(tài)。

1.3.7 宿主譜測定

取噬菌體原液20 μL直接滴到已經(jīng)鋪好宿主的雙層平板上，待其晾干后，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～4 h，之后觀察是否有透亮噬菌斑產(chǎn)生。

1.3.8 噬菌體溫度穩(wěn)定性測定

將100 μL噬菌體原液109PFU/mL置于無菌EP管中，在40、50、60、70、80 ℃的水浴中，分別作用15、30、45、60 min，處理時間結束后，迅速取出樣品置于4 ℃冰箱，冷卻后測效價。實驗重復3 次，每次設2 個平行。

1.3.9 噬菌體pH值穩(wěn)定性測定

取100 μL噬菌體原液108PFU/mL于1.5 mL離心管中，分別加入900 μL不同pH值（2、3、4、5、6、7、8、9、10、11）的SM緩沖液中，40 ℃水浴2 h，處理時間結束后測定噬菌體效價。實驗重復3 次，每次設2 個平行。

1.3.10 噬菌體對宿主裂解效力的測定

噬菌體與宿主按照不同的MOI（10、100、1 000）各取100 μL加入96 孔板中。另設空白為200 μL的LB肉湯培養(yǎng)基；對照組為100 μL的宿主菌液與100 μL的LB肉湯。將其置于37 ℃、130 r/min溫育，每隔1 h測定其在600 nm波長處的吸光度，總共測定6 h。

1.3.11 噬菌體在牛乳與乳粉中對不同宿主殺菌效力測定

從超市購買脫脂乳粉和脫脂牛乳，按照包裝上的說明用無菌水溶解脫脂乳粉。參照Kim等[14]方法，在乳粉與牛乳樣品中加入對數(shù)增長期的2 種菌至終濃度為102CFU/mL，按照MOI為106加入噬菌體，同時在對照組中加入等量的無菌水。將樣品置于25 ℃與37 ℃、130 r/min溫育。每隔3 h取出等分試樣進行細菌計數(shù)（CFU/mL）。實驗重復2 次，每次設2 個平行。

1.3.12 噬菌體全基因組測序和分析

采用Illumina MiSeq測序平臺進行噬菌體全基因組測序。應用軟件SPAdes v3.9.0對原始測序數(shù)據(jù)進行從頭拼裝，構建scaffold和conting。使用GeneMarkS（http://exon.gatech.edu/GeneMark/）對全基因組序列進行基因預測。使用在線BLASTp工具進行蛋白編碼基因的功能注釋，并采用Easyfig軟件進行比對分析和繪圖。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制

數(shù)據(jù)采用SPSS顯著性差異分析方法（P＜0.05，差異顯著），運用Origin軟件進行繪圖與分析。

2 結果與分析

2.1 噬菌體分離與宿主范圍測定結果

表 1 噬菌體宿主范圍Table 1 Host ranges of phages isolated in this study

從河涌污水中利用阪崎腸桿菌為宿主分離出3 株噬菌體，分別命名為TBC-1、TBC-2、TBC-3。將3 種噬菌體進行宿主范圍測定，結果顯示TBC-1可以裂解所有9 株阪崎腸桿菌宿主菌（表1），TBC-3可以裂解其中7 株，TBC-2只能裂解其中5 株，證明TBC-1的宿主譜較為寬泛。因此選擇其進行深入研究。

2.2 TBC-1分離與純化

TBC-1經(jīng)過3 次分離純化后，在雙層平板上形成了規(guī)則透明、直徑約2～3 mm的透亮噬菌斑，如圖1A所示；其頭部呈二十面體，有一條可收縮性尾（圖1B）。根據(jù)國際病毒分類委員會（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）對噬菌體的分類判斷，此噬菌體屬于肌病毒科（Myoviridae），尾狀病毒屬。表2為噬菌體頭部及尾部尺寸。

圖 1 噬菌體噬菌斑（A）及電鏡形態(tài)（B）Fig. 1 Plaques (A) and transmission electron microscopic image (B) of phage TBC-1

表 2 噬菌體各部分尺寸及所屬病毒科Table 2 Morphology and dimensions of phage TBC-1 and its family

2.3 噬菌體基因組

將所提取的基因組用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI酶進行酶切，見圖2?；蚪M可被該限制性核酸內(nèi)切酶切成8 條帶，可推斷該噬菌體核酸組成為dsDNA。根據(jù)酶切條帶與DNA Marker的關系，初步估算該噬菌體基因組分子長度為50 kb。其確切的分子長度通過后續(xù)全基因組測序?qū)崿F(xiàn)。

圖 2 DNA酶切圖譜Fig. 2 Restriction enzyme digestion patterns of phage DNA

2.4 噬菌體最佳MOI及一步生長曲線分析

由圖3A可知，當MOI為0.001時，噬菌體感染宿主后產(chǎn)生的子代噬菌體滴度為6.48×109PFU/mL，是所測的8 個MOI中滴度最高的，因此可將0.001確定為最佳MOI。

圖 3 最佳MOI（A）及一步生長曲線（B）Fig. 3 Optimal MOI (A) and one-step growth curve (B)

由圖3B可知，在0～20 min，曲線保持平穩(wěn)，可判斷噬菌體潛伏期為20 min，在之后的20～70 min噬菌體效價急速增加，在70 min后，噬菌體效價逐步趨于穩(wěn)定，可判斷噬菌體爆發(fā)期為50 min。效價穩(wěn)定在1010PFU/mL左右，爆發(fā)量為100 PFU/cell。

2.5 噬菌體的溫度及pH值穩(wěn)定性分析

圖 4 噬菌體的溫度（A）及pH值（B）穩(wěn)定性Fig. 4 Thermal stability (A) and pH stability (B) of TBC-1

如圖4A所示，噬菌體在40、50 ℃溫育1 h效價基本維持穩(wěn)定狀態(tài)且仍然保持原有的活性。在60 ℃作用1 h內(nèi)，效價持續(xù)下降但未完全失活。在70 ℃作用15 min后，噬菌體效價下降到20 PFU/mL；30 min之后，噬菌體完全失活。在80 ℃作用15 min后，噬菌體已經(jīng)完全失活。說明高溫處理會嚴重影響噬菌體活性。如圖4B所示，噬菌體在pH值在4～10之間時，效價較穩(wěn)定，基本能保持原活性。當pH值高于10或低于4時，噬菌體效價下降，并且在pH值高于11且低于2時，噬菌體會完全失活。以上說明過酸過堿都會導致噬菌體活性降低，甚至失活。

2.6 不同MOI噬菌體對宿主裂解效力的影響

圖 5 不同MOI噬菌體裂解曲線Fig. 5 Lysis curves of TBC-1 at different MOIs

如圖5所示，與未加噬菌體的對照組相比，TBC-1在6 h內(nèi)不同的MOI值下均可以抑制阪崎腸桿菌的生長，MOI為1 000相比MOI為100、10的宿主生長較慢，因此抑制效果更好，表明噬菌體滴度的增加會使得其對宿主的抑制作用更強。

2.7 全基因組測序結果分析

噬菌體TBC-1的全基因組長度為85 313 bp，基因組為雙鏈DNA。GeneMarks基因預測結果顯示共有118 個開放閱讀框（open reading frame，ORF），全部ORF共含有74 532 bp堿基，平均GC含量為40.65%；采用tRNAscan-SE預測顯示有24 個tRNA。BLASTn分析結果可知TBC-1與Enterobacterphage phi 63 307（MG 589384.1）的基因同源性為98.06%。用Easyfig軟件將這2 種噬菌體進行比對，結果見圖6。

圖 6 TBC-1與phage phi 63 307全基因序列的比對Fig. 6 Comparison between the complete genome sequences of TBC-1 and phage phi 63 307

2.8 噬菌體TBC-1在牛乳與乳粉中對兩種阪崎腸桿菌的殺菌應用

噬菌體TBC-1抑制阪崎腸桿菌ATCC25944實驗中，脫脂液態(tài)牛乳環(huán)境下（圖7A），25 ℃時，對照組的阪崎腸桿菌在12 h內(nèi)呈現(xiàn)穩(wěn)步增殖。實驗組在培育3 h后菌量下降2（lg（CFU/mL））（檢出限以下），之后的9 h內(nèi)一直在檢出限以下，抑菌效果較好；37 ℃時，實驗組培育3 h后，菌量下降到檢出限以下，但在此之后宿主菌再生長，第12小時菌量增加到（4.42±0.02）（lg（CFU/mL）），相比于菌量持續(xù)增加的對照組降低了約4（lg（CFU/mL））。圖7B顯示，在脫脂乳粉樣品的殺滅宿主實驗中，25 ℃時，與對照組相比，實驗組的菌量在3 h之后一直處于檢出限以下，抑菌效果好。37 ℃時，對照組最終菌量達到（8.74±0.06）（lg（CFU/mL）），而實驗組的菌量持續(xù)緩慢增加，第12小時的菌量為（5.39±0.12）（lg（CFU/mL）），相比較對照組降低了約3（lg（CFU/mL））。

圖 7 噬菌體在不同乳制品、不同宿主及不同溫度下的裂解曲線Fig. 7 Lysis curves of the bacteriophage in different dairy products at different temperatures

TBC-1對ATCCBAA894的抑制實驗中，脫脂液態(tài)牛乳中（圖7C），在25 ℃與37 ℃時，對照組的阪崎腸桿菌在12 h內(nèi)持續(xù)增長。實驗組培育3 h后菌量下降到檢出限以下并在之后9 h內(nèi)保持在檢出限以下，抑菌效果好；在脫脂乳粉的抑菌實驗中，25 ℃時，實驗組培育3～12 h內(nèi)，菌量一直處于檢出限以下，有較好的抑制效果。37 ℃時，實驗組菌量持續(xù)緩慢增加，12 h的菌量為（5.65±0.07）（lg（CFU/mL）），比對照組降低約3（lg（CFU/mL））。

3 討論與結論

噬菌體作為一種裂解細菌病毒，具有較多優(yōu)勢：噬菌體可以在宿主所在地方進行繁殖[25]，并且具有高度特異性，只可以裂解特定菌株，因此它們對環(huán)境中的其他微生物群無害[26]，此外，噬菌體只有在宿主存在時才能存活，當所有宿主都被裂解后，噬菌體在體內(nèi)會自動被免疫系統(tǒng)清除[27]。噬菌體可以通過和其他噬菌體混合使用，借此擴大其裂解的宿主范圍[28]。并且，噬菌體可以隨細菌的進化而對自身進行修飾，使其具有裂解耐藥菌的能力[29]。本研究以ATCC25944阪崎腸桿菌菌株為指示菌，從污水中分離出1 株噬菌體。通過對噬菌斑形態(tài)、噬菌譜測定、熱穩(wěn)定性、pH值穩(wěn)定性、最佳MOI及一步生長曲線等對阪崎腸桿菌噬菌體TBC-1的生物學特性進行了研究，結果表明，分離的噬菌體TBC-1能形成2～3 mm的圓形透亮噬菌斑。該噬菌體頭部呈二十面體，具有可收縮尾部，符合肌尾病毒科的特征[30]。此外，該噬菌體的最佳MOI為0.001，在Kim等[14]研究中，分離的阪崎腸桿菌噬菌體的最佳MOI為1，證明本研究分離的噬菌體TBC-1具有更高的裂解效率。TBC-1在50 ℃作用1 h依舊保持高滴度，并且在pH 4～10之間保持原始滴度不變，因此該噬菌體具有較寬的溫度和酸堿度適用范圍，其耐酸堿能力和耐熱性可為其實際應用提供參考[31]。噬菌體的一步生長曲線可以反映其裂解能力，本研究中噬菌體潛伏期較短（20 min），爆發(fā)期適中（50 min），爆發(fā)量較高（100 PFU/cell），在短時間內(nèi)完成裂解過程，在實際中可用于快速地生產(chǎn)應用。該噬菌體對實驗室已有的不同株阪崎腸桿菌均有強裂解效果，是1 株寬宿主譜的噬菌體。在不同MOI下對宿主裂解效力的測定實驗中，無論是高MOI還是低MOI，TBC-1對宿主菌均顯示出有效的抑制作用，并且高MOI條件下的抑制效果更好。Goode等[32]研究不同MOI對殺滅雞皮中的沙門氏菌與彎曲腸桿菌的效果，結果發(fā)現(xiàn)高MOI會更快速地殺滅沙門氏菌。因此，在之后的應用實驗中可選用高MOI對宿主進行侵染。此外，由全基因序列比對圖可知，TBC-1與Enterobacterphage phi 63 307（MG 589384.1）的基因同源性較高，這兩株噬菌體可能為同種噬菌體。

本研究采用MOI為106的噬菌體在乳制品中殺菌效果進行評估。噬菌體應用于乳制品殺滅ATCC25944的實驗中，TBC-1在25 ℃時的殺滅宿主效果更好，這可能是因為37 ℃為阪崎腸桿菌的最適生長溫度，細菌增長快于25 ℃的生長速度，導致細菌生長速度快于噬菌體對宿主的裂解速度。由此可見，溫度是影響噬菌體殺菌效果的重要因素之一。Kim等[14]選用了噬菌體ESP732-1的MOI為107、108以及109進行阪崎腸桿菌污染的乳粉的殺菌實驗，分別在24 ℃與37 ℃進行溫育，在37 ℃也出現(xiàn)了宿主再生長的情況。在脫脂乳粉中，實驗組在25 ℃培育3 h以后已經(jīng)檢測不到宿主菌，然而與脫脂牛乳樣品中不同的是，在37 ℃條件下，實驗組阪崎腸桿菌在12 h之內(nèi)一直呈現(xiàn)增長趨勢，但是相比于對照組的宿主菌增長緩慢，最終實驗組的菌量比對照組少約3 個數(shù)量級。這可能是因為在乳粉中有影響噬菌體的殺菌效果的因素存在，由此可見，不同的食品基質(zhì)對噬菌體的殺菌效果也有影響。ATCCBAA894抑菌實驗中，與指示菌不同的是，在脫脂牛乳中，TBC-1在25 ℃與37 ℃抑菌效果相當，實驗組菌量在3 h以后均已經(jīng)在檢出限以下，由此可見，盡管ATCCBAA894不是指示菌，但TBC-1對其殺菌效果更好。此外，報道顯示通常阪崎腸桿菌在乳粉中的污染量均小于1 CFU/100 g[33]。本實驗中加入乳粉中的宿主菌終濃度為102CFU/mL，相當于113 636 CFU/g的污染量，其遠高于實際生產(chǎn)中的阪崎腸桿菌的污染量。

本研究顯示TBC-1作為一種天然抗菌劑，表現(xiàn)出較強的溫度穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，不僅在阪崎腸桿菌的高污染量下表現(xiàn)出較好的抑制作用，而且對非指示菌抑制效果也較好。因此可以用來控制乳制品中阪崎腸桿菌的污染，為該噬菌體作為抗菌劑的應用奠定實驗基礎。