婁海偉，趙 玉，趙 逸，林俊芳,3,*，趙仁勇，葉志偉,3，郭麗瓊,3,*

（1.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；3.廣東省微生態(tài)制劑工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642）

蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris）是一種珍貴的食藥兩用真菌，含有多種生物活性成分，如蟲(chóng)草素[1]、免疫調(diào)節(jié)蛋白[2]、蟲(chóng)草多糖[3]、噴司他丁[4]等，使蛹蟲(chóng)草具有抗炎[5]、增強(qiáng)免疫[6]、抗腫瘤[7]、抗癌[8]等功效。2014年，蛹蟲(chóng)草被國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委批準(zhǔn)為新食品原料。這使得蛹蟲(chóng)草的應(yīng)用領(lǐng)域和市場(chǎng)前景更加廣闊。

類(lèi)胡蘿卜素作為一類(lèi)重要的萜類(lèi)色素，廣泛分布于光合細(xì)菌、真菌、植物和藻類(lèi)中[9]，具有抗氧化[10]、抗炎[11]、抗癌[12]、預(yù)防肥胖[13]等生理功能，是維持人體健康不可或缺的生物活性物質(zhì)。近年來(lái)，在蛹蟲(chóng)草中發(fā)現(xiàn)了新型的類(lèi)胡蘿卜素，該新型色素具有良好的親水性和抗氧化活性[14-16]，這亦使得蛹蟲(chóng)草的市場(chǎng)需求量逐年增多。但是，蛹蟲(chóng)草中新型類(lèi)胡蘿卜素的含量較低，不能滿足市場(chǎng)的需求，主要是因?yàn)槠渖锖铣赏緩轿粗锖铣上嚓P(guān)基因的研究報(bào)道較少[17]。前人的研究結(jié)果表明，培養(yǎng)基顯著影響蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素的生物合成[18-19]?；诖?，本研究旨在對(duì)不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的蛹蟲(chóng)草進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和生物信息學(xué)分析，挖掘蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素的生物合成相關(guān)基因，這將有利于揭示蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素的生物合成途徑，為通過(guò)生物技術(shù)方法提高蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素的產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

蛹蟲(chóng)草菌株CM10，4 ℃保存于PDA斜面培養(yǎng)基上。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖水（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、MgSO41.5 g、KH2PO43.0 g，自來(lái)水定容至1 000 mL。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：PDB培養(yǎng)基中加入20.0 g瓊脂，自來(lái)水定容至1 000 mL。

蛹蟲(chóng)草生長(zhǎng)所需培養(yǎng)基的最適碳氮比（C/N）為20∶1[20]，根據(jù)簡(jiǎn)錦輝[18]的研究結(jié)果，蛹蟲(chóng)草在（C/N為20∶1）培養(yǎng)基W上產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素的量較高，而在（C/N為41.78∶1）對(duì)照培養(yǎng)基R上產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素的量較低，且蛹蟲(chóng)草在上述2 種培養(yǎng)基上產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素的量差異顯著。因此，本研究選擇了培養(yǎng)基W和培養(yǎng)基R。

培養(yǎng)基W：小麥14.6 g、麩皮4.0 g、玉米1.4 g，粒度均為10 目，合計(jì)20.0 g放入一個(gè)直徑為9 cm的培養(yǎng)皿，加入25.0 mL營(yíng)養(yǎng)液W。營(yíng)養(yǎng)液W配方為：MgSO41.0 g、KH2PO41.0 g、VB140 mg，自來(lái)水定容至1 000 mL。

培養(yǎng)基R：大米20.0 g（粒度10 目）放入一個(gè)直徑9 cm的培養(yǎng)皿，加入25.0 mL營(yíng)養(yǎng)液R。營(yíng)養(yǎng)液R配方為：MgSO41.0 g、KH2PO41.0 g、VB140 mg、檸檬酸1.0 g、葡萄糖12.0 g、胰蛋白胨8.0 g，自來(lái)水定容至1 000 mL。

1.1.3 試劑

葡萄糖、MgSO4、KH2PO4、檸檬酸 廣州化學(xué)試劑廠；胰蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；VB1上海源葉生物科技有限公司；TRIzol試劑 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Fungal RNA Kit 北京Omega Bio-tek公司；TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR、TransStart Tip Green qPCR SuperMix 北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-70生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GXZ智能光照培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；YX-280手提式壓力蒸汽滅菌器 合肥華泰集團(tuán)股份有限公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；MQD-S2R振蕩培養(yǎng)箱 上海旻泉儀器有限公司；U410超低溫冰箱 德國(guó)Eppendorf公司；QuantStudio 3熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 菌絲制備和類(lèi)胡蘿卜素含量的測(cè)定

取4 ℃保存的斜面菌種CM10接種至PDA培養(yǎng)基上，25 ℃避光培養(yǎng)21 d，然后光照培養(yǎng)7 d，即得活化的蛹蟲(chóng)草菌種。在潔凈工作臺(tái)中把活化的菌種CM10用手術(shù)刀切成1 cm×1 cm大小的菌塊，每100 mL PDB培養(yǎng)基接種3 塊CM10菌塊，25 ℃避光振蕩培養(yǎng)（150 r/min）4 d，即得蛹蟲(chóng)草液體菌種。接種培養(yǎng)基W和培養(yǎng)基R，每個(gè)培養(yǎng)皿接種5 mL液體菌種，在相同培養(yǎng)條件（25 ℃避光培養(yǎng)10 d，然后25 ℃光照培養(yǎng)8 d）下培養(yǎng)，分別得到CM10_WL和CM10_RL菌絲樣品。每個(gè)樣品進(jìn)行6 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，采用液氮收集菌絲樣品，同一樣品的6 個(gè)重復(fù)樣混合，存放于-80 ℃超低溫冰箱中備用。取出一部分菌絲進(jìn)行冷凍干燥，根據(jù)Zhang Jiaojiao等[21]報(bào)道的方法測(cè)定凍干菌絲中類(lèi)胡蘿卜素的含量。

1.3.2 cDNA文庫(kù)構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

-80 ℃保存的樣品送至華大基因有限公司提取樣品的總RNA，根據(jù)NEB Next Ultra RNA Library Prep Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)構(gòu)建CM10_WL和CM10_RL樣品的cDNA文庫(kù)，然后采用Illumina HiSeq 4000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。原始測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控以除去低質(zhì)量的reads（接頭reads、未知堿基N含量大于5%的reads），最后得到clean data，已存儲(chǔ)于美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）的生物項(xiàng)目數(shù)據(jù)庫(kù)（BioProject）檢索號(hào)PRJNA541819。

1.3.3 基因組比對(duì)和差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEG）分析

使用HISAT軟件將每個(gè)樣品的clean reads與蛹蟲(chóng)草基因組序列（NCBI reference sequence: NZ_AEVU00000000.1）進(jìn)行比對(duì)[22-23]。以樣品CM10_RL作為對(duì)照樣品，與樣品CM10_WL進(jìn)行基因表達(dá)量的比較。將錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）≤0.001且差異倍數(shù)（fold change）≥2作為DEG的篩選標(biāo)準(zhǔn)，滿足此篩選標(biāo)準(zhǔn)的基因即為DEG。

1.3.4 DEG的功能注釋

將篩選到的所有DEG分別與NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（Non-redundant Protein Sequence Database，NR）、京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)、基因本體論（Gene Ontology，GO）數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，從而獲得與DEG對(duì)應(yīng)的蛋白功能分類(lèi)統(tǒng)計(jì)和功能注釋。

1.3.5 實(shí)時(shí)PCR（real-time PCR）分析

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性，隨機(jī)挑選4 個(gè)基因（CCM_05119、CCM_06728、CCM_07824、CCM_09155），采用real-time PCR檢測(cè)上述4 個(gè)基因在樣品CM10_RL和CM10_WL中的表達(dá)情況。采用Fungal RNA Kit提取總RNA，采用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal）試劑盒合成第1鏈cDNA。以tef1基因（GenBank: DQ070019）作為內(nèi)參基因[24-25]，real-time PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參見(jiàn)TransStart Tip Green qPCR SuperMix試劑盒說(shuō)明書(shū)，每個(gè)樣品進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。以CM10_RL作為對(duì)照樣品，采用2?ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[26]。所用引物見(jiàn)表1。

表 1 real-time PCR引物Table 1 Sequences of primers used for real-time PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲(chóng)草菌株的活化和液體菌種的制備

蛹蟲(chóng)草CM10菌株在PDA培養(yǎng)基上活化結(jié)果見(jiàn)圖1a，其菌絲為橙黃色，表明蛹蟲(chóng)草產(chǎn)橙黃色色素[27]。制備的液體菌種見(jiàn)圖1b，蛹蟲(chóng)草呈米粒狀的菌絲球，PDB培養(yǎng)基澄清，液體菌種具有蛹蟲(chóng)草特有的清香。

圖 1 蛹蟲(chóng)草CM10的活化菌種（a）和液體菌種（b）Fig. 1 C. militaris CM10 activated on PDA plate (a) and its cell suspension (b)

2.2 蛹蟲(chóng)草菌絲的制備

在相同培養(yǎng)條件下、不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)的蛹蟲(chóng)草菌絲樣品CM10_RL和CM10_WL見(jiàn)圖2，樣品間色澤表型差異顯著，樣品CM10_RL呈較淡的橙黃色，而樣品CM10_WL呈較深的橙紅色。

如圖3所示，樣品CM10_WL的類(lèi)胡蘿卜素含量顯著高于樣品CM10_RL的類(lèi)胡蘿卜素含量，表明培養(yǎng)基顯著影響蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素的產(chǎn)生[19,28]，這可能是由于培養(yǎng)基中C/N的差異引起的，C/N為20∶1的培養(yǎng)基W更適合蛹蟲(chóng)草產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素，而C/N偏離20∶1的培養(yǎng)基R（C/N為41.78∶1）不利于蛹蟲(chóng)草產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素，這與前人的研究結(jié)果一致[18,29]。這亦可能是導(dǎo)致樣品CM10_WL較CM10_RL的色澤更深的主要原因。

圖 3 蛹蟲(chóng)草菌絲中類(lèi)胡蘿卜素的含量Fig. 3 Contents of carotenoids in C. militaris mycelia

2.3 蛹蟲(chóng)草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和參考基因組比對(duì)

表 2 蛹蟲(chóng)草菌絲轉(zhuǎn)錄組測(cè)序統(tǒng)計(jì)Table 2 Transcriptomic sequencing statistics of C. militaris mycelia

由表2可知，樣品CM10_RL和CM10_WL分別獲得32 388 522 個(gè)和32 387 910 個(gè)raw reads，質(zhì)控后，樣品CM10_RL和CM10_WL分別獲得30 595 116 個(gè)和30 261 506 個(gè)clean reads，2 個(gè)樣品質(zhì)控后的堿基數(shù)均大于4.5 Gb，測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，能準(zhǔn)確反映堿基序列，Q20均大于97%，Q30均大于94%，測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量較高，可用于后續(xù)分析。

將質(zhì)控后的clean reads與參考基因組比對(duì)，樣品CM10_RL和CM10_WL的比對(duì)率分別為79.83%和79.94%，樣品間均勻的比對(duì)率表明樣品之間的數(shù)據(jù)具有可比性。同時(shí)，從樣品CM10_RL中檢測(cè)到8 923 個(gè)表達(dá)基因（包括8 786 個(gè)已知基因和137 個(gè)新基因），從樣品CM10_WL中檢測(cè)到8 807 個(gè)表達(dá)基因（包括8 670 個(gè)已知基因和137 個(gè)新基因），與已知報(bào)道的蛹蟲(chóng)草蛋白編碼基因數(shù)量9 684 個(gè)很接近[22]。

2.4 蛹蟲(chóng)草DEG檢測(cè)和功能注釋分析

以樣品CM10_RL作為對(duì)照樣品，檢測(cè)到樣品CM10_WL有936 個(gè)DEG，其中318 個(gè)基因上調(diào)表達(dá)和618 個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。

圖 4 DEG的GO富集柱狀圖Fig. 4 GO enrichment analysis of DEGs

由圖4可知，共有995 個(gè)DEG歸類(lèi)到生物過(guò)程（453 個(gè)DEG）、細(xì)胞成分（176 個(gè)DEG）、分子功能（366 個(gè)DEG）；在生物過(guò)程類(lèi)中，富集最多DEG的條目是代謝過(guò)程；在細(xì)胞組分類(lèi)中，富集最多DEG的條目是細(xì)胞膜；在分子功能類(lèi)中，富集最多DEG的條目是催化活性。因此，富集到“代謝過(guò)程”、“細(xì)胞膜”、“催化活性”條目中的DEG可能負(fù)責(zé)蛹蟲(chóng)草色素的生物合成。

不同的基因在不同的生物過(guò)程中常具有協(xié)同作用，KEGG通路富集分析有助于進(jìn)一步了解基因的生物學(xué)功能[30]。DEG的KEGG通路富集結(jié)果見(jiàn)圖5，圖中的圓點(diǎn)越大，說(shuō)明富集的DEG越多，Q值越小表明富集越顯著[31]。由圖5可以看出，“代謝途徑”富集的DEG最多，這些DEG可能是造成樣品CM10_WL產(chǎn)生更多類(lèi)胡蘿卜素的原因，此結(jié)果亦表明培養(yǎng)基對(duì)代謝途徑影響最大，與前人的研究結(jié)果一致[32]。

圖 5 DEG的KEGG pathway富集Fig. 5 KEGG pathway enrichment analysis of DEGs

2.5 蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素生物合成相關(guān)基因的挖掘

前人研究報(bào)道蛹蟲(chóng)草黃色素為類(lèi)胡蘿卜素[14,33]，因此本研究所得的所有轉(zhuǎn)錄本與KEGG通路數(shù)據(jù)庫(kù)中的類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑（map00906）進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛹蟲(chóng)草CCM_06728、CCM_09155基因與類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑相關(guān)，參與了由圓酵母素到鏈孢霉黃素的生物合成（圖6），圓酵母素在圓酵母素雙加氧酶（CCM_06728）的作用下生成β-阿樸-4?-胡蘿卜醛，β-阿樸-4?-胡蘿卜醛在胡蘿卜醛加氧酶（CCM_09155）的作用下生成鏈孢霉黃素。這2 個(gè)類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因（CCM_06728和CCM_09155）在樣品CM10_RL和CM10_WL中表達(dá)差異不顯著，這可能是因?yàn)樗鼈兊谋磉_(dá)不受培養(yǎng)基差異的影響。前人的研究結(jié)果表明，基因CCM_06728和CCM_09155的表達(dá)水平也不受光照因素的影響，而且這2 個(gè)基因分布在類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑的其中一個(gè)支路的末端，對(duì)整個(gè)類(lèi)胡蘿卜素生物途徑的影響較小[17]。

圖 6 蛹蟲(chóng)草CCM_06728和CCM_09155基因參與類(lèi)胡蘿卜素生物合成的途徑Fig. 6 CCM_06728 and CCM_09155 genes involved in carotenoid biosynthesis in C. militaris

類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑的第一步是異戊烯基焦磷酸和二甲基丙烯基焦磷酸在香葉基香葉基焦磷酸合成酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPPS）催化下生成香葉基香葉基焦磷酸（geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP）[34]，而香葉基香葉基焦磷酸合成酶基因GGPPS被認(rèn)為是蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑中的第1個(gè)關(guān)鍵酶基因[35]。蛹蟲(chóng)草GGPPS基因（CCM_03697、CCM_03059、CCM_06355）已被成功克隆，且基因CCM_03059被認(rèn)為參與蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素的生物合成[36]。但是基因CCM_03059在樣品CM10_RL和CM10_WL中的表達(dá)水平無(wú)顯著差異，這表明基因CCM_03059的表達(dá)不受培養(yǎng)基差異的影響，且GGPPS不是蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素生物合成過(guò)程中的限速酶。GGPP在八氫番茄紅素合成酶的作用下生成八氫番茄紅素，八氫番茄紅素在八氫番茄紅素脫氫酶的作用下生成番茄紅素，番茄紅素通過(guò)去飽和、環(huán)化、羥基化等反應(yīng)進(jìn)入類(lèi)胡蘿卜素生物合成的分支途徑。但是，在樣品CM10_RL和CM10_WL的轉(zhuǎn)錄組中均未發(fā)現(xiàn)八氫番茄紅素合成酶基因和八氫番茄紅素脫氫酶基因，前人亦采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究了蛹蟲(chóng)草的轉(zhuǎn)錄組，也未發(fā)現(xiàn)上述2 個(gè)關(guān)鍵酶基因[17,37]。有關(guān)蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑的研究，目前僅有一條假設(shè)的蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑，在這條假設(shè)的生物合成途徑中，基因CCM_00310、CCM_03203、CCM_03697、CCM_04994、CCM_05367、CCM_05380、CCM_06728、CCM_07659、CCM_07937、CCM_08582、CCM_09155被認(rèn)為參與蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素的生物合成，但是這11 個(gè)基因在樣品498L（光照條件下培養(yǎng)的菌絲）和498D（避光條件下培養(yǎng)的菌絲）中的表達(dá)水平無(wú)顯著差異[17]，而且這11 個(gè)基因在樣品CM10_RL和CM10_WL中的表達(dá)水平也無(wú)顯著差異，這表明上述11 個(gè)基因的表達(dá)水平不受光照因素和培養(yǎng)基差異的影響，因此上述11 個(gè)基因的功能有待鑒定。

由于蛹蟲(chóng)草含有新型的色素[14-15]，且被認(rèn)為與已知的粗糙脈孢菌中的類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑完全不同[37]，又基于類(lèi)胡蘿卜素屬于萜類(lèi)化合物，結(jié)合GO功能富集和KEGG通路富集分析，從DEG中挖掘到5 個(gè)參與萜類(lèi)生物合成的基因CCM_03738、CCM_06092、CCM_05423、CCM_08567、CCM_09041。相對(duì)于樣品CM10_RL，基因CCM_03738、CCM_06092、CCM_05423在樣品CM10_WL中上調(diào)表達(dá)，表明這3 個(gè)基因促進(jìn)蛹蟲(chóng)草色素的合成；而基因CCM_08567和CCM_09041在樣品CM10_WL中下調(diào)表達(dá)，表明這2 個(gè)基因抑制蛹蟲(chóng)草色素的合成?；駽CM_03738的注釋結(jié)果為4-羥基苯甲酸聚戊烯基轉(zhuǎn)移酶，該酶的功能是催化聚戊烯基二磷酸和4-羥基苯甲酸反應(yīng)生成4-羥基-3-聚戊烯基苯甲酸?；駽CM_06092的注釋結(jié)果為長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A合成酶，該酶的功能是催化長(zhǎng)鏈脂肪酸和輔酶A反應(yīng)生成長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A。基因CCM_05423的注釋結(jié)果為甲基丙二酰輔酶A合成酶，該酶的功能是催化生物素和阿樸-甲基丙二酰輔酶A反應(yīng)生成甲基丙二酰輔酶A?；駽CM_08567的注釋結(jié)果是雀稗靈合成酶，但該酶的催化反應(yīng)式未被注釋?zhuān)虼似浯呋δ苡写昏b定?；駽CM_09041的注釋結(jié)果是丙酰輔酶A合成酶，該酶的功能是催化丙酸和輔酶A反應(yīng)生成丙酰輔酶A。下一步，將鑒定上述5 個(gè)基因在蛹蟲(chóng)草中的功能。

2.6 real-time PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

由表3可知，基因CCM_05119和CCM_07824的FDR＜0.001，log2foldChange（CM10_WL/CM10_RL）≥1，即fold change（CM10_WL/CM10_RL）≥2，表明基因CCM_05119和CCM_07824顯著上調(diào)表達(dá)；而基因CCM_06728和CCM_09155的FDR＞0.001，log2foldChange（CM10_WL/CM10_RL）＜1，即fold change（CM10_WL/CM10_RL）＜2，表明基因CCM_06728和CCM_09155的表達(dá)水平在樣品CM10_RL和CM10_WL中無(wú)顯著差異。由表3中的real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，相對(duì)于樣品CM10_RL，基因CCM_05119和CCM_07824在樣品CM10_WL中的表達(dá)水平均大于2 倍，顯著上調(diào)表達(dá)，而基因CCM_06728和CCM_09155在2 種樣品中的表達(dá)水平差異不顯著。real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠。

表 3 real-time PCR檢測(cè)4 個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)水平Table 3 Relative expression levels of four genes measured by real-time PCR

3 討論與結(jié)論

不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的蛹蟲(chóng)草菌絲樣品（CM10_RL和CM10_WL）具有不同的顏色表型和不同的類(lèi)胡蘿卜素含量，樣品CM10_WL較樣品CM10_RL具有更深的色澤和更高的類(lèi)胡蘿卜素含量。在此基礎(chǔ)上，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)蛹蟲(chóng)草菌絲樣品CM10_RL和CM10_WL進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品CM10_RL和CM10_WL之間有936 個(gè)DEG（包括318 個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和618 個(gè)下調(diào)表達(dá)基因）；通過(guò)GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)在生物過(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能類(lèi)中富集最多DEG的條目分別是代謝過(guò)程、細(xì)胞膜、催化活性；通過(guò)KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)富集DEG最多的通路為代謝途徑；把本研究所有蛹蟲(chóng)草轉(zhuǎn)錄本與KEGG通路數(shù)據(jù)庫(kù)中的類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因CCM_06728和CCM_09155參與蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素的生物合成；基于類(lèi)胡蘿卜素屬于萜類(lèi)化合物，從DEG中篩選到5 個(gè)參與萜類(lèi)生物合成的基因（CCM_03738、CCM_06092、CCM_05423、CCM_08567、CCM_09041）。此外，real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠。

培養(yǎng)基對(duì)蛹蟲(chóng)草的生長(zhǎng)和代謝有顯著影響[19-20]。楊瑩等[38]研究了不同氮源培養(yǎng)基對(duì)蛹蟲(chóng)草生長(zhǎng)及類(lèi)胡蘿卜素含量的影響，發(fā)現(xiàn)不同氮源培養(yǎng)基顯著影響蛹蟲(chóng)草的菌落形態(tài)、菌絲生長(zhǎng)速度、分生孢子產(chǎn)量和類(lèi)胡蘿卜素含量。Guo Mingmin等[19]以小麥和蛹作為培養(yǎng)基栽培蛹蟲(chóng)草，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基顯著影響蛹蟲(chóng)草中的蟲(chóng)草素、腺苷、多糖、甘露醇、類(lèi)胡蘿卜素的含量及超氧化物歧化酶的活性。宋仙妹等[20]發(fā)現(xiàn)蛹蟲(chóng)草生長(zhǎng)所需的最適C/N為20∶1，簡(jiǎn)錦輝[18]在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了培養(yǎng)基的優(yōu)化，獲得了適用于蛹蟲(chóng)草產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素的培養(yǎng)基，因此本實(shí)驗(yàn)采用其所優(yōu)化的培養(yǎng)基。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，蛹蟲(chóng)草在培養(yǎng)基W上產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素的量顯著高于在培養(yǎng)基R上產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素的量，證明了培養(yǎng)基顯著影響蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素的生物合成。

蛹蟲(chóng)草中新型類(lèi)胡蘿卜素的發(fā)現(xiàn)[14]，使其成為研究的熱點(diǎn)。蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素的含量被推薦作為衡量其商品價(jià)值的一個(gè)重要質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[33]，因此提高蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素的含量將有利于提高其商品價(jià)值。通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件可提高蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素的含量[28-29]，但提高量有限，不能從根本上解決蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素含量低的問(wèn)題，因此挖掘蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素的生物合成相關(guān)基因、闡明蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素的生物合成途徑是亟待解決的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)把蛹蟲(chóng)草樣品CM10_RL和CM10_WL的所有轉(zhuǎn)錄本與KEGG通路數(shù)據(jù)庫(kù)中的類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑（map00906）進(jìn)行比對(duì)，僅比對(duì)出2 個(gè)基因（CCM_06728和CCM_09155）參與蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素的生物合成，這表明蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素的生物合成途徑比較獨(dú)特，與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑（map00906）有較大差異，這可能是因?yàn)橛枷x(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素是新型的類(lèi)胡蘿卜素，其生物合成途徑可能是新的生物合成途徑。由于蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素是新型的類(lèi)胡蘿卜素，又基于類(lèi)胡蘿卜素屬于萜類(lèi)化合物，所以從DEG中挖掘到5 個(gè)參與萜類(lèi)生物合成的基因（CCM_03738、CCM_06092、CCM_05423、CCM_08567、CCM_09041），這5 個(gè)基因可能參與蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素的生物合成。因此，為了揭示蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素的生物合成途徑，將通過(guò)基因敲除、基因超表達(dá)、代謝組檢測(cè)等技術(shù)鑒定上述7 個(gè)基因（CCM_06728、CCM_09155、CCM_03738、CCM_06092、CCM_05423、CCM_08567、CCM_09041）的功能。

本實(shí)驗(yàn)研究不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的蛹蟲(chóng)草菌絲（CM10_RL和CM10_WL）的轉(zhuǎn)錄組差異，證實(shí)了培養(yǎng)基能夠顯著影響蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素的生物合成，獲得了蛹蟲(chóng)草菌絲樣品CM10_RL和CM10_WL之間的DEG，挖掘到7 個(gè)（CCM_06728、CCM_09155、CCM_03738、CCM_06092、CCM_05423、CCM_08567、CCM_09041）可能參與蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素生物合成的基因，這些研究結(jié)果為揭示蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素的生物合成途徑提供一定的參考依據(jù)。