彭 瀟，鄒文靜，邵清清，孫中貫，張立華，李賀賀，王雪山,*

（1.山東省石榴精深加工工程技術(shù)研究中心，山東省石榴資源綜合開發(fā)工程實驗室，棗莊學院食品科學與制藥工程學院，山東 棗莊 277160；2.北京工商大學 食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京 100048）

石榴（Punica granatum）是千屈菜科（Lythraceae）石榴屬（PunicaL.）落葉果樹，其飽含安石榴苷、花青苷和黃酮等多酚類抗氧化物質(zhì)以及人體必需的微量元素，是古老的保健水果，被譽為超級水果[1]。石榴液態(tài)發(fā)酵釀酒的深加工方式保留了石榴鮮果自然風味和營養(yǎng)成分的同時，增加了其抗氧化活性，是一種極具食療保健作用的果酒，有助于提升其經(jīng)濟和實用價值。因此，近年來石榴酒成為國內(nèi)外均頗為流行的新型果酒[2-3]。石榴酒的發(fā)酵工藝通常參考葡萄酒的發(fā)酵工藝，在采摘、運輸、破碎及榨汁等環(huán)節(jié)會帶入石榴表皮及環(huán)境中的多種酵母、霉菌及細菌等多種微生物都會進入石榴酒發(fā)酵過程中[4-5]。這些微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生多種代謝物質(zhì)，影響石榴酒的風味、安全及產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性。然而目前國內(nèi)外對石榴酒發(fā)酵過程中微生物的種群演替規(guī)律及其代謝特征均不清晰。

目前國內(nèi)外關(guān)于石榴酒的研究主要在研究其發(fā)酵工藝及風味等方面，如張寶善等[5]優(yōu)化了通過葡萄酒酵母發(fā)酵甜石榴及酸石榴的發(fā)酵工藝，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵溫度越高，發(fā)酵期越短，酒度越低，甲醇和雜醇油含量越高，并獲得了生產(chǎn)石榴發(fā)酵酒的適宜加工工藝和參數(shù)。蘭永麗[4]表明石榴酒發(fā)酵前后風味物質(zhì)圖譜發(fā)生極大改變，其中石榴酒風味物質(zhì)成分主要由醇類和酯類組成，其中辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙醇、3-甲基-1-丁醇、苯乙醇和3-甲基-1-丁酸酯含量最高，同時發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程中檸檬酸、草酸、蘋果酸、酒石酸和乳酸是其中最主要的有機酸。Andreu等[6]通過氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法比較石榴汁和石榴酒中風味物質(zhì)組分，發(fā)現(xiàn)辛酸乙酯是石榴酒中最主要的揮發(fā)性物質(zhì)，同時發(fā)現(xiàn)乙酸苯乙酯、苯乙醇等14 種化合物僅在發(fā)酵后的石榴酒中檢測到。而目前國內(nèi)外關(guān)于石榴酒釀造微生物的研究則多數(shù)通過可培養(yǎng)方法進行石榴酒釀酒酵母的分離、選育，或比較不同釀酒酵母進行石榴酒發(fā)酵的性能。如劉玉瓊等[7]以石榴樹葉、石榴皮及石榴園土壤為分離源，選育新疆石榴酒專用酵母。Berenguer等[8]比較3 株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）發(fā)酵石榴酒的性能，發(fā)現(xiàn)S. cerevisiaevar.bayanus能夠在營養(yǎng)缺乏條件下進行發(fā)酵。這些研究極大的推進了石榴酒發(fā)酵工藝的優(yōu)化，但是目前國內(nèi)外鮮見關(guān)于石榴酒發(fā)酵過程中土著微生物的研究，因此目前亟需解析石榴酒發(fā)酵過程中參與的微生物以及這些微生物在發(fā)酵過程中發(fā)揮的作用。

近年來，高通量測序已經(jīng)廣泛的應(yīng)用到腸道[9-10]、食品[11-13]等多種領(lǐng)域微生物的研究中，是研究發(fā)酵食品微生物的有力工具。本研究結(jié)合高通量測序及GC-MS解析石榴酒發(fā)酵過程中土著微生物種群演替規(guī)律及其對石榴酒風味成分的貢獻，以期為石榴酒發(fā)酵工藝優(yōu)化、提升產(chǎn)品品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石榴采購自山東省棗莊市嶧城區(qū)。

焦亞硫酸鉀 法國Sofralab公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 生工生物工程（上海）股份有限公司；L-薄荷醇 德國Sigma-Aldrich公司；土壤基因組提取試劑盒 美國Omega Bio-tek公司。

1.2 儀器與設(shè)備

手持糖度計 北京亞歐德鵬科技有限公司；智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司；高速冷凍離心機 德國Sigma-Aldrich公司；6890-5975 GC-MS儀美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 石榴酒發(fā)酵及樣品采集

將石榴對半剖開，戴手套剔除隔膜及石榴皮，去除霉爛籽粒和隔膜；將去皮后的籽粒加入壓榨機中進行壓榨得到石榴汁，將石榴汁經(jīng)無菌紗布過濾后備用。將2 L石榴汁加入3 L除菌玻璃發(fā)酵罐中，同時向石榴汁中加入60 mg/L的焦亞硫酸鉀，糖度調(diào)整至20 °Bx；然后將發(fā)酵罐置于22 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵8 d，將發(fā)酵罐轉(zhuǎn)移至10 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵17 d。

發(fā)酵第0、4、8、15、25天時從每個發(fā)酵罐中取50 mL石榴汁樣品，共設(shè)置3 個發(fā)酵罐作為平行對照，共取樣品15 份。

1.3.2 基因組提取及高通量測序

將10 mL石榴汁樣品于13 000×g離心后收集菌體，用無菌1 倍PBS溶液洗滌菌體1 次，然后將菌體按照土壤基因組提取試劑盒說明書進行宏基因組提取。將提取合格的DNA送北京奧維森基因科技有限公司進行高通量測序。選擇ITS3和ITS4引物擴增真菌ITS2區(qū)，測序平臺為MiSeq 300 bp雙端測序。測序原始數(shù)據(jù)下機后質(zhì)控及數(shù)據(jù)處理參考文獻[14]。

1.3.3 揮發(fā)性化合物檢測

取8 mL發(fā)酵液加入頂空瓶（20 mL，預先加入3 g NaCl）中，加入20 μLL-薄荷醇（100 μg/mL）為內(nèi)標，采用內(nèi)標法檢測揮發(fā)性化合物的含量。揮發(fā)性物質(zhì)采用GC-MS檢測，檢測條件參考文獻[15]方法。

1.4 統(tǒng)計分析

揮發(fā)性化合物半定量濃度數(shù)據(jù)通過ln（n+1）方式進行標準化處理。樣品真菌種群α多樣性指數(shù)利用Qiime將測序數(shù)據(jù)抽平至42 372讀數(shù)后計算；不同樣品多樣性差異顯著分析采用SPSS中t-test進行分析；不同樣品中風味物質(zhì)主成分分析（principal component analysis，PCA）及微生物非度量多維尺度分析（non-metric multidimensional scaling，NMDS）均采用R v.3.3.1（http://www.r-project.org）中Vegan程序包實現(xiàn)；不同微生物種群與代謝物之間時間相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)利用Eviews v.10.0中Granger因果關(guān)系算法計算[16]，并通過Gephi v.0.9.1實現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的可視化[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 石榴酒發(fā)酵過程中風味物質(zhì)變化規(guī)律

表 1 石榴酒發(fā)酵過程中揮發(fā)性化合物Table 1 Volatile organic compounds detected during pomegranate wine fermentation

續(xù)表1

通過GC-MS從15 個石榴發(fā)酵液樣品中共檢測到65 種揮發(fā)性化合物，包含11 種醇類、6 種酸類、28 種酯類、13 種芳香族物質(zhì)、4 種酮類和3 種含硫化合物（表1和圖1）。PCA顯示石榴酒中風味物質(zhì)隨著發(fā)酵時間呈現(xiàn)明顯的變化（圖2）。PC1可解釋發(fā)酵過程中風味物質(zhì)變化的60%，發(fā)酵前4 d在其中起主要作用。PC2僅解釋風味成分變化的12.3%，主要由發(fā)酵4～25 d引起。這表明發(fā)酵前4 d是石榴酒中風味物質(zhì)形成的最關(guān)鍵時期。

圖3顯示未發(fā)酵的石榴汁中共檢測到40 種物質(zhì)，主要包含乙酸異戊酯（348.34 μg/L）、乙酸乙酯（576.53 μg/L）及乙酸苯乙酯（209.43 μg/L）等物質(zhì)。其中乙酸乙酯（菠蘿香、蘋果香、水果香）也是Mollar de Elche石榴汁中的主要風味物質(zhì)，但是乙酸異戊酯（香蕉香、甜香、蘋果香、水果糖香）及乙酸苯乙酯（玫瑰花香、花香）在Mollar de Elche石榴汁中含量很低[6]。這可能是因為石榴品種差異導致其中風味物質(zhì)含量不同。然而隨著發(fā)酵過程的進行，正己醇、3-己烯-1-醇、乙酸異戊酯等物質(zhì)含量逐漸降低，其中蘑菇醇、乙酸甲酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、2,3-戊二酮、烯丙基甲基硫醚等12 種物質(zhì)僅能在未發(fā)酵石榴汁中能檢測到（圖1、3）。而異戊醇、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醇等物質(zhì)含量隨著發(fā)酵時間增加。

圖 1 石榴酒發(fā)酵過程中揮發(fā)性化合物含量變化Fig. 1 Changes in volatile organic compounds during pomegranate wine fermentation

發(fā)酵結(jié)束時，石榴酒樣品中共檢測到53 種揮發(fā)性化合物，其中異丁醇、草酸、月桂酸乙酯、癸酸異戊酯、乙烯基1-丁硫醚等25 種物質(zhì)僅在發(fā)酵結(jié)束的石榴酒中能檢測到（圖1、3）。這個現(xiàn)象與前人研究一致，同樣認為辛酸乙酯（梨子香、荔枝香、水果香、甜香、百合花香）、癸酸乙酯（菠蘿香、水果香、花香）、乙酸苯乙酯（玫瑰花香、花香）及苯乙醇（玫瑰花香、月季花香、花香、花粉香）等是石榴酒中的主要風味物質(zhì)[4,6]。這表明，發(fā)酵過程可以增加石榴酒風味成分及風味特征的多樣性，對石榴酒的風味特征形成起到至關(guān)重要的作用。

圖 2 石榴酒發(fā)酵過程中風味物質(zhì)PCAFig. 2 PCA plot of volatile organic compounds during pomegranate wine fermentation

圖 3 石榴酒發(fā)酵前后揮發(fā)性化合物種類Venn分析Fig. 3 Venn diagram showing unique and shared volatile organic compounds in pomegranate juice and wine

2.2 石榴酒發(fā)酵過程中真菌種群演替規(guī)律

通過高通量測序檢測石榴酒發(fā)酵樣品，共檢測到1 006 014 條高質(zhì)量序列，平均每個樣品67 068 條序列，其中序列最少的樣品含有42 372 條序列。稀釋曲線（圖4）顯示，在42 372 條序列水平下，每個樣品曲線都趨于平穩(wěn)，說明此測序深度能夠滿足分析石榴酒真菌種群的需要。

圖 4 石榴酒發(fā)酵過程中真菌種群測序稀釋曲線Fig. 4 Rarefaction curves from fungal community sequencing during pomegranate wine fermentation

多樣性指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵的進行，石榴酒中真菌種群多樣性呈現(xiàn)先降低，后升高的現(xiàn)象（表2）。其中發(fā)酵第4、8天時，樣品的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)均顯著低于未發(fā)酵時，而在發(fā)酵第15天后，樣品真菌種群多樣性呈回升趨勢。NMDS分析顯示石榴酒的發(fā)酵過程中可分為3 個階段，結(jié)果顯示0～4 d是真菌種群結(jié)構(gòu)變化最主要的階段，而4～8 d真菌種群結(jié)構(gòu)比較接近，發(fā)酵8 d之后種群結(jié)構(gòu)的變化，可能由于發(fā)酵溫度調(diào)整為10 ℃，微生物種群結(jié)構(gòu)發(fā)生了應(yīng)激調(diào)整（圖5）。

表 2 石榴酒發(fā)酵過程中真菌種群多樣性變化Table 2 Diversity indexes of fungal communities during pomegranate wine fermentation

圖 5 石榴酒發(fā)酵過程中真菌種群NMDSFig. 5 NMDS analysis of fungal communities during pomegranate wine fermentation

所有樣品中共檢測到58 個真菌屬，其中酵母屬（Saccharomyces）、有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、畢赤酵母屬（Pichia）、假絲酵母屬（Candida）及曲霉菌屬（Aspergillus）在所有樣品中平均相對豐度大于1%，是石榴酒發(fā)酵過程中的優(yōu)勢真菌種群（圖6）。有孢漢遜酵母屬是石榴汁中的主要酵母種群，占總真菌種群相對豐度的57.84%～60.13%，其次是酵母屬（7.02%～8.62%）、畢赤酵母屬（4.48%～6.37%）及假絲酵母屬（1.64%～1.94%）。以往研究曾在石榴皮、腐爛的石榴果實及石榴加工設(shè)備等區(qū)域檢測到這些菌株，說明石榴汁中的這些酵母及霉菌可能來自于石榴采集及加工過程中接觸到的這些環(huán)境[18-20]。發(fā)酵第4天時，發(fā)酵液中酵母屬相對豐度增加至94.17%～97.26%，其中最主要的OTU是釀酒酵母，其他非釀酒酵母及霉菌的相對豐度則顯著降低。這可能是3 個原因?qū)е碌模皇轻劸平湍概c其他微生物形成營養(yǎng)競爭，而釀酒酵母對營養(yǎng)的利用能力更強[21]；二是發(fā)酵過程中釀酒酵母代謝產(chǎn)生大量乙醇，而釀酒酵母比其他微生物對乙醇的耐受性更高[21]；三是釀酒酵母可分泌產(chǎn)生一種多肽抑制非釀酒酵母的生長[22]。同時，4～8 d時釀酒酵母是發(fā)酵體系中絕對優(yōu)勢菌種，其主要作用是產(chǎn)生乙醇，說明這一時期也是發(fā)酵過程中產(chǎn)醇的主要階段。發(fā)酵8 d之后，釀酒酵母相對豐度降低，非釀酒酵母相對豐度升高，這可能是由于8 d之后發(fā)酵溫度降為10 ℃。以往關(guān)于葡萄酒的研究表明，有孢漢遜酵母、畢赤酵母及假絲酵母等非釀酒酵母可代謝產(chǎn)生多種芳香族物質(zhì)及單萜類物質(zhì)，可增加葡萄酒的水果香氣[23]。而石榴酒發(fā)酵這一階段中這些非釀酒酵母豐度的增加同樣可能是石榴酒中芳香族化合物等風味物質(zhì)增加的主要原因（圖1），這同時也表明適度的低溫發(fā)酵有利于非釀酒酵母繁殖，有利于增加石榴酒的風味多樣性。

圖 6 石榴酒發(fā)酵過程中真菌種群演替Fig. 6 Fungal community succession during pomegranate wine fermentation

2.3 石榴酒發(fā)酵過程中真菌種群與風味化合物之間相關(guān)性分析

為了進一步研究發(fā)酵過程中真菌種群對石榴酒風味成分的貢獻，本研究應(yīng)用Granger因果關(guān)系法分析了主要真菌種群與風味物質(zhì)之間的時間相關(guān)性。Granger因果關(guān)系是經(jīng)濟學領(lǐng)域中的一種重要方法，可以利用時序性數(shù)據(jù)分析其中因果關(guān)系[24]。與Pearson相關(guān)性、Spearman相關(guān)性等分析不同的是，Granger因果分析具有方向性，因此近年來Granger因果關(guān)系逐漸被用于腸道微生態(tài)、水體微生態(tài)等研究中[16,25-26]。

石榴酒發(fā)酵過程中真菌種群是風味物質(zhì)的主要來源之一。異丁醇和異戊醇是石榴酒中主要的高級醇類物質(zhì)，又稱為雜醇油。一定量的高級醇可以增加酒的醇厚感，但是含量過高則會導致酒容易上頭。Chen等[27]研究表明，葡萄酒發(fā)酵過程中釀酒酵母會代謝產(chǎn)生大量異丁醇和異戊醇等高級醇。發(fā)酵過程中，釀酒酵母可以代謝亮氨酸等支鏈氨基酸產(chǎn)生異丁醇及異戊醇[28-29]。圖7表明，釀酒酵母與假絲酵母均與異丁醇和異戊醇呈現(xiàn)Granger因果關(guān)系。因此，本研究中異丁醇和異戊醇在發(fā)酵中后期大量產(chǎn)生，可能主要是由釀酒酵母代謝石榴汁中支鏈氨基酸產(chǎn)生的。乙酸乙酯及月桂酸乙酯是石榴酒中的主要酯類物質(zhì)，可以增加石榴酒的水果香及花香。Chen Jia等[30]研究顯示，山西陳醋中篩選出的畢赤酵母可以代謝產(chǎn)生乙酸乙酯、月桂酸乙酯等多種酯類物質(zhì)。同時，圖7顯示釀酒酵母、有孢漢遜酵母、畢赤酵母及假絲酵母對這兩種酯類均呈Granger因果關(guān)系。因此，推測石榴酒中乙酸乙酯及月桂酸乙酯代謝可能也與畢赤酵母有關(guān)。此外，圖7顯示發(fā)酵過程中的草酸、異丁酸、辛酸等酸類物質(zhì)同樣對發(fā)酵體系中的酵母種群有一定作用。

圖 7 真菌種群與揮發(fā)性風味化合物Granger因果關(guān)系分析Fig. 7 Granger causality between fungal communities and volatile flavor compounds

3 結(jié) 論

本研究應(yīng)用高通量測序系統(tǒng)解析了石榴酒發(fā)酵過程中真菌種群演替規(guī)律，發(fā)現(xiàn)酵母屬、有孢漢遜酵母屬、畢赤酵母屬、假絲酵母屬及曲霉菌屬是石榴酒發(fā)酵過程中的優(yōu)勢真菌種群。結(jié)合代謝組學及統(tǒng)計學手段表明這些微生物對石榴酒中異丁醇、異戊醇等高級醇類，乙酸乙酯、月桂酸乙酯等酯類物質(zhì)有較強貢獻。本研究為深入挖掘石榴酒功能微生物，提高石榴酒產(chǎn)品質(zhì)量及穩(wěn)定性提供理論基礎(chǔ)。