李欣芮,趙 桉,范小飄,高文文,尚佳萃,趙鵬昊,趙 樂,周 雪,孟祥晨
(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150030)
植物乳桿菌KLDS1.0391分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品,能代謝產(chǎn)生對革蘭氏陽性菌和陰性菌都有抑制作用的細(xì)菌素[1],2% NaCl脅迫可促進(jìn)其細(xì)菌素合成[2],轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明,鹽脅迫時purR基因和purL基因表達(dá)顯著下調(diào),推測其可能參與細(xì)菌素合成的調(diào)控作用。
purR基因編碼的PurR蛋白是嘌呤從頭生物合成途徑中的阻遏蛋白,對嘌呤生物合成途徑中11 個pur系列的結(jié)構(gòu)基因具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。不同細(xì)菌中pur基因的分布和調(diào)控遵循不同的規(guī)則[3],在革蘭氏陰性菌大腸桿菌中,嘌呤生物合成基因散布在染色體各處,在革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌中,所有參與嘌呤合成的基因都分布在一個轉(zhuǎn)錄單元,即嘌呤操縱子[4]。關(guān)于植物乳桿菌purR的研究較少,但有研究表明乳酸乳球菌中的purR與枯草芽孢桿菌中的purR同源[5]。許多代謝調(diào)節(jié)蛋白具有雙重功能甚至是未被發(fā)現(xiàn)的功能,purR基因除對嘌呤生物合成具有重要的調(diào)控作用外,還對嘧啶合成途徑中的pyrC與pyrD基因、與Cysosine轉(zhuǎn)運吸收有關(guān)的codBA基因、編碼5-磷酸核糖焦磷酸合成酶的prs基因以及甘氨酸合成代謝和一碳單位合成的glyA基因和gcv操縱子等具有調(diào)控作用[6-7]。除此之外,近年研究表明,金黃色葡萄球菌中purR突變增強(qiáng)了其致病力[8],進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),purR突變體表現(xiàn)出的毒力增加與嘌呤合成無關(guān),PurR能夠結(jié)合并調(diào)節(jié)嘌呤生物合成途徑之外的啟動子元件,作為一種轉(zhuǎn)錄因子,直接結(jié)合至毒力基因的啟動子,調(diào)節(jié)毒力相關(guān)基因的表達(dá)[9]。因此,PurR可能存在尚未被開發(fā)的功能。
purL基因也參與嘌呤生物合成途徑,對于腺嘌呤和硫胺素的生物合成是必需的。Hava等[10]已經(jīng)證明其是肺炎鏈球菌中重要的毒力因子;Xia Yanfei等[11]研究發(fā)現(xiàn)由purL基因調(diào)控的嘌呤生物合成中間體可以影響枯草芽孢桿菌OKB105菌株的殺蟲活性;Alcantara等[12]發(fā)現(xiàn)purL基因突變會顯著降低流產(chǎn)布魯氏菌(Brucella abortus)的毒性;Maegawa等[13]報道了艱難梭菌(Clostridium difficile)毒素的產(chǎn)生與PurL底物的積累呈反比;Ge Xiuchun等[14]也發(fā)現(xiàn)purL基因與鏈球菌的生物膜形成有關(guān);Liu Quanli等[15]還發(fā)現(xiàn)purL基因突變的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens),其細(xì)菌素Subltilosin A的產(chǎn)量增加顯著,抑菌能力增強(qiáng)??梢?,purL基因與微生物的生理活動有密切關(guān)系。
植物乳桿菌KLDS1.0391全基因組測序以及BLAST分析發(fā)現(xiàn)[16],該菌包含4 個與細(xì)菌素合成相關(guān)的操縱子plnEFI、plnBD、plnGHSTUVW及plnXY,不同植物乳桿菌pln基因簇結(jié)構(gòu)相似但不完全相同,但是所有的pln基因簇都具有非常相似的啟動子,每個操縱子的啟動子由2 個半保守的直接重復(fù)序列組成[17],通過全基因組測序結(jié)果可以比對獲得植物乳桿菌KLDS1.0391中的plnE和plnG啟動子[18]。
用于研究啟動子與調(diào)控蛋白相互作用的常用方法有凝膠阻滯實驗(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)[19-20]、DNase I足跡法[21-22]、染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)[23-25]以及近幾年發(fā)展起來的生物膜干涉(bio-layer interferometry,BLI)技術(shù)[26-27]等,能夠檢測啟動子核酸靶標(biāo)與蛋白相互作用以及檢測二者之間的結(jié)合以及解離常數(shù)等。
本研究主要目的是通過體外分子相互作用的方法探究PurR和PurL蛋白能否與植物乳桿菌KLDS1.0391啟動子相結(jié)合,進(jìn)而判斷這兩個蛋白是否直接參與細(xì)菌素合成的調(diào)控。
1.1.1 菌株與質(zhì)粒
植物乳桿菌KLDS1.0391為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室保藏;pMD?19-T克隆載體、大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞 寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;pQE-30表達(dá)載體、大腸桿菌M15感受態(tài)細(xì)胞華越洋生物(北京)科技有限公司。
1.1.2 試劑與培養(yǎng)基
質(zhì)粒小提試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、通用型DNA純化回收試劑盒、TaqDNA Polymerase、D2000 DNA Marker 天根生化科技(北京)有限公司;PrimeSTAR?HS DNA Polymerase、DL5000 DNA Marker、DNA Ligation Kit、限制性內(nèi)切酶KpnI、BamHI、HindIII 寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;卡那霉素(Kana)、氨芐青霉素(Amp)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG) 美國Amresco公司;Bradford蛋白質(zhì)量濃度測定試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)凝膠快速配制試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)、Annealing Buffer for DNA Oligos(5×)、EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5×) 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;預(yù)染彩虹蛋白Marker(10~190 kDa) 大連美侖生物技術(shù)有限公司;HisSep Ni-NTA Agarose Resin上海翊圣生物科技有限公司;牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA) 美國Sigma公司;其他試劑為國產(chǎn)分析純。
LB培養(yǎng)基及MRS培養(yǎng)基配制方法參照文獻(xiàn)[28-29]。
梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀 德國耶拿分析儀器股份公司;DYY-10C型電泳儀 北京市六一儀器廠;凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP公司;QuickDrop超微量核酸蛋白分析儀、SpectraMax i3x多功能酶標(biāo)儀、Octet RED96e分子互作分析系統(tǒng)美谷分子儀器(上海)有限公司;超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司;蛋白純化柱 美國Thermo Fisher公司;蛋白質(zhì)電泳儀、GelDoc EZ凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。
1.3.1 引物的設(shè)計與合成
根據(jù)植物乳桿菌KLDS1.0391全基因組測序結(jié)果得到的purR和purL的基因序列,以及表達(dá)載體pQE-30質(zhì)粒所包含的酶切位點,應(yīng)用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計引物。在purR基因上下游引物的5’端分別引入限制性內(nèi)切酶KpnI和HindIII的酶切位點以及相應(yīng)的保護(hù)堿基,purR基因上游引物(FR)為5’-GGGGTACCATGAAAGTACGTA GAAGCGAACG-3’(下劃線是KpnI酶切位點),下游引物(RR)為5’-CCCAAGCTTCTAGACTTCCGCACCGAA AAC-3’(下劃線是HindIII酶切位點);在purL基因上下游引物的5’端分別引入限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII的酶切位點以及相應(yīng)的保護(hù)堿基,purL基因上游引物(FL)為5’-CGCGGATCCATGCTTAAAAAGCAACCATTATC-3’(下劃線是BamHI酶切位點),下游引物(RL)為5’-C CCAAGCTTTTACTTCAGTAGGCATGGTAAGG-3’(下劃線是HindIII酶切位點)。引物由吉林庫美生物科技有限公司合成。
1.3.2 重組克隆載體的構(gòu)建與鑒定
用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取植物乳桿菌KLDS1.0391基因組DNA作為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。purR基因的擴(kuò)增體系:DNA模板1 μL,上下游引物(10 μmol/L)各2 μL,高保真酶PrimeSTAR?HS DNA Polymerase(2.5 U/μL)0.5 μL,5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+plus)10 μL,dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)4 μL,dd H2O 30.5 μL,總體系50 μL。擴(kuò)增過程:94 ℃預(yù)變性3 min,98 ℃變性10 s,63 ℃退火15 s,72 ℃延伸1 min,30 個循環(huán);72 ℃延伸10 min。purL基因擴(kuò)增退火溫度為60 ℃,其余均與purR基因的擴(kuò)增過程相同。擴(kuò)增后使用通用型DNA純化回收試劑盒回收目的基因,在目的基因3’端加A堿基后,與克隆載體pMD 19-T simple按一定比例混合,于16 ℃連接,通過熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含有Amp的平板上,提取陽性菌落的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,鑒定正確的重組子進(jìn)行測序鑒定,分別命名為pMD 19-T simple-purR和pMD 19-T simple-purL。
1.3.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
用質(zhì)粒小提試劑盒提取堅定正確的質(zhì)粒pMD 19-T simple-purR和pMD 19-T simple-purL,前者用KpnI和HindIII進(jìn)行分步酶切,后者用BamHI和HindIII進(jìn)行分步酶切,酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,切膠回收目的基因purR和purL。將回收的目的基因與用相同酶處理后的pQE-30質(zhì)粒按一定比例混合,于16 ℃連接,通過熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌M15感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含有Amp以及Kana的平板上,提取陽性菌落的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,鑒定正確的重組子進(jìn)行測序鑒定,分別命名為pQE-30-purR和pQE-30-purL。
1.3.4 PurR蛋白和PurL蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定
將鑒定正確的菌株pQE-30-purR和pQE-30-purL分別接種于含Amp 100 μg/mL和Kana 25 μg/mL的LB培養(yǎng)基中,37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)至菌液OD600nm達(dá)到0.6~0.8時,加入IPTG(終濃度為0.5 mmol/L)進(jìn)行蛋白表達(dá),隔2 h取菌液離心收集菌體,菌體用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌后加入1/10原體積的PBS進(jìn)行重懸,加入SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸后用于SDS-PAGE分析。
1.3.5 PurR蛋白和PurL蛋白的純化與透析
PurR蛋白的純化與透析:按1%接種量將菌株pQE-30-purR接種至100 mL含Amp 100 μg/mL和Kana 25 μg/mL的LB培養(yǎng)基中,37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)至菌液OD600nm達(dá)到0.6~0.8時,加入IPTG(終濃度為0.5 mmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)6 h,8 000 r/min離心5 min收集菌體,PBS洗滌2 次后,加入10 mL裂解液(20 mmol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl、20 mmol/L咪唑,pH 7.9)進(jìn)行超聲破壁處理(130 W 40%的功率,超聲5 s,靜置5 s),直至菌液澄清不黏稠,全程冰上操作。破壁后的菌液12 000 r/min離心10 min取上清液,上清液過0.45 μm濾膜后,加入平衡好的Ni-NTA純化柱中,輕輕攪動,室溫孵育0.5~1 h,用梯度咪唑濃度洗脫液(20 mmol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl,咪唑濃度分別為20、50、100、150、200、300、500 mmol/L,pH 7.9)洗脫并回收PurR蛋白。純化后的PurR蛋白加入準(zhǔn)備好的透析袋中,于透析液(20 mmol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl,pH 7.9)中透析除去咪唑。
PurL蛋白的純化與透析:收集菌體后,加入10 mL PBS重懸,進(jìn)行超聲破壁處理。破壁后的菌液12 000 r/min離心10 min棄上清液,沉淀用PBS洗滌2 次后,加入包涵體溶解液(20 mmol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl、8 mol/L尿素,pH 7.9)徹底溶解,過0.45 μm濾膜后,加入平衡好的Ni-NTA純化柱中,輕輕攪動,室溫孵育0.5~1 h,用梯度咪唑濃度洗脫液(20 mmol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl、8 mol/L尿素,咪唑濃度分別為20、50、100、150、200、300、500 mmol/L,pH 7.9)洗脫并回收PurL蛋白。純化后的PurL蛋白加入準(zhǔn)備好的透析袋中,不斷降低透析液中的尿素濃度,使包涵體復(fù)性,最終透析至PBS中。
1.3.6 PurR蛋白和PurL蛋白的濃縮與定量
分別用10 kDa和30 kDa的超濾管濃縮PurR蛋白和PurL蛋白,12 000 r/min、4 ℃離心。濃縮后的蛋白用Bradford蛋白質(zhì)量濃度測定試劑盒測定其濃度(標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液與蛋白緩沖溶液保持一致)。
1.3.7 BLI實驗
1.3.7.1 Biotin-DNA制備
plnE啟動子的序列為5’-ACATTGGTATTTGAC GTTAAGAGAACGTTTTTTTACTTTTATAATTTTT TCAACAATCTGGTAAAA-3’,plnG啟動子的序列為5’-AAGCCTGATGAGGACATTTATCATAAAATTA TGTACGTTAATAGATAGTTGGCATACGATAACA TT-3’,均采用5’-biotin標(biāo)記的方法。biotin-ss DNA與非標(biāo)記的ss DNA均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,biotin-ss DNA與非標(biāo)記的ss DNA退火形成biotin-ds DNA。退火體系:Nuclease-Free Water 40 μL,Annealing Buffer for DNA Oligos(5×)20 μL,DNA oligo A(50 μmol/L)20 μL,DNA oligo B(50 μmol/L)20 μL,總體積100 μL。退火程序:95 ℃、2 min;95 ℃、1.5 min;-1 ℃/cycle;70 個循環(huán);16 ℃保存。
1.3.7.2 Octet RED96e分子互作分析系統(tǒng)上機(jī)實驗
將NTA傳感器插入PBS中預(yù)濕10 min以上,第1步將傳感器轉(zhuǎn)入A Buffer(PBS)中進(jìn)行第1次基線步驟(baseline 1),第2步將傳感器轉(zhuǎn)入用A Buffer稀釋的PurL蛋白溶液(終質(zhì)量濃度為160 μg/mL)中進(jìn)行蛋白固化步驟(loading),第3步將傳感器轉(zhuǎn)入B Buffer(PBS+0.02% Tween+0.1% BSA)中進(jìn)行第2次基線步驟(baseline 2),第4步將傳感器轉(zhuǎn)入用B Buffer稀釋的DNA溶液中進(jìn)行結(jié)合步驟(association),第5步將傳感器轉(zhuǎn)回B Buffer中進(jìn)行解離步驟(dissociation)。各步驟的時間根據(jù)基線平衡情況以及固化情況進(jìn)行調(diào)整。PurR蛋白實驗時將第1步與第2步中的A Buffer換為C Buffer(20 mmol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl),蛋白固化步驟中PurR蛋白溶液終質(zhì)量濃度為25 μg/mL。實驗設(shè)置DNA濃度梯度為86.2、43.1、21.5、10.75、5.37 nmol/L。
1.3.8 EMSA實驗
參考文獻(xiàn)[30]并進(jìn)行部分調(diào)整。通過PCR擴(kuò)增啟動子序列,純化回收后測定核酸濃度。蛋白和DNA結(jié)合反應(yīng)體系中,5×EMSA結(jié)合緩沖液3 μL,DNA片段200~250 ng,不同濃度梯度純化后的蛋白,加入ddH2O補(bǔ)足至15 μL。室溫放置30 min后,加入2 μL EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液進(jìn)行非變性蛋白電泳,結(jié)束后GelRed染色并用凝膠成像儀觀察。
圖 1 重組克隆質(zhì)粒以及重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定Fig. 1 Identification of recombinant cloned plasmids and recombinant expression plasmids by enzymatic digestion
針對構(gòu)建的克隆載體pMD 19-T simple-purR和pMD 19-T simple-purL以及表達(dá)載體pQE-30-purR和pQE-30-purL,用相應(yīng)的酶分別進(jìn)行分步酶切鑒定,電泳結(jié)果顯示有兩條明亮條帶(圖1)。用pMD 19-T simple通用引物以及pQE-30測序引物進(jìn)行測序,測序結(jié)果用BLAST工具與全基因組測序結(jié)果進(jìn)行比對,序列完全一致,表明克隆載體pMD 19-T simple-purR和pMD 19-T simple-purL,以及表達(dá)載體pQE-30-purR和pQE-30-purL已成功構(gòu)建。
圖 2 PurR蛋白(A)和PurL蛋白(B)的SDS-PAGEFig. 2 SDS-PAGE analysis of expressed recombinant PruR (A) and PurL (B)
如圖2所示,與未誘導(dǎo)的菌體蛋白相比(泳道1),加入IPTG誘導(dǎo)劑后的菌體蛋白(2~7泳道)在箭頭處出現(xiàn)明顯的蛋白條帶,與軟件預(yù)測大小相近,PurR蛋白和PurL蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功。并且隨誘導(dǎo)時間的延長,重組蛋白的表達(dá)量增加,誘導(dǎo)6 h的PurR蛋白和PurL蛋白表達(dá)量較高,6 h后蛋白表達(dá)量增加不明顯,所以確定PurR蛋白和PurL蛋白的誘導(dǎo)時間為6 h。
20 mmol/L以及50 mmol/L咪唑洗脫液都不會洗脫目的蛋白,并可以洗脫少量雜蛋白(圖3)。對于PurR蛋白,200 mmol/L咪唑洗脫液就可以得到較高濃度的目的蛋白(圖3A);對于PurL蛋白,咪唑濃度需達(dá)到300 mmol/L時才可得到較高濃度的蛋白(圖3B),經(jīng)此方法純化的目的蛋白條帶較單一,純度較高。Bradford蛋白質(zhì)量濃度測定試劑盒檢測純化后PurR蛋白質(zhì)量濃度為0.74 mg/mL,PurL蛋白質(zhì)量濃度為3.8 mg/mL,這是由于PurR蛋白是對破壁后的上清液進(jìn)行純化,但部分PurR蛋白以包涵體形式存在,純化過程中會有部分損失,且在濃縮過程中濃度增加會有析出。
圖 3 PurR蛋白(A)和PurL蛋白(B)經(jīng)不同咪唑濃度洗脫液洗脫的目的蛋白SDS-PAGEFig. 3 SDS-PAGE analysis of purified PruR (A) and PurL (B) with different concentrations of imidazole as eluent
圖 4 啟動子與重組蛋白的結(jié)合實驗結(jié)果Fig. 4 BLI results for binding between promoters and recombinant proteins
單濃度預(yù)實驗結(jié)果表明,plnE啟動子與PurR蛋白和PurL蛋白可能存在結(jié)合作用,plnG啟動子與PurR蛋白可能存在結(jié)合作用,plnG啟動子與PurL不存在結(jié)合作用。所以對3 組可能存在相互作用的啟動子與表達(dá)蛋白進(jìn)一步進(jìn)行濃度梯度實驗,根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果調(diào)整固化物PurR蛋白質(zhì)量濃度為25 μg/mL,PurL蛋白質(zhì)量濃度為160 μg/mL,分析物DNA濃度梯度為86.2、43.1、21.5、10.75、5.37 nmol/L。在association步驟以及dissociation步驟曲線平直,且DNA濃度不同時,結(jié)合與解離曲線基本重合,3 組濃度梯度實驗均沒有濃度依賴的結(jié)合解離過程(圖4),沒有觀察到PurR和PurL蛋白與plnE啟動子和plnG啟動子的直接相互作用。
EMSA檢測PurR、PurL蛋白與plnE、plnG啟動子的結(jié)合作用發(fā)現(xiàn),與不加蛋白的對照組(泳道1)相比,無論何種蛋白質(zhì)量濃度,DNA條帶均沒有出現(xiàn)滯后現(xiàn)象,沒有出現(xiàn)蛋白與啟動子片段結(jié)合的條帶(圖5)。結(jié)合BLI實驗結(jié)果,發(fā)現(xiàn)通過原核表達(dá)得到的PurR和PurL蛋白在體外沒有觀察到與植物乳桿菌KLDS1.0391細(xì)菌素合成調(diào)控區(qū)域的plnE和plnG啟動子直接的相互作用。
圖 5 重組蛋白與啟動子結(jié)合的EMSA實驗結(jié)果Fig. 5 EMSA results for recombinant proteins binding to promoters
研究表明,PlnC和PlnD是一對反應(yīng)調(diào)節(jié)器,能夠調(diào)控植物乳桿菌細(xì)菌素的合成,磷酸化的PlnC和PlnD能夠結(jié)合到調(diào)控細(xì)菌素合成基因簇的啟動子上,激活或抑制細(xì)菌素合成相關(guān)基因的表達(dá)[31]。對植物乳桿菌KLDS1.0391鹽脅迫的初步研究發(fā)現(xiàn),低濃度鹽能夠促進(jìn)細(xì)菌素合成,但作用機(jī)制尚不明確,已有的細(xì)菌素調(diào)控機(jī)制無法解釋這種現(xiàn)象,在這一過程中是否存在其他相關(guān)調(diào)控蛋白與細(xì)菌素合成調(diào)控區(qū)域結(jié)合進(jìn)而控制細(xì)菌素的合成尚不清楚。研究調(diào)控蛋白與核酸的結(jié)合作用,能夠更深入地理解基因表達(dá)調(diào)控過程,從分子層面進(jìn)一步解釋微生物的各種生理活動。目前研究調(diào)控蛋白與核酸相互作用的實驗方法主要有體外與體內(nèi)研究方法。徐會永[32]通過EMSA實驗證明通過原核表達(dá)的LeClp蛋白與pks/nrps基因的啟動子在體外具有結(jié)合作用;張良林等[26]通過BLI技術(shù),在體外研究了原核表達(dá)的HetR蛋白與其靶DNA(PhetP與PhetZ)的結(jié)合情況及其結(jié)合親和力。體外實驗?zāi)軌蛑庇^地顯示蛋白與核酸是否具有結(jié)合作用,本實驗?zāi)康氖峭ㄟ^體外研究方法進(jìn)行初步探究。在作用蛋白的確定上,本實驗基于課題組前期的轉(zhuǎn)錄組測序分析,在低濃度鹽脅迫條件下,purR與purL基因表達(dá)量顯著下調(diào),并且已有研究也表明purR基因在微生物的許多生理活動中起調(diào)控作用,具有全局調(diào)控機(jī)制;purL基因與微生物的生理活動也有著密切關(guān)系,解淀粉芽孢桿菌purL基因突變株的細(xì)菌素合成量顯著升高,推測其對細(xì)菌素合成具有調(diào)控作用。基于以上原因,本研究先通過體外實驗研究purR與purL基因?qū)χ参锶闂U菌細(xì)菌素合成的調(diào)控作用。
通過基因重組技術(shù),體外成功合成了PurR和PurL蛋白,為其體外與啟動子的結(jié)合作用實驗提供支撐。在BLI實驗時,通常選擇對DNA進(jìn)行biotin修飾,將生物素化的DNA固化在SA傳感器上,將蛋白作為分析物,但在實驗過程中發(fā)現(xiàn)帶有His標(biāo)簽的PurR和PurL蛋白與SA傳感器具有非特異性結(jié)合,通過加入BSA與Tween 20無法消除存在的非特異性結(jié)合,所以不能選擇SA傳感器進(jìn)行實驗。Ni-NTA傳感器能夠捕獲帶有His標(biāo)簽的分子,所以嘗試將帶His標(biāo)簽的蛋白固化在Ni-NTA傳感器上,將DNA作為分析物進(jìn)行實驗,結(jié)果沒有觀察到PurR蛋白和PurL蛋白與植物乳桿菌KLDS1.0391細(xì)菌素合成啟動子直接的結(jié)合作用。BLI技術(shù)通過檢測生物傳感器底部膜厚度的變化,計算分子間的相互作用強(qiáng)度,將DNA作為分析物,結(jié)合在傳感器底部,并不能引起較大膜層厚度的改變,因此還需要通過其他實驗進(jìn)一步驗證。進(jìn)一步EMSA實驗,PurR和PurL蛋白與植物乳桿菌KLDS1.0391細(xì)菌素合成啟動子也無直接的結(jié)合作用,所以體外實驗表明,purR和purL基因可能并不直接參與細(xì)菌素合成的調(diào)控。有研究表明,乳酸乳球菌中的purR與枯草芽孢桿菌中的purR同源,后者是轉(zhuǎn)錄抑制蛋白,前者是轉(zhuǎn)錄激活蛋白[5],在植物乳桿菌KLDS1.0391中,推測purR也起轉(zhuǎn)錄激活作用,purR表達(dá)量下調(diào)引起purL等基因的表達(dá)下調(diào),purL基因的表達(dá)量降低會影響焦磷酸硫胺素(thiamine pyrophosphate,TPP)與肌苷一磷酸(inosine monophosphate,IMP)的合成,Liu Quanli等[15]研究表明,解淀粉芽孢桿菌中purL基因突變株的TPP與IMP合成均受到抑制,菌株抑菌能力增加,向底物中添加TPP后菌株抑菌能力恢復(fù)到與野生菌株相同水平。因此,在2% NaCl脅迫條件下,植物乳桿菌KLDS1.0391中purR和purL表達(dá)量降低,推測有可能對細(xì)菌素合成量升高起到間接的調(diào)控作用。但是蛋白調(diào)控過程是一個涉及到菌體內(nèi)多種因素的復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過程,菌體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜,菌體外研究所得到的結(jié)果不一定能真實反映菌體內(nèi)的結(jié)合情況,還需進(jìn)一步研究菌體內(nèi)兩種蛋白是否具有結(jié)合能力以及兩種蛋白是否參與細(xì)菌素合成的調(diào)控。
體外成功構(gòu)建重組蛋白PurR和PurL,EMSA實驗以及BLI技術(shù)結(jié)果表明,2 個重組蛋白與植物乳桿菌KLDS1.0391細(xì)菌素合成基因的啟動子在菌體外無直接結(jié)合作用,在菌體內(nèi)的情況以及2 種蛋白對細(xì)菌素合成的調(diào)控是否屬于間接調(diào)控作用,需進(jìn)一步研究。