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        輔助蛋白基因的剪接對磷脂酶A1酶活的影響

        2021-03-31 02:01:08薛正蓮甘玉飛
        食品科學(xué) 2021年6期

        楊 蒙,薛正蓮,2,*,甘玉飛,周 杰,王 洲,2,劉 艷,2

        (1.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽 蕪湖 241000;2.微生物發(fā)酵安徽省工程研究中心,安徽 蕪湖 241000)

        磷脂酶A1(phospholipase A1,PlaA1)在食品、醫(yī)療、紡織等行業(yè)用途十分廣泛,其主要用途為植物的油脂脫膠[1]。PlaA1將植物粗油中存在的磷脂雜質(zhì)進(jìn)行酶解,生成游離脂肪酸和親水性溶血磷脂,以提高后期油脂存儲(chǔ)的穩(wěn)定性[2]。目前,關(guān)于PlaA1的研究,主要集中于對其本身進(jìn)行分子改造[3-7]和發(fā)酵工藝條件優(yōu)化[8]以提高PlaA1的催化活性。Jae[9]、Fu Jianhong[10]和蘇燕南[11]等從沙雷氏菌中發(fā)現(xiàn)編碼PlaA1的基因下游存在一段與plaA1基因重疊5 bp的輔助蛋白基因plaS,該基因能編碼蛋白質(zhì)但無酶活性,將PlaA1與磷脂酶A1輔助蛋白(phospholipase A1 accessory protein,PlaS)共表達(dá)基因plaB克隆在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn),胞外會(huì)產(chǎn)生有活性的PlaA1,但是單獨(dú)表達(dá)PlaA1時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量沒有PlaA1活性的包涵體,表明plaS對PlaA1的胞外表達(dá)具有調(diào)控作用。

        對PlaS進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),PlaS屬于錨蛋白(Ankyrin,ANK)家族中的ANK2家族,根據(jù)GenBank(Protein-ID:AFN44705.1)數(shù)據(jù)分析,其蛋白結(jié)構(gòu)是由N端、ANK區(qū)域和C端三部分區(qū)域組成,其中ANK區(qū)域包含4 個(gè)典型的ANK重復(fù)序列(ANK reapeat)。ANK是一種胞內(nèi)連接蛋白,為單鏈多肽,通常由若干個(gè)ANK repeat串聯(lián)而成,每一個(gè)ANK repeat包含30~33 個(gè)氨基酸,組成β2α2的“L”型結(jié)構(gòu)[12],可以介導(dǎo)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用[13]。在許多生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)中都發(fā)現(xiàn)了ANK repeat,其功能包括細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[14]、維持細(xì)胞骨架的完整性、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[15-16]、炎癥反應(yīng)[17]、發(fā)育[18]和各種轉(zhuǎn)運(yùn)作用[19-21]等。這些ANK repeat模塊通常形成一個(gè)由重復(fù)次數(shù)決定的形狀大小不同的細(xì)長表面。一個(gè)孤立的ANK repeat是無法行使其功能的,它必須與另一個(gè)ANK repeat相連接,其編碼的肽鏈才能產(chǎn)生正常的折疊[22]。也就是說ANK repeat串聯(lián)的個(gè)數(shù)對介導(dǎo)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用影響較大。

        基因剪接技術(shù)已經(jīng)成為分子截短的重要研究手段。為了揭示PlaS對PlaA1的調(diào)控機(jī)制,朱昊等[23]將PlaS的N端區(qū)域的前35 個(gè)氨基酸截掉之后,與PlaA1進(jìn)行共表達(dá),發(fā)現(xiàn)其胞外酶活與未截短菌株相較有顯著增加,截短后的蛋白dPlaS的蛋白表達(dá)量也顯著增加。Zhang Bin等[24]曾對p16INK4分別進(jìn)行了C端和N端的截短,其研究表明C端2 個(gè)重復(fù)序列可以自主形成折疊結(jié)構(gòu),而N端的2 個(gè)重復(fù)序列是孤立無序的,這表明這2 個(gè)區(qū)域在本質(zhì)上具有不同的穩(wěn)定性。

        為進(jìn)一步探究PlaS對PlaA1酶活的關(guān)鍵作用區(qū)域,本研究從PlaA1和PlaS共表達(dá)基因plaB的C端處開始剪接,并對截短菌株進(jìn)行了胞外酶學(xué)性質(zhì)研究,為后期闡明PlaS對PlaA1胞外酶活的調(diào)節(jié)機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        1.1.1 菌種與試劑

        BP28工程菌,攜帶plaB基因(GenBank Accession No.JX138536.1),由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建;plaB基因來源于黏質(zhì)沙雷氏菌PL-06,其含有編碼PlaA1的基因plaA1與輔助蛋白基因plaS;BL21(DE3),JM109分別作為PlaA1及其截短基因的表達(dá)載體和克隆載體;選擇質(zhì)粒pET-28a(+)作為基因載體。

        磷酸氫二鈉、檸檬酸、磷酸二氫鈉、甘氨酸、氫氧化鈉國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;其他試劑均為分析純。

        1.1.2 培養(yǎng)基

        LB培養(yǎng)基:酵母粉5 g,胰蛋白胨10 g,氯化鈉10 g,蒸餾水定容到1 000 mL,調(diào)pH值至7.0。

        PLB固體培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基84.5 mL,10%卵磷脂10 mL,0.01%溴甲酚紫3 mL,1 mol/L CaCl22.5 mL,瓊脂粉2 g;TB培養(yǎng)基:胰蛋白胨12 g,酵母粉24 g,磷酸二氫鉀2.31 g,磷酸氫二鉀9.85 g,3%甘油,蒸餾水定容到1 000 mL。以上培養(yǎng)基均在121 ℃,滅菌20 min,培養(yǎng)基中的卵磷脂、氯化鈣和溴甲酚紫需分開滅菌后混合使用。

        乳糖自誘導(dǎo)培養(yǎng)基:酵母粉5 g,胰蛋白胨10 g,乳糖5 g,磷酸氫二鈉0.025 mol/L,磷酸二氫鈉0.025 mol/L,硫酸鎂1 mmol,甘氨酸7.5 g,葡萄糖0.8 g,蒸餾水定容至1 000 mL,115 ℃滅菌15 min。

        1.2 儀器與設(shè)備

        EL20 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;冷凍高速離心機(jī) 賽默飛世爾公司;DYCP-31D水平電泳槽 北京六一儀器廠;TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;凝膠成像系統(tǒng) 美國Syngene公司;基因?qū)雰x 寧波新芝生物科技股份有限公司;PCR儀 美國Bio-Rad公司;常壓室溫等離子體育種機(jī) 北京思清源物科技有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 截短突變體的設(shè)計(jì)

        將GenBank上公布的黏質(zhì)沙雷氏菌PL-06 PlaA1輔助蛋白PlaS的氨基酸序列(Protein-ID:AFN44705.1)在NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行在線分析。根據(jù)輔助蛋白的氨基酸序列的分析結(jié)果,設(shè)計(jì)輔助蛋白截短突變體。

        1.3.2 截短基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建

        本研究利用實(shí)驗(yàn)室先前構(gòu)建的一株產(chǎn)PlaA1工程菌BP28,在含δ50卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)工程菌BP28,于37 ℃搖床充分振蕩培養(yǎng)12~16 h。按照SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒進(jìn)行制備質(zhì)粒DNA樣品。

        以pET-28a(+)-plaB質(zhì)粒為模板,根據(jù)表1的引物,用Taq酶進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增,擴(kuò)增34 個(gè)循環(huán),條件如表2所示。對擴(kuò)增后的片段進(jìn)行膠回收,BamHI、HindIII雙酶切之后利用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化,純化后的樣品分別與pET-28a(+)載體連接,并轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。在PLB平板中挑取陽性菌株送入南京金絲瑞公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。

        表 1 截短突變體引物設(shè)計(jì)Table 1 Primer sequences used for truncated mutants

        表 2 截短突變體的PCR擴(kuò)增條件Table 2 PCR amplification conditions of truncated mutants

        1.3.3 胞外粗酶液的制備

        分別從PLB平板上挑取陽性轉(zhuǎn)化子,接種到含有δ50卡那霉素的5 mL LB試管中,37 ℃、200 r/min搖床過夜培養(yǎng),活化后按1%接種量接入含有δ50卡那霉素的100 mL乳糖自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)8 h。將發(fā)酵終點(diǎn)后的發(fā)酵液于12 000 r/min、4 ℃離心2 min,上清液即為胞外粗酶液。由于各菌中的PlaA1蛋白表達(dá)量較低,表達(dá)水平無法計(jì)算,蛋白純化較為困難,因此后續(xù)采用胞外粗酶液進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的研究。

        1.3.4 截短菌株酶活測定

        1.3.4.1 酶活測定

        參考文獻(xiàn)[25]方法,PlaA1酶活力定義為:在45 ℃條件下,每分鐘水解卵磷脂產(chǎn)生1 μmol游離脂肪酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。比酶活定義為每毫克蛋白所含PlaA1的含量。蛋白含量的測定采用Bradford定量法,并繪制出蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。將胞外酶液與考馬斯亮藍(lán)溶液反應(yīng)后在595 nm波長處測得吸光度,根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可得蛋白含量,再根據(jù)酶活大小,計(jì)算比酶活。

        1.3.4.2 截短菌株透明圈的測定

        將滅過菌的牙簽,分別蘸取各突變菌株于PLB平板上,將其放置37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12~16 h,待長出單菌落,再將其放置4 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行低溫培養(yǎng)3~4 d,可觀察到PLB平板上產(chǎn)生不同大小的透明圈,用游標(biāo)卡尺測各菌落及其透明圈的直徑。

        1.3.5 截短菌株酶學(xué)性質(zhì)的研究

        1.3.5.1 溫度對各截短菌株酶促反應(yīng)的影響

        根據(jù)PlaA1酶活測定方法,保持其他酶促反應(yīng)條件不變,考察酶促反應(yīng)溫度對各突變菌株酶活力的影響,確定各突變菌株P(guān)laA1的最適溫度。以出發(fā)菌株BP28所產(chǎn)PlaA1在最適反應(yīng)溫度下的酶活力定義為100%,計(jì)算其他樣品的相對酶活力。

        將各截短菌株的PlaA1粗酶液置于最適溫度下進(jìn)行水浴保溫處理,然后進(jìn)行測定其殘余的酶活力。在保持其他條件相同的情況下,將未經(jīng)過保溫處理的酶活力定義為100%計(jì)算相對酶活力。

        1.3.5.2 pH值對各截短菌株酶促反應(yīng)的影響

        酶活測定方法同1.3.4節(jié),保持其他酶促反應(yīng)條件不變,考察pH值對各突變菌株酶活力的影響,確定各突變菌株P(guān)laA1的最適pH值。以出發(fā)菌株BP28所產(chǎn)PlaA1在最適反應(yīng)pH值下的酶活力定義為100%,計(jì)算其他pH值的樣品相對酶活力。

        將各截短菌株P(guān)laA1粗酶液置于不同pH值下進(jìn)行水浴保溫處理,然后迅速放置最適pH值下進(jìn)行測定其殘余的酶活力。在保持其他條件相同的情況下,將未經(jīng)過酸堿處理的酶活力定義為100%計(jì)算相對酶活力。

        1.3.5.3 動(dòng)力學(xué)參數(shù)

        以卵磷脂為底物,按照4%、6%、8%、10%的底物濃度,在pH 6、45 ℃條件下反應(yīng)15 min,按照1.3.4節(jié)方法測定比酶活;反應(yīng)速率V為比酶活與反應(yīng)時(shí)間的比值,以反應(yīng)速率和底物濃度S的倒數(shù)為坐標(biāo),根據(jù)Lineweaver-Burk作圖法分別計(jì)算Km和Vmax。

        1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與圖標(biāo)繪制

        采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),Origin軟件進(jìn)行圖表繪制。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 截短突變體的設(shè)計(jì)

        根據(jù)NCBI網(wǎng)站對PlaS進(jìn)行BLAST在線比對的結(jié)果顯示,PlaS屬于ANK超家族,且含有4 個(gè)典型的ANK repeat,分別在PlaS氨基酸序列的46~76、78~109、111~142、145~176位置處。PlaS二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊以及無規(guī)卷曲組成,其中α-螺旋占比高達(dá)54.86%,無規(guī)卷曲占比達(dá)到34.24%。每一個(gè)ANK repeat都包含著2 個(gè)α-螺旋和2 個(gè)β-折疊,內(nèi)部形成高度疏水區(qū)域。為探討PlaS對PlaA1酶活的關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域,將其編碼基因進(jìn)行截短,圖1為截短基因線性示意圖。

        圖 1 plaA1與plaS截短基因的線性示意圖Fig. 1 Linear diagram of truncation of plaA1 and plaS

        2.2 重組子的構(gòu)建

        以pET-28a-plaB質(zhì)粒為模板,利用PCR技術(shù)對截短基因片段進(jìn)行大量擴(kuò)增,并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。從瓊脂糖凝膠電泳條帶(圖2)表明,與截短目的基因相符。

        圖 2 各截短基因的PCR電泳檢測圖Fig. 2 Electrophoresis patterns of PCR amplified truncated genes

        從PLB平板上分別挑取陽性克隆子,接種到含有δ50卡那霉素的5 mL LB試管中,37 ℃、200 r/min搖床過夜培養(yǎng),按照SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒進(jìn)行制備質(zhì)粒DNA樣品。將陽性菌株送去南京金絲瑞公司進(jìn)行測序,通過軟件DNAMAN進(jìn)行序列比對,序列一致。將其分別進(jìn)行保存,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

        2.3 各截短菌株胞外酶活的分析

        為研究plaS的截短基因?qū)laA1胞外酶活的影響,對各突變菌株所產(chǎn)透明圈進(jìn)行圈徑比的計(jì)算。由于未截短菌株BP28與各截短突變菌株均含有plaA1基因,PlaA1可水解PLB平板上的大豆卵磷脂,在溴甲酚紫的作用下,可產(chǎn)生透明圈如圖3所示,圈徑比的大小表示各菌株胞外酶活的高低如表3所示。結(jié)合圖4各菌比酶活數(shù)據(jù)來看,當(dāng)PlaS的C端區(qū)域缺失,ANK結(jié)構(gòu)域保存3~4 個(gè)ANK repeat序列時(shí),截短菌株AN-3與AN-4所產(chǎn)的PlaA1胞外比酶活分別為105.46 U/mg和108.16 U/mg,表現(xiàn)為胞外促進(jìn),達(dá)顯著水平(P<0.05),與未截短菌株BP28 PlaA1胞外比酶活(60.88 U/mg)相比分別高了73%和78%。當(dāng)ANK repeat的個(gè)數(shù)繼續(xù)減少時(shí),PlaA1胞外比酶活開始顯著降低,截短菌株AN-1、AN-2 PlaA1胞外比酶活分別為59.31、60.74 U/mg,當(dāng)PlaS的ANK結(jié)構(gòu)域完全缺失時(shí),截短菌株AN PlaA1胞外比酶活為57.19 U/mg,與截短菌株AN-1、AN-2 PlaA1的胞外比酶活并無顯著差異。同時(shí)各菌株的胞內(nèi)比酶活表現(xiàn)出無顯著差異。從胞外比酶活的數(shù)據(jù)來看,在PlaS中ANK結(jié)構(gòu)域至少需要3 個(gè)ANK reapeat串聯(lián)才會(huì)對PlaA1酶活表現(xiàn)為胞外促進(jìn)作用。

        圖 3 各截短菌株在PLB平板上的菌落圖Fig. 3 Colony morphology of each truncated strain on PLB plate

        表 3 各截短菌株透明圈的圈徑值Table 3 Ratio of the diameter of the transparent circle to the diameter of each truncated strain

        圖 4 各截短菌株在胞內(nèi)與胞外的比酶活Fig. 4 Intracellular and extracellular specific enzymatic activity of each truncated strain

        2.4 各截短菌株的酶學(xué)性質(zhì)分析

        2.4.1 溫度對各截短菌株P(guān)laA1酶活的影響

        圖 5 溫度對各截短菌株P(guān)laA1活性與耐熱性的影響Fig. 5 Effect of temperature on the PlaA1 activity and heat resistance of each truncated strain

        在最適溫度45 ℃條件下,以未截短菌株BP28的PlaA1酶活定義為100%計(jì)算相對酶活力,截短菌株AN、AN-1、AN-2、AN-3、AN-4的PlaA1相對酶活力分別為85.29%、84.80%、87.25%、110.29%、122.06%(圖5a)。結(jié)合圖5b可知,在45 ℃條件下,雖然突變菌AN-3、AN-4所產(chǎn)PlaA1的相對酶活力表現(xiàn)最高,但是其熱穩(wěn)定性也表現(xiàn)最差,推測PlaS的C端部分可維持PlaA1的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。當(dāng)PlaS的ANK repeat被繼續(xù)截短時(shí),AN、AN-1、AN-2所產(chǎn)PlaA1的相對酶活力有所下降,可能因?yàn)閜laS的過度剪截在一定程度上破壞了輔助蛋白的結(jié)構(gòu)。

        2.4.2 pH值對各截短菌株P(guān)laA1酶活的影響

        如圖6a所示,截短菌株AN-3、AN-4所產(chǎn)生的PlaA1的最適pH值與BP28的相同,最適pH值均為6。而截短菌株AN、AN-1、AN-2的最適pH值發(fā)生了酸性偏移,最適pH值為5,說明輔助蛋白對PlaA1的酸堿性進(jìn)行了一定程度的調(diào)控。由圖6b可知,當(dāng)反應(yīng)體系的pH 3~5時(shí),各突變株的PlaA1活性呈現(xiàn)上升趨勢。各突變株在pH值在5~8的條件下均表現(xiàn)為較好的穩(wěn)定性。

        圖 6 pH值對各截短菌株P(guān)laA1活性(a)及穩(wěn)定性(b)的影響Fig. 6 Effect of pH on the PlaA1 activity (a) and stability (b) of each truncated strain

        2.4.3 各截短菌株P(guān)laA1酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測定

        圖 7 雙倒數(shù)法測定各截短菌株P(guān)laA1的米氏常數(shù)Fig. 7 Lineweaver-Burk plot for Km determination of PlaA1 from each truncated strain

        表 4 各截短菌株P(guān)laA1的酶動(dòng)力學(xué)方程Table 4 Enzymatic kinetic equation of PlaA1 from each truncated strain

        表 5 各截短菌株P(guān)laA1的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 5 Kinetic parameters of PlaA1 from each truncated strain

        雙倒數(shù)法確定各截短菌株P(guān)laA1的米氏常數(shù)及酶動(dòng)力學(xué)見圖7、表4。根據(jù)所得到的各截短菌株的動(dòng)力學(xué)參數(shù)(表5)來看,截短菌株AN-3與AN-4所產(chǎn)PlaA1的Km值與BP28的相比分別降低了1.37 倍和1.45 倍,催化效率(Kcat/Km)分別提高了216%和211%,表明PlaS的C端及ANK結(jié)構(gòu)域一個(gè)ANK repeat被剪截后導(dǎo)致PlaA1空間構(gòu)象發(fā)生改變,使得PlaA1與底物的親和力增強(qiáng),表現(xiàn)出更高的催化效率和酶活力。同時(shí)可看出在所有的截短菌株中AN菌株酶的Kcat/Km最小,其催化效率最低,進(jìn)一步表明ANK repeat的個(gè)數(shù)決定著ANK結(jié)構(gòu)域的功能,對于調(diào)節(jié)PlaA1的胞外酶活起著重要作用。

        3 討論與結(jié)論

        通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),PlaS屬于ANK2家族。在TMHMM網(wǎng)站中預(yù)測PlaA1和PlaS的跨膜結(jié)構(gòu)圖中得到PlaA1是無跨膜螺旋結(jié)構(gòu)的,而PlaS在其N端區(qū)7~27 aa有一個(gè)跨膜螺旋。PlaA1的胞外分泌可能是由于PlaS具有胞外運(yùn)輸?shù)墓δ?。遺憾的是,PlaS與PlaA1獲得共表達(dá)時(shí)雖酶活較高,但是胞外蛋白表達(dá)量相對較低,在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)圖上幾乎看不到PlaS條帶。朱昊[26]構(gòu)建出PlaA1輔助蛋白N端截短菌株,得到了分離純化后N端截短的輔助蛋白dPlaS,將其與PlaA1分別進(jìn)行了酵母雙雜交體內(nèi)互作和Biacore體外互作實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證了兩者均存在相互作用,同時(shí)也發(fā)現(xiàn)N端截短之后的輔助蛋白PlaS可以在SDS-PAGE蛋白電泳圖上觀察到清晰的條帶。柏錫等[27]通過生物信息學(xué)的方法對大豆中GmANKTM家族受非生物脅迫的研究報(bào)告中提到ANKTM家族中含ANK基序和跨膜結(jié)構(gòu)域,并對大豆中ANKTM家族中62 個(gè)基因進(jìn)行了鑒定與分類,在ANKTM家族中蛋白含數(shù)量不等的ANK repeat,其對靶蛋白的結(jié)合能力也有所不同。由于ANK特殊的蛋白結(jié)構(gòu),在生物醫(yī)學(xué)研究中,ANK蛋白結(jié)合靶蛋白的特異性可設(shè)計(jì)成小型支架蛋白以起到靶向治療的作用[28-30]。目前人們對ANK在原核生物中的生理作用知之甚少,一些細(xì)菌的ANK蛋白在微生物的作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)對PlaS與PlaA1共表達(dá)基因plaB進(jìn)行剪接,構(gòu)建出一系列截短突變菌株,并分別測出各截短菌株胞外粗酶液的酶學(xué)性質(zhì),其中截短菌株AN-3與AN-4所產(chǎn)PlaA1酶活表現(xiàn)為胞外促進(jìn)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PlaS中的ANK結(jié)構(gòu)域至少需要3 個(gè)ANK reapeat才會(huì)對PlaA1酶活表現(xiàn)為胞外促進(jìn)作用,同時(shí)PlaS的C端域?qū)τ诰S持PlaA1的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性起到重要的作用。同時(shí)也說明了ANK reapeat的數(shù)目對于維持ANK結(jié)構(gòu)域的功能發(fā)揮著關(guān)鍵性作用,為后期深入研究PlaS對促進(jìn)PlaA1胞外分泌機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)。

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