楊 蒙，薛正蓮,2,*，甘玉飛，周 杰，王 洲,2，劉 艷,2

（1.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000；2.微生物發(fā)酵安徽省工程研究中心，安徽 蕪湖 241000）

磷脂酶A1（phospholipase A1，PlaA1）在食品、醫(yī)療、紡織等行業(yè)用途十分廣泛，其主要用途為植物的油脂脫膠[1]。PlaA1將植物粗油中存在的磷脂雜質(zhì)進(jìn)行酶解，生成游離脂肪酸和親水性溶血磷脂，以提高后期油脂存儲(chǔ)的穩(wěn)定性[2]。目前，關(guān)于PlaA1的研究，主要集中于對其本身進(jìn)行分子改造[3-7]和發(fā)酵工藝條件優(yōu)化[8]以提高PlaA1的催化活性。Jae[9]、Fu Jianhong[10]和蘇燕南[11]等從沙雷氏菌中發(fā)現(xiàn)編碼PlaA1的基因下游存在一段與plaA1基因重疊5 bp的輔助蛋白基因plaS，該基因能編碼蛋白質(zhì)但無酶活性，將PlaA1與磷脂酶A1輔助蛋白（phospholipase A1 accessory protein，PlaS）共表達(dá)基因plaB克隆在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，胞外會(huì)產(chǎn)生有活性的PlaA1，但是單獨(dú)表達(dá)PlaA1時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量沒有PlaA1活性的包涵體，表明plaS對PlaA1的胞外表達(dá)具有調(diào)控作用。

對PlaS進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，PlaS屬于錨蛋白（Ankyrin，ANK）家族中的ANK2家族，根據(jù)GenBank（Protein-ID：AFN44705.1）數(shù)據(jù)分析，其蛋白結(jié)構(gòu)是由N端、ANK區(qū)域和C端三部分區(qū)域組成，其中ANK區(qū)域包含4 個(gè)典型的ANK重復(fù)序列（ANK reapeat）。ANK是一種胞內(nèi)連接蛋白，為單鏈多肽，通常由若干個(gè)ANK repeat串聯(lián)而成，每一個(gè)ANK repeat包含30～33 個(gè)氨基酸，組成β2α2的“L”型結(jié)構(gòu)[12]，可以介導(dǎo)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用[13]。在許多生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)中都發(fā)現(xiàn)了ANK repeat，其功能包括細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[14]、維持細(xì)胞骨架的完整性、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[15-16]、炎癥反應(yīng)[17]、發(fā)育[18]和各種轉(zhuǎn)運(yùn)作用[19-21]等。這些ANK repeat模塊通常形成一個(gè)由重復(fù)次數(shù)決定的形狀大小不同的細(xì)長表面。一個(gè)孤立的ANK repeat是無法行使其功能的，它必須與另一個(gè)ANK repeat相連接，其編碼的肽鏈才能產(chǎn)生正常的折疊[22]。也就是說ANK repeat串聯(lián)的個(gè)數(shù)對介導(dǎo)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用影響較大。

基因剪接技術(shù)已經(jīng)成為分子截短的重要研究手段。為了揭示PlaS對PlaA1的調(diào)控機(jī)制，朱昊等[23]將PlaS的N端區(qū)域的前35 個(gè)氨基酸截掉之后，與PlaA1進(jìn)行共表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其胞外酶活與未截短菌株相較有顯著增加，截短后的蛋白dPlaS的蛋白表達(dá)量也顯著增加。Zhang Bin等[24]曾對p16INK4分別進(jìn)行了C端和N端的截短，其研究表明C端2 個(gè)重復(fù)序列可以自主形成折疊結(jié)構(gòu)，而N端的2 個(gè)重復(fù)序列是孤立無序的，這表明這2 個(gè)區(qū)域在本質(zhì)上具有不同的穩(wěn)定性。

為進(jìn)一步探究PlaS對PlaA1酶活的關(guān)鍵作用區(qū)域，本研究從PlaA1和PlaS共表達(dá)基因plaB的C端處開始剪接，并對截短菌株進(jìn)行了胞外酶學(xué)性質(zhì)研究，為后期闡明PlaS對PlaA1胞外酶活的調(diào)節(jié)機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與試劑

BP28工程菌，攜帶plaB基因（GenBank Accession No.JX138536.1），由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；plaB基因來源于黏質(zhì)沙雷氏菌PL-06，其含有編碼PlaA1的基因plaA1與輔助蛋白基因plaS；BL21（DE3），JM109分別作為PlaA1及其截短基因的表達(dá)載體和克隆載體；選擇質(zhì)粒pET-28a（+）作為基因載體。

磷酸氫二鈉、檸檬酸、磷酸二氫鈉、甘氨酸、氫氧化鈉國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，蒸餾水定容到1 000 mL，調(diào)pH值至7.0。

PLB固體培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基84.5 mL，10%卵磷脂10 mL，0.01%溴甲酚紫3 mL，1 mol/L CaCl22.5 mL，瓊脂粉2 g；TB培養(yǎng)基：胰蛋白胨12 g，酵母粉24 g，磷酸二氫鉀2.31 g，磷酸氫二鉀9.85 g，3%甘油，蒸餾水定容到1 000 mL。以上培養(yǎng)基均在121 ℃，滅菌20 min，培養(yǎng)基中的卵磷脂、氯化鈣和溴甲酚紫需分開滅菌后混合使用。

乳糖自誘導(dǎo)培養(yǎng)基：酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，乳糖5 g，磷酸氫二鈉0.025 mol/L，磷酸二氫鈉0.025 mol/L，硫酸鎂1 mmol，甘氨酸7.5 g，葡萄糖0.8 g，蒸餾水定容至1 000 mL，115 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

EL20 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；冷凍高速離心機(jī) 賽默飛世爾公司；DYCP-31D水平電泳槽 北京六一儀器廠；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；凝膠成像系統(tǒng) 美國Syngene公司；基因?qū)雰x 寧波新芝生物科技股份有限公司；PCR儀 美國Bio-Rad公司；常壓室溫等離子體育種機(jī) 北京思清源物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 截短突變體的設(shè)計(jì)

將GenBank上公布的黏質(zhì)沙雷氏菌PL-06 PlaA1輔助蛋白PlaS的氨基酸序列（Protein-ID：AFN44705.1）在NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行在線分析。根據(jù)輔助蛋白的氨基酸序列的分析結(jié)果，設(shè)計(jì)輔助蛋白截短突變體。

1.3.2 截短基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建

本研究利用實(shí)驗(yàn)室先前構(gòu)建的一株產(chǎn)PlaA1工程菌BP28，在含δ50卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)工程菌BP28，于37 ℃搖床充分振蕩培養(yǎng)12～16 h。按照SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒進(jìn)行制備質(zhì)粒DNA樣品。

以pET-28a（+）-plaB質(zhì)粒為模板，根據(jù)表1的引物，用Taq酶進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，擴(kuò)增34 個(gè)循環(huán)，條件如表2所示。對擴(kuò)增后的片段進(jìn)行膠回收，BamHI、HindIII雙酶切之后利用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化，純化后的樣品分別與pET-28a（+）載體連接，并轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中。在PLB平板中挑取陽性菌株送入南京金絲瑞公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。

表 1 截短突變體引物設(shè)計(jì)Table 1 Primer sequences used for truncated mutants

表 2 截短突變體的PCR擴(kuò)增條件Table 2 PCR amplification conditions of truncated mutants

1.3.3 胞外粗酶液的制備

分別從PLB平板上挑取陽性轉(zhuǎn)化子，接種到含有δ50卡那霉素的5 mL LB試管中，37 ℃、200 r/min搖床過夜培養(yǎng)，活化后按1%接種量接入含有δ50卡那霉素的100 mL乳糖自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)8 h。將發(fā)酵終點(diǎn)后的發(fā)酵液于12 000 r/min、4 ℃離心2 min，上清液即為胞外粗酶液。由于各菌中的PlaA1蛋白表達(dá)量較低，表達(dá)水平無法計(jì)算，蛋白純化較為困難，因此后續(xù)采用胞外粗酶液進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的研究。

1.3.4 截短菌株酶活測定

1.3.4.1 酶活測定

參考文獻(xiàn)[25]方法，PlaA1酶活力定義為：在45 ℃條件下，每分鐘水解卵磷脂產(chǎn)生1 μmol游離脂肪酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。比酶活定義為每毫克蛋白所含PlaA1的含量。蛋白含量的測定采用Bradford定量法，并繪制出蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。將胞外酶液與考馬斯亮藍(lán)溶液反應(yīng)后在595 nm波長處測得吸光度，根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可得蛋白含量，再根據(jù)酶活大小，計(jì)算比酶活。

1.3.4.2 截短菌株透明圈的測定

將滅過菌的牙簽，分別蘸取各突變菌株于PLB平板上，將其放置37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～16 h，待長出單菌落，再將其放置4 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行低溫培養(yǎng)3～4 d，可觀察到PLB平板上產(chǎn)生不同大小的透明圈，用游標(biāo)卡尺測各菌落及其透明圈的直徑。

1.3.5 截短菌株酶學(xué)性質(zhì)的研究

1.3.5.1 溫度對各截短菌株酶促反應(yīng)的影響

根據(jù)PlaA1酶活測定方法，保持其他酶促反應(yīng)條件不變，考察酶促反應(yīng)溫度對各突變菌株酶活力的影響，確定各突變菌株P(guān)laA1的最適溫度。以出發(fā)菌株BP28所產(chǎn)PlaA1在最適反應(yīng)溫度下的酶活力定義為100%，計(jì)算其他樣品的相對酶活力。

將各截短菌株的PlaA1粗酶液置于最適溫度下進(jìn)行水浴保溫處理，然后進(jìn)行測定其殘余的酶活力。在保持其他條件相同的情況下，將未經(jīng)過保溫處理的酶活力定義為100%計(jì)算相對酶活力。

1.3.5.2 pH值對各截短菌株酶促反應(yīng)的影響

酶活測定方法同1.3.4節(jié)，保持其他酶促反應(yīng)條件不變，考察pH值對各突變菌株酶活力的影響，確定各突變菌株P(guān)laA1的最適pH值。以出發(fā)菌株BP28所產(chǎn)PlaA1在最適反應(yīng)pH值下的酶活力定義為100%，計(jì)算其他pH值的樣品相對酶活力。

將各截短菌株P(guān)laA1粗酶液置于不同pH值下進(jìn)行水浴保溫處理，然后迅速放置最適pH值下進(jìn)行測定其殘余的酶活力。在保持其他條件相同的情況下，將未經(jīng)過酸堿處理的酶活力定義為100%計(jì)算相對酶活力。

1.3.5.3 動(dòng)力學(xué)參數(shù)

以卵磷脂為底物，按照4%、6%、8%、10%的底物濃度，在pH 6、45 ℃條件下反應(yīng)15 min，按照1.3.4節(jié)方法測定比酶活；反應(yīng)速率V為比酶活與反應(yīng)時(shí)間的比值，以反應(yīng)速率和底物濃度S的倒數(shù)為坐標(biāo)，根據(jù)Lineweaver-Burk作圖法分別計(jì)算Km和Vmax。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與圖標(biāo)繪制

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，Origin軟件進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 截短突變體的設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI網(wǎng)站對PlaS進(jìn)行BLAST在線比對的結(jié)果顯示，PlaS屬于ANK超家族，且含有4 個(gè)典型的ANK repeat，分別在PlaS氨基酸序列的46～76、78～109、111～142、145～176位置處。PlaS二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊以及無規(guī)卷曲組成，其中α-螺旋占比高達(dá)54.86%，無規(guī)卷曲占比達(dá)到34.24%。每一個(gè)ANK repeat都包含著2 個(gè)α-螺旋和2 個(gè)β-折疊，內(nèi)部形成高度疏水區(qū)域。為探討PlaS對PlaA1酶活的關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域，將其編碼基因進(jìn)行截短，圖1為截短基因線性示意圖。

圖 1 plaA1與plaS截短基因的線性示意圖Fig. 1 Linear diagram of truncation of plaA1 and plaS

2.2 重組子的構(gòu)建

以pET-28a-plaB質(zhì)粒為模板，利用PCR技術(shù)對截短基因片段進(jìn)行大量擴(kuò)增，并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。從瓊脂糖凝膠電泳條帶（圖2）表明，與截短目的基因相符。

圖 2 各截短基因的PCR電泳檢測圖Fig. 2 Electrophoresis patterns of PCR amplified truncated genes

從PLB平板上分別挑取陽性克隆子，接種到含有δ50卡那霉素的5 mL LB試管中，37 ℃、200 r/min搖床過夜培養(yǎng)，按照SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒進(jìn)行制備質(zhì)粒DNA樣品。將陽性菌株送去南京金絲瑞公司進(jìn)行測序，通過軟件DNAMAN進(jìn)行序列比對，序列一致。將其分別進(jìn)行保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 各截短菌株胞外酶活的分析

為研究plaS的截短基因?qū)laA1胞外酶活的影響，對各突變菌株所產(chǎn)透明圈進(jìn)行圈徑比的計(jì)算。由于未截短菌株BP28與各截短突變菌株均含有plaA1基因，PlaA1可水解PLB平板上的大豆卵磷脂，在溴甲酚紫的作用下，可產(chǎn)生透明圈如圖3所示，圈徑比的大小表示各菌株胞外酶活的高低如表3所示。結(jié)合圖4各菌比酶活數(shù)據(jù)來看，當(dāng)PlaS的C端區(qū)域缺失，ANK結(jié)構(gòu)域保存3～4 個(gè)ANK repeat序列時(shí)，截短菌株AN-3與AN-4所產(chǎn)的PlaA1胞外比酶活分別為105.46 U/mg和108.16 U/mg，表現(xiàn)為胞外促進(jìn)，達(dá)顯著水平（P＜0.05），與未截短菌株BP28 PlaA1胞外比酶活（60.88 U/mg）相比分別高了73%和78%。當(dāng)ANK repeat的個(gè)數(shù)繼續(xù)減少時(shí)，PlaA1胞外比酶活開始顯著降低，截短菌株AN-1、AN-2 PlaA1胞外比酶活分別為59.31、60.74 U/mg，當(dāng)PlaS的ANK結(jié)構(gòu)域完全缺失時(shí)，截短菌株AN PlaA1胞外比酶活為57.19 U/mg，與截短菌株AN-1、AN-2 PlaA1的胞外比酶活并無顯著差異。同時(shí)各菌株的胞內(nèi)比酶活表現(xiàn)出無顯著差異。從胞外比酶活的數(shù)據(jù)來看，在PlaS中ANK結(jié)構(gòu)域至少需要3 個(gè)ANK reapeat串聯(lián)才會(huì)對PlaA1酶活表現(xiàn)為胞外促進(jìn)作用。

圖 3 各截短菌株在PLB平板上的菌落圖Fig. 3 Colony morphology of each truncated strain on PLB plate

表 3 各截短菌株透明圈的圈徑值Table 3 Ratio of the diameter of the transparent circle to the diameter of each truncated strain

圖 4 各截短菌株在胞內(nèi)與胞外的比酶活Fig. 4 Intracellular and extracellular specific enzymatic activity of each truncated strain

2.4 各截短菌株的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.4.1 溫度對各截短菌株P(guān)laA1酶活的影響

圖 5 溫度對各截短菌株P(guān)laA1活性與耐熱性的影響Fig. 5 Effect of temperature on the PlaA1 activity and heat resistance of each truncated strain

在最適溫度45 ℃條件下，以未截短菌株BP28的PlaA1酶活定義為100%計(jì)算相對酶活力，截短菌株AN、AN-1、AN-2、AN-3、AN-4的PlaA1相對酶活力分別為85.29%、84.80%、87.25%、110.29%、122.06%（圖5a）。結(jié)合圖5b可知，在45 ℃條件下，雖然突變菌AN-3、AN-4所產(chǎn)PlaA1的相對酶活力表現(xiàn)最高，但是其熱穩(wěn)定性也表現(xiàn)最差，推測PlaS的C端部分可維持PlaA1的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。當(dāng)PlaS的ANK repeat被繼續(xù)截短時(shí)，AN、AN-1、AN-2所產(chǎn)PlaA1的相對酶活力有所下降，可能因?yàn)閜laS的過度剪截在一定程度上破壞了輔助蛋白的結(jié)構(gòu)。

2.4.2 pH值對各截短菌株P(guān)laA1酶活的影響

如圖6a所示，截短菌株AN-3、AN-4所產(chǎn)生的PlaA1的最適pH值與BP28的相同，最適pH值均為6。而截短菌株AN、AN-1、AN-2的最適pH值發(fā)生了酸性偏移，最適pH值為5，說明輔助蛋白對PlaA1的酸堿性進(jìn)行了一定程度的調(diào)控。由圖6b可知，當(dāng)反應(yīng)體系的pH 3～5時(shí)，各突變株的PlaA1活性呈現(xiàn)上升趨勢。各突變株在pH值在5～8的條件下均表現(xiàn)為較好的穩(wěn)定性。

圖 6 pH值對各截短菌株P(guān)laA1活性（a）及穩(wěn)定性（b）的影響Fig. 6 Effect of pH on the PlaA1 activity (a) and stability (b) of each truncated strain

2.4.3 各截短菌株P(guān)laA1酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測定

圖 7 雙倒數(shù)法測定各截短菌株P(guān)laA1的米氏常數(shù)Fig. 7 Lineweaver-Burk plot for Km determination of PlaA1 from each truncated strain

表 4 各截短菌株P(guān)laA1的酶動(dòng)力學(xué)方程Table 4 Enzymatic kinetic equation of PlaA1 from each truncated strain

表 5 各截短菌株P(guān)laA1的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 5 Kinetic parameters of PlaA1 from each truncated strain

雙倒數(shù)法確定各截短菌株P(guān)laA1的米氏常數(shù)及酶動(dòng)力學(xué)見圖7、表4。根據(jù)所得到的各截短菌株的動(dòng)力學(xué)參數(shù)（表5）來看，截短菌株AN-3與AN-4所產(chǎn)PlaA1的Km值與BP28的相比分別降低了1.37 倍和1.45 倍，催化效率（Kcat/Km）分別提高了216%和211%，表明PlaS的C端及ANK結(jié)構(gòu)域一個(gè)ANK repeat被剪截后導(dǎo)致PlaA1空間構(gòu)象發(fā)生改變，使得PlaA1與底物的親和力增強(qiáng)，表現(xiàn)出更高的催化效率和酶活力。同時(shí)可看出在所有的截短菌株中AN菌株酶的Kcat/Km最小，其催化效率最低，進(jìn)一步表明ANK repeat的個(gè)數(shù)決定著ANK結(jié)構(gòu)域的功能，對于調(diào)節(jié)PlaA1的胞外酶活起著重要作用。

3 討論與結(jié)論

通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，PlaS屬于ANK2家族。在TMHMM網(wǎng)站中預(yù)測PlaA1和PlaS的跨膜結(jié)構(gòu)圖中得到PlaA1是無跨膜螺旋結(jié)構(gòu)的，而PlaS在其N端區(qū)7～27 aa有一個(gè)跨膜螺旋。PlaA1的胞外分泌可能是由于PlaS具有胞外運(yùn)輸?shù)墓δ?。遺憾的是，PlaS與PlaA1獲得共表達(dá)時(shí)雖酶活較高，但是胞外蛋白表達(dá)量相對較低，在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）圖上幾乎看不到PlaS條帶。朱昊[26]構(gòu)建出PlaA1輔助蛋白N端截短菌株，得到了分離純化后N端截短的輔助蛋白dPlaS，將其與PlaA1分別進(jìn)行了酵母雙雜交體內(nèi)互作和Biacore體外互作實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了兩者均存在相互作用，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)N端截短之后的輔助蛋白PlaS可以在SDS-PAGE蛋白電泳圖上觀察到清晰的條帶。柏錫等[27]通過生物信息學(xué)的方法對大豆中GmANKTM家族受非生物脅迫的研究報(bào)告中提到ANKTM家族中含ANK基序和跨膜結(jié)構(gòu)域，并對大豆中ANKTM家族中62 個(gè)基因進(jìn)行了鑒定與分類，在ANKTM家族中蛋白含數(shù)量不等的ANK repeat，其對靶蛋白的結(jié)合能力也有所不同。由于ANK特殊的蛋白結(jié)構(gòu)，在生物醫(yī)學(xué)研究中，ANK蛋白結(jié)合靶蛋白的特異性可設(shè)計(jì)成小型支架蛋白以起到靶向治療的作用[28-30]。目前人們對ANK在原核生物中的生理作用知之甚少，一些細(xì)菌的ANK蛋白在微生物的作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)對PlaS與PlaA1共表達(dá)基因plaB進(jìn)行剪接，構(gòu)建出一系列截短突變菌株，并分別測出各截短菌株胞外粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)，其中截短菌株AN-3與AN-4所產(chǎn)PlaA1酶活表現(xiàn)為胞外促進(jìn)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PlaS中的ANK結(jié)構(gòu)域至少需要3 個(gè)ANK reapeat才會(huì)對PlaA1酶活表現(xiàn)為胞外促進(jìn)作用，同時(shí)PlaS的C端域?qū)τ诰S持PlaA1的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性起到重要的作用。同時(shí)也說明了ANK reapeat的數(shù)目對于維持ANK結(jié)構(gòu)域的功能發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，為后期深入研究PlaS對促進(jìn)PlaA1胞外分泌機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)。