豐國強，徐文亮，宋 平，李婉珍，陶玉貴，葛 飛，朱龍寶

（安徽工程大學生物與化學工程學院，安徽 蕪湖 241000）

植物紫衫（Taxus chinensis）中苯丙氨酸變位酶（phenylalanine aminomutase fromTc，TcPAM）參與抗腫瘤藥物紫杉醇的生物合成[1-2]，TcPAM催化合成紫衫醇中重要的結構單元β-苯丙氨酸。β-苯丙氨酸是一些天然活性產物的重要結構單元[3-4]，廣泛應用于食品和醫(yī)藥等工業(yè)領域[5]。TcPAM能夠催化α-芳香丙氨酸的異構化，使α-氨基變位至β位形成β-芳香丙氨酸[6-8]，其化學反應式如圖1所示。

圖 1 TcPAM催化的異構反應Fig. 1 Isomerization catalyzed by phenylalanine aminomutase

目前制備β-苯丙氨酸主要依靠的是不對稱化學合成方法[9]，但是存在成本比較高、工藝相對復雜、原子利用率低、副產物多等不足，需要開發(fā)經濟節(jié)約、綠色可持續(xù)的合成方法[10]。與化學方法相比利用酶轉化法[11]生成β-苯丙氨酸，工藝相對簡單，生產方法穩(wěn)定，生產過程安全綠色，這種方法應用越來越廣泛[12]。目前主要利用轉氨酶催化合成[13]，但是轉氨酶要添加NADH、FADH2等外源輔助因子[14-15]，導致生產工藝操作繁瑣，很難實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產[16]。為此，尋找不需要添加任何外源性輔因子的酶轉化方法更具發(fā)展前景。PAM由于能以α-芳香丙氨酸為底物，一步催化合成β-苯丙氨酸[17-18]，同時無需添加輔因子，操作簡單，適合大規(guī)模的工業(yè)生產。

目前，已經成功克隆來源于原核生物Streptomyces maritimus[16]、Pantoea agglomerans[19]的pam基因，并成功實現(xiàn)異源高效表達，制備了工業(yè)應用的PAM。由于微生物來源的PAM催化α-苯丙氨酸生成的產物β-苯丙氨酸是S構型[20-21]，而作為活性成分的前體物[22]，往往需要R構型的β-苯丙氨酸，為此需要對PAM的基因進一步進行挖掘，表達出能夠一步催化合成R構型β-苯丙氨酸的TcPAM。Chirpch[23]和Morley[24]等首先發(fā)現(xiàn)自然界中的氨基變位酶，Walker[6]和Steele[7]等克隆表達了來自真核生物T. chinensis的氨基變位酶。為了獲得制備大量的工業(yè)用TcPAM，對其進行異源表達是一種常見的策略，其中由于大腸桿菌生長速度快，表達量高，遺傳背景清楚，是生產工業(yè)用酶的首選宿主菌，但是TcPAM在大腸桿菌中進行異源表達時，容易形成無活性的包涵體，導致目前未實現(xiàn)利用基因工程技術手段生產重組的TcPAM。本研究首先化學合成TcPAM的基因（Tcpam），篩選合適的大腸桿菌表達載體，實現(xiàn)可溶具有活性的酶的高效表達，克服形成包涵體的缺陷，用于催化合成R-β-苯丙氨酸，并進行重組酶活力分析，旨在為后續(xù)工業(yè)上利用TcPAM催化合成R-β-芳香丙氨酸提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌BL21（DE3）、大腸桿菌JM109為本實驗室保存；克隆載體pMD18-T和表達載體pET28a（+）、pET32b（+）、pET22b（+） 美國Invitrogen公司；pET-sumo 艾禮生物科技（上海）有限公司；DNA聚合酶、DNA連接酶、限制性內切酶NotI和BamHI TaKaRa（寶）生物股份有限公司；引物、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG）、氨芐霉素、卡那霉素、質粒抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；酶活力催化反應底物L-α-芳香丙氨酸、標準品β-芳香丙氨酸美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）基因擴增儀、GelDoc2000型凝膠成像系統(tǒng)美國Bio-Rad公司；VCX2500型超聲波細胞破碎儀美國Sonics公司；AKTAprime蛋白純化儀 美國GE Healthcare公司；高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、QP2010型氣相色譜-質譜聯(lián)用儀 日本島津公司；Z326K型高速冷凍離心機德國Hermle公司。

1.3 方法

1.3.1 基因克隆與表達

根據(jù)NCBI提供的基因序列（AY724735.1），送生工生物工程（上海）股份有限公司合成Tcpam，在基因兩端分別插入BamHI和NotI的酶切位點，將Tcpam插入克隆載體pMD18-T中，構建成pMD18-Tcpam。利用BamHI和NotI分別雙酶切pMD18-Tcpam和表達載體pET28a（+）、pET32b（+）、pET-sumo以及pET22b（+），切膠回收目的基因Tcpam和載體pET28a（+）、pET32b（+）、pET-sumo以及pET22b（+），用T4 DNA連接酶將目的基因與載體pET28a（+）、pET32b（+）、pET-sumo以及pET22b（+）在16 ℃連接12 h，將連接產物轉入感受態(tài)大腸桿菌JM109中，帶有pET32b（+）和pET22b（+）的感受態(tài)細胞涂布到含有20 mg/L氨芐霉素的LB平板上，帶有pET-sumo和pET28a（+）的感受態(tài)細胞涂布到含有卡50 mg/L卡那霉素的LB平板上，于37 ℃培養(yǎng)12～14 h，分別隨機選取3 個陽性重組菌落，接種于含對應抗生素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10～12 h，提取質粒做雙酶切驗證，然后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序確認基因序列，構建重組表達質粒分別命名為pET32b（+）-Tcpam、pET-sumo-Tcpam以及pET22b-Tcpam和pET28a-Tcpam。

1.3.2 重組菌的表達與分離純化

將已經構建的pET32b（+）-Tcpam、pET-sumo-Tcpam、pET22b-Tcpam和pET28a-Tcpam分別轉入到感受態(tài)大腸桿菌BL21中，涂布到LB平板上培養(yǎng)12 h，分別挑取單菌落接到5 mL的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，取2 mL培養(yǎng)液至200 mL的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)至OD600nm為0.6，加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG，于16 ℃、200 r/min條件下誘導表達20 h，離心收集菌體，超聲破碎（功率300 W，工作1 s，間隔2 s，共12 min），4 ℃、8 000 r/min離心5 min，收集上層清液，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electroporesis，SDS-PAGE）檢測酶蛋白表達情況，采用His-TrapTM/FF親和層析柱進行分離純化，制備電泳純的重組酶。

1.3.3 酶活力檢測

將適量的重組酶加入至800 μL緩沖液（25 mmol/L Tris-HCl，pH 9）中，然后加入200 μL 25 mmol/L底物L-α-苯丙氨酸混合，反應體積為1 mL。于30 ℃反應1 h后100 ℃加熱5 min終止反應。用C18反相色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）檢測產物，流動相為甲醇（0～15 min，甲醇體積分數(shù)由10%升高到40%），進樣20 μL，柱溫30 ℃，流速1 mL/min，檢測波長260 nm。酶活力單位的定義：30 ℃條件下每分鐘生成1 μgβ-苯丙氨酸需要的酶量為1 個酶活力單位（U）。

1.3.4 重組酶的酶學性質表征

1.3.4.1 溫度對酶活力的影響

在pH 9、10～45 ℃測定酶活力，確定重組酶的最佳反應溫度。分別將酶在40、45、50 ℃熱處理0.5～3 h后在30 ℃測定酶的剩余活力，未熱處理酶活力為100%，研究酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.4.2 pH值對酶活力的影響

在30 ℃條件下，分別在不同pH值緩沖體系（pH 5～7，25 mmol/L磷酸緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）；pH 7～9，25 mmol/L Tris-HCl緩沖液；pH 9～10，25 mmol/L碳酸鈉緩沖液（sodium carbonate buffer，SCB）中測定酶活力，確定重組酶的最佳反應pH值。將酶分別溶解于不同pH值的緩沖體系（pH 8、9、10）中并處理6～36 h，每隔6 h取樣測定酶剩余活力，以未處理的酶活力為100%，研究酶的pH值穩(wěn)定性。

1.3.4.3 金屬離子及表面活性劑對酶活力的影響

在30 ℃、pH 9條件下，將不同的金屬離子（10 mmol/L，K+、Mg2+、Fe2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co3+）和表面活性劑（1 mmol/L，Triton X-100、Tween 80、SDS、十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB））分別加入反應體系中，檢測重組酶活力，以不加金屬離子和表面活性劑反應體系的酶活力為100%，研究其對酶活力的影響。

1.3.5 酶法合成β-芳香丙氨酸

分別用苯環(huán)上攜帶不同基團的α-芳香丙氨酸（25 mmol/L，底物苯環(huán)上分別攜帶的基團R為2-NO2、3-NO2、4-NO2、2-Me、3-Me、4-Me、2-MeO、3-MeO、4-MeO）為底物合成β-芳香丙氨酸，在30 ℃、pH 9的條件下反應8 h，采用HPLC檢測分析β-芳香丙氨酸的產率或各種α-芳香丙氨酸的轉化率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 表達載體構建

圖 2 表達載體NotI和BamHI雙酶切驗證Fig. 2 Confirmation of expression vector by double enzymatic digestion with NotI and BamHI

對構建的表達載體pET32b-Tcpam、pET-sumo-Tcpam、pET22b-Tcpam以及pET28a-Tcpam進行BamHI和NotI雙酶切驗證，瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2所示。在2 100 bp左右出現(xiàn)目的基因條帶，與理論值一致，表明成功構建表達載體pET32b-Tcpam、pE-Tsumo-Tcpam、pET22b-Tcpam以及pET28a-Tcpam，將其送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結果與NCBI中Tcpam基因序列（AY724735.1）一致。

2.2 重組菌的可溶表達與純化

圖 3 重組酶表達及利用HisTrapTM/FF純化酶的SDS-PAGE圖Fig. 3 SDS-PAGE patterns of recombinant enzyme before and after purification using HisTrapTM/FF

由圖3可知，帶有pET32b-Tcpam、pET22b-Tcpam重組子經誘導后不表達，而帶有pET28a-Tcpam的重組子經誘導后為包涵體，不能獲得可溶性的重組酶，僅有pET-sumo-Tcpam的重組子經過IPTG誘導表達可以得到可溶性重組酶，在70 kDa出現(xiàn)可溶性的目的蛋白條帶，條帶大小與理論值相同。由于pET-sumo-Tcpam載體帶有SUMO融合蛋白表達標簽，SUMO融合蛋白有促進重組蛋白的正確折疊和提高重組蛋白可溶性的功能[25-27]，而其他pET載體沒有相關的融合蛋白，導致重組子經誘導后為包涵體或者不表達。將重組酶利用HisTrapTM/FF親和層析柱分離純化，SDS-PGAE分析純化產物，獲得電泳純的重組酶，其質量濃度達到0.256 mg/mL。

2.3 重組酶的性質表征

2.3.1 重組酶催化產物分析

標準品（α-苯丙氨酸）的出峰時間為15.1 min（圖4a），檢測TcPAM催化底物α-苯丙氨酸之后，在13.2 min出現(xiàn)一個吸收峰（圖4b），收集并做質譜檢測，圖4c、d結果顯示，酶催化產物與底物的相對分子質量均為166.2，表明TcPAM能催化α-苯丙氨酸生成β-苯丙氨酸。收集出峰時間為13.2 min的產物進行圓二色譜分析，如圖5所示，酶催化產物與標準品R-β-苯丙氨酸具有相似的圓二色譜，與標準品S-α-苯丙氨酸的圓二色譜成Cotton效應[28]，表明產物是R構型，與報道來源于微生物的PAM催化產物的構型相反。

圖 4 重組酶催化底物和產物的HPLC以及質譜圖Fig. 4 HPLC and MS profiles of recombinant phenylalanine aminomutase-catalyzed products

圖 5 標準物與酶催化產物圓二色譜Fig. 5 CD spectra of reference standard and recombinant phenylalanine aminomutase-catalyzed product

2.3.2 溫度對重組酶活力的影響

圖 6 溫度對酶活力（a）以及酶活力穩(wěn)定性（b）的影響Fig. 6 Effects of temperature on the activity (a) and stability (b) of recombinant enzyme

從圖6a可知，重組酶的最適溫度為30 ℃，酶活力達到4.11 U/mg。如圖6b所示，重組TcPAM在40～45 ℃處理3 h時酶活力保持80%以上，在50 ℃處理3 h后仍具有60%的酶活力，表明重組酶的熱穩(wěn)定性較好。

2.3.3 pH值對重組酶活力的影響

從圖7a可知，重組酶的最適pH值為9，與目前已知的其他來源的PAM一致[29]。由圖7b可知，該重組酶在具有較高的穩(wěn)定性，在pH 8、9、10的緩沖液處理后，酶活力仍保持在95%以上。

圖 7 pH值對酶活力（a）以及酶活力穩(wěn)定性（b）的影響Fig. 7 Effects of pH on the activity (a) and stability (b) of recombinant enzyme

2.3.4 金屬離子和表面活性劑對重組酶活力的影響

圖 8 金屬離子（a）以及表面活性劑（b）對酶活力的影響Fig. 8 Effects of metal ions (a) and surfactants (b) on the activity of recombinant enzyme

由圖8a可知，K+、Fe2+和Ca2+對TcPAM活力影響較小，相對酶活力保持在80%以上；Mn2+、Mg2+和Co3+對酶活力具有一定的影響，相對酶活力保持在60%～80%之間；而Cu2+和Zn2+強烈抑制酶活力，導致酶活力喪失。由圖8b可見，4 種表面活性劑CTAB、SDS、Triton X-100和Tween 80對重組酶的活性影響較小，相對酶活力保持在90%以上。

2.3.5 重組酶異構化α-芳香丙氨酸合成β-芳香丙氨酸

TcPAM可以異構化α-芳香丙氨酸合成β-芳香丙氨酸，如圖9所示。結果表明，TcPAM催化的區(qū)域選擇性受苯環(huán)上取代基的基團的性質以及位置影響。TcPAM催化α-芳香丙氨酸出現(xiàn)如下的規(guī)律，當苯環(huán)上攜帶的R基團是供電子基團時，促進氨基從底物的α位轉移至β位，有利于β-芳香丙氨酸的生成，如R基團是4-MeO或4-Me時，其中β-4-MeO-苯丙氨酸的轉化率最高達到45%，但當R基團是2-MeO或3-MeO時，產率低于10%，這可能由于MeO基團較大，而酶活力中心的芳香基結合口袋較窄，導致2、3位置有較大的基團時影響其產率；當苯環(huán)上攜帶的R基團是吸電子基團時，氨基不易轉移到芳香丙氨酸的β位，難以生成相應的β-芳香丙氨酸，如R基團為4-NO2時，產物僅有少量的β-4-NO2-苯丙氨酸，轉化率低于5%。

圖 9 重組酶催化不同取代基的α-芳香丙氨酸的轉化率Fig. 9 Conversion of α-aromatic alanine with different substituents catalyzed by recombinant phenylalanine aminomutase

3 結 論

經過篩選不同的大腸桿菌表達載體，構建的pET-sumo-Tcpam在大腸桿菌BL21（DE3）中實現(xiàn)高效表達，并獲得了可溶性的重組酶TcPAM，采用HisTrapTM/FF親和層析的方法制備出電泳純的TcPAM，具有較好的熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性，能夠催化α-苯丙氨酸異構化生成R-β-苯丙氨酸，但其催化效率及形成的產物β-芳香丙氨酸的產率與底物苯環(huán)上攜帶的基團性質及位置相關，其中4-MeO-β-苯丙氨酸的產率達到45%，本研究為開發(fā)生物催化合成β-苯丙氨酸點奠定了基礎。