陳怡博，劉媛，陳銳*，曹蕓花，韓豪

1(陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中，723000)2(西安市閻良區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局，陜西 西安，710089)

略陽(yáng)烏雞又叫黑河烏雞，是陜西漢中地區(qū)略陽(yáng)縣的一個(gè)獨(dú)立烏雞品種。在全國(guó)四大烏雞中，略陽(yáng)烏雞體形最大、雞肉細(xì)嫩、味醇香、營(yíng)養(yǎng)豐富，烏皮、烏腿、烏趾、烏喙、烏舌、烏冠的“六端烏”特征，是在當(dāng)?shù)鬲?dú)特的地理環(huán)境條件下經(jīng)人們長(zhǎng)期馴化和半野生放養(yǎng)形成的一種古老的優(yōu)良地方肉用型雞種[1-2]。

早期研究發(fā)現(xiàn)，生肉中前體物質(zhì)綜合呈現(xiàn)出既咸又腥的滋味，當(dāng)給予加熱、烘烤等一定的條件時(shí)，這些物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)生成新的呈味物質(zhì)，賦予肉香味，也就是風(fēng)味[3-5]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于如何提高畜禽肉質(zhì)風(fēng)味做了大量的實(shí)驗(yàn)研究，在眾多禽畜肉質(zhì)風(fēng)味的評(píng)價(jià)指標(biāo)中，肌苷酸是研究者們公認(rèn)的禽畜肉質(zhì)鮮味最重要的表達(dá)及檢測(cè)物質(zhì)[6-10]。

紙電泳法、紫外吸收相結(jié)合法、薄層層析法是早期研究者們測(cè)定肌苷酸所使用的主要方法[11-13]。目前，具有高效、快速、準(zhǔn)確的高效液相色譜法已廣泛用于肌苷酸的檢測(cè)分析[14-16]。本實(shí)驗(yàn)選用高效液相色譜法測(cè)定略陽(yáng)烏雞肌肉肌苷酸含量，選取4種樣品前處理方法，探索肌肉中肌苷酸的提取效率。通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到最佳的高效液相色譜條件，建立了略陽(yáng)烏雞肌肉肌苷酸準(zhǔn)確度與靈敏性高的檢測(cè)方法，為其方法學(xué)的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

略陽(yáng)烏雞，陜西百味園網(wǎng)絡(luò)科技有限公司；三乙胺(色譜純)，麥克林公司；甲醇(色譜純)，Merck公司；H3PO4(色譜純)、KH2PO4、四丁基硫酸氫銨，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；肌苷酸標(biāo)品(純度≥99.9%)，北京中科儀友化工技術(shù)研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

UltiMate3000高效液相色譜儀，戴安公司；AP-OIP真空泵，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；PHS-3C pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SB-100DT超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；TDL-80-2B低速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

取新鮮屠宰的略陽(yáng)烏雞腿部肌肉樣100 g，用剪刀剪碎，每次取樣均為5 g，平行3組。

鮮肉樣品：取樣后加入10 mL 0.05 mol/L磷酸三乙胺(0.05 mol/L磷酸三乙胺：精確量取7 mL H3PO4，加入200 mL超純水和14.4 mL三乙胺，搖勻后加入超純水定容至1 000 mL，用三乙胺調(diào)pH=6.5，0.45 μm水系膜過(guò)濾，超聲脫氣30 min)，打磨至勻漿狀，以3 500 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，提取上清液，重復(fù)3次，用0.05 mol/L磷酸三乙胺定容至50 mL 容量瓶中，超聲提取30 min，待測(cè)。

鮮肉去脂樣：取樣勻漿后，振蕩搖勻，用55 ℃恒溫水浴1 h，靜置30 min，濾掉上清液，收集肉糜，重復(fù)3次；離心提取上清液，重復(fù)3次，定容至50 mL容量瓶中超聲提取30 min，待測(cè)。

冷凍干燥樣：取樣置于干凈的培養(yǎng)皿中，放于冷凍干燥機(jī)中48 h，取出后按制鮮肉方法制樣。

冷凍干燥去脂樣：取樣冷凍干燥后加入等體積的石油醚去脂制樣。

1.3.2 色譜條件

1.3.2.1 色譜柱的選擇

甲醇-磷酸三乙胺(體積比4∶96)；檢測(cè)波長(zhǎng)248 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流速1 mL/min。進(jìn)樣244 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別考察COSMOSIL Packed Column C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；AcclaimTM120 C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)色譜柱對(duì)分離效果的影響。

1.3.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

選定色譜條件為：色譜柱COSMOSIL Packed Column C18(4.6 mm×250 mm,Φ5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-磷酸三乙胺(體積比4∶96)；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流速1 mL/min。進(jìn)樣244 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別考察248、254、270 nm波長(zhǎng)條件下的檢測(cè)結(jié)果。

1.3.2.3 流動(dòng)相的選擇

選定色譜條件為：色譜柱COSMOSIL Packed Column C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)248 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流速1 mL/min。進(jìn)樣244 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別考察甲醇-磷酸三乙胺(體積比4∶96)、甲醇-磷酸三乙胺(體積比5∶95)、甲醇-磷酸三乙胺(體積比3∶97)和磷酸鹽緩沖液(準(zhǔn)確稱取1.360 g磷酸二氫鉀和0.475 3 g四丁基硫酸氫銨，加900 mL超純水，調(diào)pH=3.33，定容至1 000 mL，0.45 μm水系膜過(guò)濾，超聲脫氣30 min)-甲醇(體積比4∶96)的流動(dòng)相體系。

1.3.3 方法學(xué)考察

1.3.3.1 線性考察

準(zhǔn)確稱取肌苷酸標(biāo)準(zhǔn)品6.10 mg，用流動(dòng)相定容到25 mL容量瓶中，濃度為244 μg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別在母液中吸取0.5、1、2、3、4 mL 溶液，用流動(dòng)相定容至10 mL，濃度分別為12.2、24.4、48.8、73.2、97.6 μg/mL，配成肌苷酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

將上述系列標(biāo)準(zhǔn)工作液在選定的色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，在Excel中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

1.3.3.2 精密度考察

以24.4、97.6、244 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液為低中高3個(gè)測(cè)定濃度，在選定的色譜條件下分別連續(xù)進(jìn)樣6針，測(cè)定肌苷酸標(biāo)準(zhǔn)品的精密度。

1.3.3.3 重現(xiàn)性考察

取同一樣品6份，每份5 g，按1.3.1的方法制備樣品溶液，在選定的色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，確定重復(fù)性。

1.3.3.4 穩(wěn)定性考察

取同一份樣品溶液，室溫下放置1、2、4、8、12、24、48 h，在選定的色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，疊加信號(hào)值確定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)值，進(jìn)而確定穩(wěn)定性。

1.3.3.5 檢出限和定量限

將質(zhì)量濃度為244 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋，在選定的色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以S/N的10倍和3倍確定其檢出限和定量限。

1.3.3.6 加標(biāo)回收率考察

稱取5 g肌肉樣品3份，分別加入質(zhì)量濃度為12.2 μg/mL的肌苷酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL，按1.3.1的方法制備樣品溶液，稀釋到標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍內(nèi)，在選定的色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，根據(jù)加標(biāo)前后樣品中肌苷酸濃度和加標(biāo)量，回收率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：A，加標(biāo)試樣測(cè)定值;B，試樣測(cè)定值;C，加標(biāo)量。

1.3.4 四種前處理樣品肌苷酸含量的測(cè)定

樣品肌苷酸含量的計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：m,樣品的肌苷酸含量，g/kg；X,與標(biāo)曲相對(duì)應(yīng)的樣品肌苷酸的濃度，μg/mL；V,樣品液的總體積，mL；Y,所稱取樣品的質(zhì)量,g。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 色譜柱的選擇

由圖1可以看出，COSMOSIL Packed Column C18色譜柱的分離效果最佳。因此本次實(shí)驗(yàn)選取COSMOSIL Packed Column C18色譜柱進(jìn)行測(cè)定分析。

A-AcclaimTM120 C18柱子;B-COSMOSIL Packed Column C18柱子圖1 不同色譜柱下肌苷酸色譜圖Fig.1 Chromatograms of inosinic acid under different chromatographic columns

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

由表1可知，3個(gè)波長(zhǎng)條件下保留時(shí)間相同，在248 nm下的峰面積大，響應(yīng)值高，定量檢測(cè)會(huì)越準(zhǔn)確，因此本次實(shí)驗(yàn)選取248 nm進(jìn)行測(cè)定。

表1 不同波長(zhǎng)條件下的檢測(cè)結(jié)果Table 1 Detection results under different wavelength conditions

2.1.3 流動(dòng)相的選擇

甲醇-磷酸三乙胺和甲醇-磷酸鹽緩沖液兩種流動(dòng)相，以相同的體積比(4∶96)和色譜條件進(jìn)樣后，得到的色譜圖(圖2)。由圖2可知，A圖峰形和檢測(cè)效果較差，可見肌苷酸在磷酸鹽緩沖液-甲醇體系中穩(wěn)定性較差。

選擇甲醇-磷酸三乙胺流動(dòng)相之后，對(duì)其體積比進(jìn)行考察。由表2可知，在甲醇-磷酸三乙胺體積比為4∶96條件下主要的定量指標(biāo)峰面積最大，適合檢測(cè)分析。因此最終選擇甲醇-磷酸三乙胺(體積比4∶96)為流動(dòng)相進(jìn)行本次實(shí)驗(yàn)。

A-磷酸鹽緩沖液-甲醇;B-甲醇-磷酸三乙胺圖2 不同流動(dòng)相下肌苷酸色譜圖Fig.2 Chromatogram of inosinic acid in different mobile phases

表2 不同流動(dòng)相條件下的檢測(cè)結(jié)果Table 2 Test results of different mobile phase conditions

2.1.4 色譜條件的確定

根據(jù)以上數(shù)據(jù)結(jié)果分析，本次實(shí)驗(yàn)最佳的色譜條件為：色譜柱COSMOSIL Packed Column C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；甲醇-磷酸三乙胺(體積比4∶96)；檢測(cè)波長(zhǎng)：248 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流速1 mL/min。樣品梯度洗脫如表3所示。

表3 樣品梯度洗脫結(jié)果Table 3 Gradient elution results of samples

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

2.2.1 線性考察

在2.1.4的色譜條件下以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，肌苷酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=7 152x-1 330，R2=0.999 9，線性范圍12.2～97.6 μg/mL，肌苷酸在該范圍線性良好。

2.2.2 精密度考察

如表4所示，是在肌苷酸濃度分別為24.4、97.6、244 μg/mL連續(xù)進(jìn)樣6針的結(jié)果，3個(gè)濃度下的RSD<5%，精密度良好，均滿足試驗(yàn)方法的測(cè)定要求，且中濃度的RSD值最小，準(zhǔn)確性最高。

表4 不同肌苷酸濃度精密度比較(n=6)Table 4 Comparison of precision of different inosinic acid concentrations(n=6)

2.2.3 重現(xiàn)性考察

如表5所示，通過(guò)疊加峰信號(hào)值得到峰面積RSD，依次通過(guò)1.3.6中公式計(jì)算樣品中肌苷酸的含量，得出RSD為8.58%，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)方法在鮮肉去脂樣的測(cè)定中具有良好的重現(xiàn)性。

表5 重現(xiàn)性考察結(jié)果Table 5 Results of reproducibility investigation

2.2.4 穩(wěn)定性考察

同一份肌肉樣品在常溫下放置7個(gè)時(shí)間段，分別測(cè)定其肌苷酸含量，結(jié)果如表6所示，在12 h內(nèi)的RSD為3.09%，因此所制得的樣品應(yīng)在12 h內(nèi)完成測(cè)定，以保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確度。

表6 穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 6 Results of stability investigation

2.2.5 檢出限和定量限

在2.1.4所確定的最佳色譜條件下對(duì)依次稀釋的母液標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣測(cè)定，最終測(cè)得S/N=10時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度約為0.08 μg/mL，S/N=3時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為0.02 μg/mL，在這2個(gè)濃度條件下進(jìn)樣第2針未出峰，說(shuō)明已達(dá)檢測(cè)限。

2.2.6 加標(biāo)回收率考察

表7為3份鮮肉去脂樣品的加標(biāo)回收率系列測(cè)定值，平均回收率99%，RSD值為2.71%，說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)的方法準(zhǔn)確性高。

表7 加標(biāo)回收率考察結(jié)果Table 7 Investigation results of spiked recovery rate

2.3 四種方法處理后的肌肉樣品肌苷酸的測(cè)定結(jié)果

按照1.3.4的含量計(jì)算公式和2.1.1的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算鮮肉樣品肌苷酸的含量。

樣品色譜圖如圖3所示。圖3-A為鮮肉樣品得到色譜圖，峰面積為8 788 mAu/min，算得樣品的含量為0.014 g/kg；圖3-B為冷凍干燥樣樣品得到色譜圖，峰面積為15 438 mAu/min，計(jì)算得樣品的含量為0.018 g/kg；圖3-C為鮮肉去脂樣樣品得到色譜圖，峰面積為11 592 mAu/min，計(jì)算得樣品的含量為0.023 g/kg；圖3-D為冷凍干燥去脂樣品的色譜圖，峰面積為19 647 mAu/min，計(jì)算得樣品的含量為0.029 g/kg，所得結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。

3 結(jié)論與討論

3.1 色譜方法的優(yōu)化和驗(yàn)證

本次實(shí)驗(yàn)改進(jìn)了高效液相色譜法測(cè)定略陽(yáng)烏雞肌肉肌苷酸的主要測(cè)定條件。采用DIONEX UltiMate3000高效液相色譜儀，依次控制色譜柱、檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相體系和流動(dòng)相比例，進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的分析最終確定了最佳的測(cè)定條件:COSMOSIL Packed Column C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱；甲醇-磷酸三乙胺(體積比4∶96)為流動(dòng)相，柱溫25 ℃, 檢測(cè)波長(zhǎng)248 nm,進(jìn)樣量20 μL。方法的檢測(cè)限分別為0.02、0.08 μg/mL，方法精密度RSD值在0.30%～4.78%；平均回收率99%，RSD值為2.71%；肌苷酸方程線性范圍為12.2～97.6 μg/mL，R2=0.999 9，線性關(guān)系均良好。

A-鮮肉樣品;B-冷凍干燥樣色譜圖;C-鮮肉去脂樣色譜圖;D-冷凍干燥去脂樣色譜圖圖3 樣品色譜圖Fig.3 Sample chromatogram

3.2 樣品處理方法的分析

運(yùn)用HPLC檢測(cè)分析時(shí)，樣品的提取率是最重要的影響因素之一。充分考慮溶劑性質(zhì)、溶液選擇、pH、溫度、樣本處理方式等內(nèi)外因素來(lái)提升提取效率和檢測(cè)的準(zhǔn)確性。因?yàn)樾迈r雞肉中含有大量的脂肪，肌苷酸是屬于水溶性化合物，根據(jù)相似相容原理，如果不脫除脂肪，其提取率就會(huì)降低。因此實(shí)驗(yàn)選擇脫除肌肉脂肪來(lái)前處理樣品，如圖3所示，脫除脂肪的肌肉樣品中肌苷酸的含量比較高，得到了理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3.3 未知峰的分析

王美玲[17]報(bào)道了肌苷酸、鳥苷酸均為嘌呤合成的關(guān)鍵代謝物質(zhì)。肌苷酸為合成鳥苷酸的中間物質(zhì)，谷氨酰胺和PRPP經(jīng)不同的酶催化轉(zhuǎn)化為肌苷酸，再被相應(yīng)的酶催化為鳥苷酸。在另一轉(zhuǎn)化途徑中, 肌苷酸在肌苷酸脫氫酶和鳥苷酸合成酶的作用下生成鳥苷酸[18]。5′-鳥苷酸和5′-肌苷酸是自然界中存在的2種單核苷酸，均具有強(qiáng)烈的呈味作用，在不同的pH、溫度條件下含量表現(xiàn)出差異性[19]。在接近中性條件下，鳥苷酸的溶解性大于肌苷酸；中性pH下熱穩(wěn)定性二者的殘留率均大于90%，穩(wěn)定性較好[20-21]。本次實(shí)驗(yàn)所使用流動(dòng)相的pH值為6.5，偏中性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究報(bào)道相契合。從結(jié)構(gòu)上看，肌苷酸和鳥苷酸結(jié)構(gòu)極為相似，二者結(jié)構(gòu)相差一個(gè)—NH2，鳥苷酸比肌苷酸極性大，極性大的物質(zhì)出峰時(shí)間早，與圖3吻合，由此可推測(cè)未知峰的物質(zhì)為鳥苷酸，有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。