李欣芮，趙 桉，范小飄，高文文，尚佳萃，趙鵬昊，趙 樂，周 雪，孟祥晨

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

植物乳桿菌KLDS1.0391分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，能代謝產(chǎn)生對(duì)革蘭氏陽性菌和陰性菌都有抑制作用的細(xì)菌素[1]，2% NaCl脅迫可促進(jìn)其細(xì)菌素合成[2]，轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，鹽脅迫時(shí)purR基因和purL基因表達(dá)顯著下調(diào)，推測其可能參與細(xì)菌素合成的調(diào)控作用。

purR基因編碼的PurR蛋白是嘌呤從頭生物合成途徑中的阻遏蛋白，對(duì)嘌呤生物合成途徑中11 個(gè)pur系列的結(jié)構(gòu)基因具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。不同細(xì)菌中pur基因的分布和調(diào)控遵循不同的規(guī)則[3]，在革蘭氏陰性菌大腸桿菌中，嘌呤生物合成基因散布在染色體各處，在革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌中，所有參與嘌呤合成的基因都分布在一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元，即嘌呤操縱子[4]。關(guān)于植物乳桿菌purR的研究較少，但有研究表明乳酸乳球菌中的purR與枯草芽孢桿菌中的purR同源[5]。許多代謝調(diào)節(jié)蛋白具有雙重功能甚至是未被發(fā)現(xiàn)的功能，purR基因除對(duì)嘌呤生物合成具有重要的調(diào)控作用外，還對(duì)嘧啶合成途徑中的pyrC與pyrD基因、與Cysosine轉(zhuǎn)運(yùn)吸收有關(guān)的codBA基因、編碼5-磷酸核糖焦磷酸合成酶的prs基因以及甘氨酸合成代謝和一碳單位合成的glyA基因和gcv操縱子等具有調(diào)控作用[6-7]。除此之外，近年研究表明，金黃色葡萄球菌中purR突變?cè)鰪?qiáng)了其致病力[8]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，purR突變體表現(xiàn)出的毒力增加與嘌呤合成無關(guān)，PurR能夠結(jié)合并調(diào)節(jié)嘌呤生物合成途徑之外的啟動(dòng)子元件，作為一種轉(zhuǎn)錄因子，直接結(jié)合至毒力基因的啟動(dòng)子，調(diào)節(jié)毒力相關(guān)基因的表達(dá)[9]。因此，PurR可能存在尚未被開發(fā)的功能。

purL基因也參與嘌呤生物合成途徑，對(duì)于腺嘌呤和硫胺素的生物合成是必需的。Hava等[10]已經(jīng)證明其是肺炎鏈球菌中重要的毒力因子；Xia Yanfei等[11]研究發(fā)現(xiàn)由purL基因調(diào)控的嘌呤生物合成中間體可以影響枯草芽孢桿菌OKB105菌株的殺蟲活性；Alcantara等[12]發(fā)現(xiàn)purL基因突變會(huì)顯著降低流產(chǎn)布魯氏菌（Brucella abortus）的毒性；Maegawa等[13]報(bào)道了艱難梭菌（Clostridium difficile）毒素的產(chǎn)生與PurL底物的積累呈反比；Ge Xiuchun等[14]也發(fā)現(xiàn)purL基因與鏈球菌的生物膜形成有關(guān)；Liu Quanli等[15]還發(fā)現(xiàn)purL基因突變的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），其細(xì)菌素Subltilosin A的產(chǎn)量增加顯著，抑菌能力增強(qiáng)?？梢姡琾urL基因與微生物的生理活動(dòng)有密切關(guān)系。

植物乳桿菌KLDS1.0391全基因組測序以及BLAST分析發(fā)現(xiàn)[16]，該菌包含4 個(gè)與細(xì)菌素合成相關(guān)的操縱子plnEFI、plnBD、plnGHSTUVW及plnXY，不同植物乳桿菌pln基因簇結(jié)構(gòu)相似但不完全相同，但是所有的pln基因簇都具有非常相似的啟動(dòng)子，每個(gè)操縱子的啟動(dòng)子由2 個(gè)半保守的直接重復(fù)序列組成[17]，通過全基因組測序結(jié)果可以比對(duì)獲得植物乳桿菌KLDS1.0391中的plnE和plnG啟動(dòng)子[18]。

用于研究啟動(dòng)子與調(diào)控蛋白相互作用的常用方法有凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）[19-20]、DNase I足跡法[21-22]、染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)[23-25]以及近幾年發(fā)展起來的生物膜干涉（bio-layer interferometry，BLI）技術(shù)[26-27]等，能夠檢測啟動(dòng)子核酸靶標(biāo)與蛋白相互作用以及檢測二者之間的結(jié)合以及解離常數(shù)等。

本研究主要目的是通過體外分子相互作用的方法探究PurR和PurL蛋白能否與植物乳桿菌KLDS1.0391啟動(dòng)子相結(jié)合，進(jìn)而判斷這兩個(gè)蛋白是否直接參與細(xì)菌素合成的調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

植物乳桿菌KLDS1.0391為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏；pMD?19-T克隆載體、大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞 寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；pQE-30表達(dá)載體、大腸桿菌M15感受態(tài)細(xì)胞華越洋生物（北京）科技有限公司。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

質(zhì)粒小提試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、通用型DNA純化回收試劑盒、TaqDNA Polymerase、D2000 DNA Marker 天根生化科技（北京）有限公司；PrimeSTAR?HS DNA Polymerase、DL5000 DNA Marker、DNA Ligation Kit、限制性內(nèi)切酶KpnI、BamHI、HindIII 寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；卡那霉素（Kana）、氨芐青霉素（Amp）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG） 美國Amresco公司；Bradford蛋白質(zhì)量濃度測定試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠快速配制試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）、Annealing Buffer for DNA Oligos（5×）、EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5×） 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；預(yù)染彩虹蛋白Marker（10～190 kDa） 大連美侖生物技術(shù)有限公司；HisSep Ni-NTA Agarose Resin上海翊圣生物科技有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 美國Sigma公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

LB培養(yǎng)基及MRS培養(yǎng)基配制方法參照文獻(xiàn)[28-29]。

1.2 儀器與設(shè)備

梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國耶拿分析儀器股份公司；DYY-10C型電泳儀 北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP公司；QuickDrop超微量核酸蛋白分析儀、SpectraMax i3x多功能酶標(biāo)儀、Octet RED96e分子互作分析系統(tǒng)美谷分子儀器（上海）有限公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司；蛋白純化柱 美國Thermo Fisher公司；蛋白質(zhì)電泳儀、GelDoc EZ凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)植物乳桿菌KLDS1.0391全基因組測序結(jié)果得到的purR和purL的基因序列，以及表達(dá)載體pQE-30質(zhì)粒所包含的酶切位點(diǎn)，應(yīng)用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物。在purR基因上下游引物的5’端分別引入限制性內(nèi)切酶KpnI和HindIII的酶切位點(diǎn)以及相應(yīng)的保護(hù)堿基，purR基因上游引物（FR）為5’-GGGGTACCATGAAAGTACGTA GAAGCGAACG-3’（下劃線是KpnI酶切位點(diǎn)），下游引物（RR）為5’-CCCAAGCTTCTAGACTTCCGCACCGAA AAC-3’（下劃線是HindIII酶切位點(diǎn)）；在purL基因上下游引物的5’端分別引入限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII的酶切位點(diǎn)以及相應(yīng)的保護(hù)堿基，purL基因上游引物（FL）為5’-CGCGGATCCATGCTTAAAAAGCAACCATTATC-3’（下劃線是BamHI酶切位點(diǎn)），下游引物（RL）為5’-C CCAAGCTTTTACTTCAGTAGGCATGGTAAGG-3’（下劃線是HindIII酶切位點(diǎn)）。引物由吉林庫美生物科技有限公司合成。

1.3.2 重組克隆載體的構(gòu)建與鑒定

用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取植物乳桿菌KLDS1.0391基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。purR基因的擴(kuò)增體系：DNA模板1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，高保真酶PrimeSTAR?HS DNA Polymerase（2.5 U/μL）0.5 μL，5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+plus）10 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）4 μL，dd H2O 30.5 μL，總體系50 μL。擴(kuò)增過程：94 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性10 s，63 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。purL基因擴(kuò)增退火溫度為60 ℃，其余均與purR基因的擴(kuò)增過程相同。擴(kuò)增后使用通用型DNA純化回收試劑盒回收目的基因，在目的基因3’端加A堿基后，與克隆載體pMD 19-T simple按一定比例混合，于16 ℃連接，通過熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有Amp的平板上，提取陽性菌落的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定正確的重組子進(jìn)行測序鑒定，分別命名為pMD 19-T simple-purR和pMD 19-T simple-purL。

1.3.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

用質(zhì)粒小提試劑盒提取堅(jiān)定正確的質(zhì)粒pMD 19-T simple-purR和pMD 19-T simple-purL，前者用KpnI和HindIII進(jìn)行分步酶切，后者用BamHI和HindIII進(jìn)行分步酶切，酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的基因purR和purL。將回收的目的基因與用相同酶處理后的pQE-30質(zhì)粒按一定比例混合，于16 ℃連接，通過熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌M15感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有Amp以及Kana的平板上，提取陽性菌落的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定正確的重組子進(jìn)行測序鑒定，分別命名為pQE-30-purR和pQE-30-purL。

1.3.4 PurR蛋白和PurL蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

將鑒定正確的菌株pQE-30-purR和pQE-30-purL分別接種于含Amp 100 μg/mL和Kana 25 μg/mL的LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)至菌液OD600nm達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入IPTG（終濃度為0.5 mmol/L）進(jìn)行蛋白表達(dá)，隔2 h取菌液離心收集菌體，菌體用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌后加入1/10原體積的PBS進(jìn)行重懸，加入SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸后用于SDS-PAGE分析。

1.3.5 PurR蛋白和PurL蛋白的純化與透析

PurR蛋白的純化與透析：按1%接種量將菌株pQE-30-purR接種至100 mL含Amp 100 μg/mL和Kana 25 μg/mL的LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)至菌液OD600nm達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入IPTG（終濃度為0.5 mmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)6 h，8 000 r/min離心5 min收集菌體，PBS洗滌2 次后，加入10 mL裂解液（20 mmol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl、20 mmol/L咪唑，pH 7.9）進(jìn)行超聲破壁處理（130 W 40%的功率，超聲5 s，靜置5 s），直至菌液澄清不黏稠，全程冰上操作。破壁后的菌液12 000 r/min離心10 min取上清液，上清液過0.45 μm濾膜后，加入平衡好的Ni-NTA純化柱中，輕輕攪動(dòng)，室溫孵育0.5～1 h，用梯度咪唑濃度洗脫液（20 mmol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl，咪唑濃度分別為20、50、100、150、200、300、500 mmol/L，pH 7.9）洗脫并回收PurR蛋白。純化后的PurR蛋白加入準(zhǔn)備好的透析袋中，于透析液（20 mmol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl，pH 7.9）中透析除去咪唑。

PurL蛋白的純化與透析：收集菌體后，加入10 mL PBS重懸，進(jìn)行超聲破壁處理。破壁后的菌液12 000 r/min離心10 min棄上清液，沉淀用PBS洗滌2 次后，加入包涵體溶解液（20 mmol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl、8 mol/L尿素，pH 7.9）徹底溶解，過0.45 μm濾膜后，加入平衡好的Ni-NTA純化柱中，輕輕攪動(dòng)，室溫孵育0.5～1 h，用梯度咪唑濃度洗脫液（20 mmol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl、8 mol/L尿素，咪唑濃度分別為20、50、100、150、200、300、500 mmol/L，pH 7.9）洗脫并回收PurL蛋白。純化后的PurL蛋白加入準(zhǔn)備好的透析袋中，不斷降低透析液中的尿素濃度，使包涵體復(fù)性，最終透析至PBS中。

1.3.6 PurR蛋白和PurL蛋白的濃縮與定量

分別用10 kDa和30 kDa的超濾管濃縮PurR蛋白和PurL蛋白，12 000 r/min、4 ℃離心。濃縮后的蛋白用Bradford蛋白質(zhì)量濃度測定試劑盒測定其濃度（標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液與蛋白緩沖溶液保持一致）。

1.3.7 BLI實(shí)驗(yàn)

1.3.7.1 Biotin-DNA制備

plnE啟動(dòng)子的序列為5’-ACATTGGTATTTGAC GTTAAGAGAACGTTTTTTTACTTTTATAATTTTT TCAACAATCTGGTAAAA-3’，plnG啟動(dòng)子的序列為5’-AAGCCTGATGAGGACATTTATCATAAAATTA TGTACGTTAATAGATAGTTGGCATACGATAACA TT-3’，均采用5’-biotin標(biāo)記的方法。biotin-ss DNA與非標(biāo)記的ss DNA均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，biotin-ss DNA與非標(biāo)記的ss DNA退火形成biotin-ds DNA。退火體系：Nuclease-Free Water 40 μL，Annealing Buffer for DNA Oligos（5×）20 μL，DNA oligo A（50 μmol/L）20 μL，DNA oligo B（50 μmol/L）20 μL，總體積100 μL。退火程序：95 ℃、2 min；95 ℃、1.5 min；-1 ℃/cycle；70 個(gè)循環(huán)；16 ℃保存。

1.3.7.2 Octet RED96e分子互作分析系統(tǒng)上機(jī)實(shí)驗(yàn)

將NTA傳感器插入PBS中預(yù)濕10 min以上，第1步將傳感器轉(zhuǎn)入A Buffer（PBS）中進(jìn)行第1次基線步驟（baseline 1），第2步將傳感器轉(zhuǎn)入用A Buffer稀釋的PurL蛋白溶液（終質(zhì)量濃度為160 μg/mL）中進(jìn)行蛋白固化步驟（loading），第3步將傳感器轉(zhuǎn)入B Buffer（PBS+0.02% Tween+0.1% BSA）中進(jìn)行第2次基線步驟（baseline 2），第4步將傳感器轉(zhuǎn)入用B Buffer稀釋的DNA溶液中進(jìn)行結(jié)合步驟（association），第5步將傳感器轉(zhuǎn)回B Buffer中進(jìn)行解離步驟（dissociation）。各步驟的時(shí)間根據(jù)基線平衡情況以及固化情況進(jìn)行調(diào)整。PurR蛋白實(shí)驗(yàn)時(shí)將第1步與第2步中的A Buffer換為C Buffer（20 mmol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl），蛋白固化步驟中PurR蛋白溶液終質(zhì)量濃度為25 μg/mL。實(shí)驗(yàn)設(shè)置DNA濃度梯度為86.2、43.1、21.5、10.75、5.37 nmol/L。

1.3.8 EMSA實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[30]并進(jìn)行部分調(diào)整。通過PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子序列，純化回收后測定核酸濃度。蛋白和DNA結(jié)合反應(yīng)體系中，5×EMSA結(jié)合緩沖液3 μL，DNA片段200～250 ng，不同濃度梯度純化后的蛋白，加入ddH2O補(bǔ)足至15 μL。室溫放置30 min后，加入2 μL EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液進(jìn)行非變性蛋白電泳，結(jié)束后GelRed染色并用凝膠成像儀觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組克隆載體及重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

圖 1 重組克隆質(zhì)粒以及重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定Fig. 1 Identification of recombinant cloned plasmids and recombinant expression plasmids by enzymatic digestion

針對(duì)構(gòu)建的克隆載體pMD 19-T simple-purR和pMD 19-T simple-purL以及表達(dá)載體pQE-30-purR和pQE-30-purL，用相應(yīng)的酶分別進(jìn)行分步酶切鑒定，電泳結(jié)果顯示有兩條明亮條帶（圖1）。用pMD 19-T simple通用引物以及pQE-30測序引物進(jìn)行測序，測序結(jié)果用BLAST工具與全基因組測序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，序列完全一致，表明克隆載體pMD 19-T simple-purR和pMD 19-T simple-purL，以及表達(dá)載體pQE-30-purR和pQE-30-purL已成功構(gòu)建。

2.2 PurR蛋白和PurL蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

圖 2 PurR蛋白（A）和PurL蛋白（B）的SDS-PAGEFig. 2 SDS-PAGE analysis of expressed recombinant PruR (A) and PurL (B)

如圖2所示，與未誘導(dǎo)的菌體蛋白相比（泳道1），加入IPTG誘導(dǎo)劑后的菌體蛋白（2～7泳道）在箭頭處出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，與軟件預(yù)測大小相近，PurR蛋白和PurL蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功。并且隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長，重組蛋白的表達(dá)量增加，誘導(dǎo)6 h的PurR蛋白和PurL蛋白表達(dá)量較高，6 h后蛋白表達(dá)量增加不明顯，所以確定PurR蛋白和PurL蛋白的誘導(dǎo)時(shí)間為6 h。

2.3 PurR蛋白和PurL蛋白的純化與定量

20 mmol/L以及50 mmol/L咪唑洗脫液都不會(huì)洗脫目的蛋白，并可以洗脫少量雜蛋白（圖3）。對(duì)于PurR蛋白，200 mmol/L咪唑洗脫液就可以得到較高濃度的目的蛋白（圖3A）；對(duì)于PurL蛋白，咪唑濃度需達(dá)到300 mmol/L時(shí)才可得到較高濃度的蛋白（圖3B），經(jīng)此方法純化的目的蛋白條帶較單一，純度較高。Bradford蛋白質(zhì)量濃度測定試劑盒檢測純化后PurR蛋白質(zhì)量濃度為0.74 mg/mL，PurL蛋白質(zhì)量濃度為3.8 mg/mL，這是由于PurR蛋白是對(duì)破壁后的上清液進(jìn)行純化，但部分PurR蛋白以包涵體形式存在，純化過程中會(huì)有部分損失，且在濃縮過程中濃度增加會(huì)有析出。

圖 3 PurR蛋白（A）和PurL蛋白（B）經(jīng)不同咪唑濃度洗脫液洗脫的目的蛋白SDS-PAGEFig. 3 SDS-PAGE analysis of purified PruR (A) and PurL (B) with different concentrations of imidazole as eluent

2.4 BLI實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖 4 啟動(dòng)子與重組蛋白的結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig. 4 BLI results for binding between promoters and recombinant proteins

單濃度預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，plnE啟動(dòng)子與PurR蛋白和PurL蛋白可能存在結(jié)合作用，plnG啟動(dòng)子與PurR蛋白可能存在結(jié)合作用，plnG啟動(dòng)子與PurL不存在結(jié)合作用。所以對(duì)3 組可能存在相互作用的啟動(dòng)子與表達(dá)蛋白進(jìn)一步進(jìn)行濃度梯度實(shí)驗(yàn)，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整固化物PurR蛋白質(zhì)量濃度為25 μg/mL，PurL蛋白質(zhì)量濃度為160 μg/mL，分析物DNA濃度梯度為86.2、43.1、21.5、10.75、5.37 nmol/L。在association步驟以及dissociation步驟曲線平直，且DNA濃度不同時(shí)，結(jié)合與解離曲線基本重合，3 組濃度梯度實(shí)驗(yàn)均沒有濃度依賴的結(jié)合解離過程（圖4），沒有觀察到PurR和PurL蛋白與plnE啟動(dòng)子和plnG啟動(dòng)子的直接相互作用。

2.5 EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果

EMSA檢測PurR、PurL蛋白與plnE、plnG啟動(dòng)子的結(jié)合作用發(fā)現(xiàn)，與不加蛋白的對(duì)照組（泳道1）相比，無論何種蛋白質(zhì)量濃度，DNA條帶均沒有出現(xiàn)滯后現(xiàn)象，沒有出現(xiàn)蛋白與啟動(dòng)子片段結(jié)合的條帶（圖5）。結(jié)合BLI實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)通過原核表達(dá)得到的PurR和PurL蛋白在體外沒有觀察到與植物乳桿菌KLDS1.0391細(xì)菌素合成調(diào)控區(qū)域的plnE和plnG啟動(dòng)子直接的相互作用。

圖 5 重組蛋白與啟動(dòng)子結(jié)合的EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig. 5 EMSA results for recombinant proteins binding to promoters

3 討 論

研究表明，PlnC和PlnD是一對(duì)反應(yīng)調(diào)節(jié)器，能夠調(diào)控植物乳桿菌細(xì)菌素的合成，磷酸化的PlnC和PlnD能夠結(jié)合到調(diào)控細(xì)菌素合成基因簇的啟動(dòng)子上，激活或抑制細(xì)菌素合成相關(guān)基因的表達(dá)[31]。對(duì)植物乳桿菌KLDS1.0391鹽脅迫的初步研究發(fā)現(xiàn)，低濃度鹽能夠促進(jìn)細(xì)菌素合成，但作用機(jī)制尚不明確，已有的細(xì)菌素調(diào)控機(jī)制無法解釋這種現(xiàn)象，在這一過程中是否存在其他相關(guān)調(diào)控蛋白與細(xì)菌素合成調(diào)控區(qū)域結(jié)合進(jìn)而控制細(xì)菌素的合成尚不清楚。研究調(diào)控蛋白與核酸的結(jié)合作用，能夠更深入地理解基因表達(dá)調(diào)控過程，從分子層面進(jìn)一步解釋微生物的各種生理活動(dòng)。目前研究調(diào)控蛋白與核酸相互作用的實(shí)驗(yàn)方法主要有體外與體內(nèi)研究方法。徐會(huì)永[32]通過EMSA實(shí)驗(yàn)證明通過原核表達(dá)的LeClp蛋白與pks/nrps基因的啟動(dòng)子在體外具有結(jié)合作用；張良林等[26]通過BLI技術(shù)，在體外研究了原核表達(dá)的HetR蛋白與其靶DNA（PhetP與PhetZ）的結(jié)合情況及其結(jié)合親和力。體外實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛑庇^地顯示蛋白與核酸是否具有結(jié)合作用，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖峭ㄟ^體外研究方法進(jìn)行初步探究。在作用蛋白的確定上，本實(shí)驗(yàn)基于課題組前期的轉(zhuǎn)錄組測序分析，在低濃度鹽脅迫條件下，purR與purL基因表達(dá)量顯著下調(diào)，并且已有研究也表明purR基因在微生物的許多生理活動(dòng)中起調(diào)控作用，具有全局調(diào)控機(jī)制；purL基因與微生物的生理活動(dòng)也有著密切關(guān)系，解淀粉芽孢桿菌purL基因突變株的細(xì)菌素合成量顯著升高，推測其對(duì)細(xì)菌素合成具有調(diào)控作用?；谝陨显颍狙芯肯韧ㄟ^體外實(shí)驗(yàn)研究purR與purL基因?qū)χ参锶闂U菌細(xì)菌素合成的調(diào)控作用。

通過基因重組技術(shù)，體外成功合成了PurR和PurL蛋白，為其體外與啟動(dòng)子的結(jié)合作用實(shí)驗(yàn)提供支撐。在BLI實(shí)驗(yàn)時(shí)，通常選擇對(duì)DNA進(jìn)行biotin修飾，將生物素化的DNA固化在SA傳感器上，將蛋白作為分析物，但在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)帶有His標(biāo)簽的PurR和PurL蛋白與SA傳感器具有非特異性結(jié)合，通過加入BSA與Tween 20無法消除存在的非特異性結(jié)合，所以不能選擇SA傳感器進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Ni-NTA傳感器能夠捕獲帶有His標(biāo)簽的分子，所以嘗試將帶His標(biāo)簽的蛋白固化在Ni-NTA傳感器上，將DNA作為分析物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果沒有觀察到PurR蛋白和PurL蛋白與植物乳桿菌KLDS1.0391細(xì)菌素合成啟動(dòng)子直接的結(jié)合作用。BLI技術(shù)通過檢測生物傳感器底部膜厚度的變化，計(jì)算分子間的相互作用強(qiáng)度，將DNA作為分析物，結(jié)合在傳感器底部，并不能引起較大膜層厚度的改變，因此還需要通過其他實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。進(jìn)一步EMSA實(shí)驗(yàn)，PurR和PurL蛋白與植物乳桿菌KLDS1.0391細(xì)菌素合成啟動(dòng)子也無直接的結(jié)合作用，所以體外實(shí)驗(yàn)表明，purR和purL基因可能并不直接參與細(xì)菌素合成的調(diào)控。有研究表明，乳酸乳球菌中的purR與枯草芽孢桿菌中的purR同源，后者是轉(zhuǎn)錄抑制蛋白，前者是轉(zhuǎn)錄激活蛋白[5]，在植物乳桿菌KLDS1.0391中，推測purR也起轉(zhuǎn)錄激活作用，purR表達(dá)量下調(diào)引起purL等基因的表達(dá)下調(diào)，purL基因的表達(dá)量降低會(huì)影響焦磷酸硫胺素（thiamine pyrophosphate，TPP）與肌苷一磷酸（inosine monophosphate，IMP）的合成，Liu Quanli等[15]研究表明，解淀粉芽孢桿菌中purL基因突變株的TPP與IMP合成均受到抑制，菌株抑菌能力增加，向底物中添加TPP后菌株抑菌能力恢復(fù)到與野生菌株相同水平。因此，在2% NaCl脅迫條件下，植物乳桿菌KLDS1.0391中purR和purL表達(dá)量降低，推測有可能對(duì)細(xì)菌素合成量升高起到間接的調(diào)控作用。但是蛋白調(diào)控過程是一個(gè)涉及到菌體內(nèi)多種因素的復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過程，菌體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，菌體外研究所得到的結(jié)果不一定能真實(shí)反映菌體內(nèi)的結(jié)合情況，還需進(jìn)一步研究菌體內(nèi)兩種蛋白是否具有結(jié)合能力以及兩種蛋白是否參與細(xì)菌素合成的調(diào)控。

4 結(jié) 論

體外成功構(gòu)建重組蛋白PurR和PurL，EMSA實(shí)驗(yàn)以及BLI技術(shù)結(jié)果表明，2 個(gè)重組蛋白與植物乳桿菌KLDS1.0391細(xì)菌素合成基因的啟動(dòng)子在菌體外無直接結(jié)合作用，在菌體內(nèi)的情況以及2 種蛋白對(duì)細(xì)菌素合成的調(diào)控是否屬于間接調(diào)控作用，需進(jìn)一步研究。