徐霞，倪逸凡，周緒霞，丁玉庭

(浙江工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，浙江 杭州，310014)

豬肉及其產(chǎn)品在人類食物消費中占有舉足輕重的地位，是人體所需蛋白質(zhì)的主要來源之一，但在屠宰生豬時會產(chǎn)生大量豬皮。我國是全世界最大的豬肉生產(chǎn)和消費大國，每年約產(chǎn)豬皮6億多張，豬皮資源相當(dāng)豐富。豬皮中蛋白質(zhì)含量占35%，主要是膠原蛋白，約占總蛋白含量的88%左右[1]。豬皮膠原蛋白含有18種氨基酸，營養(yǎng)價值較高，可增進(jìn)皮膚彈性，起到改善人體微循環(huán)和細(xì)胞新陳代謝的作用。因此，如何高值利用豬皮中膠原蛋白已成為當(dāng)前研究的熱點[2]。目前對于豬皮的利用和研究主要還是水解獲得功能性肽類，主要方法為酸水解法[2]、堿水解法[2]、酶水解法[3]、氧化水解法[4]以及混合水解法[5]。其中張康華等[6]研究pH漸變條件下采用堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶分步酶解豬皮得到不同分子質(zhì)量膠原蛋白肽，LAN等[4]用超聲波處理輔助酶解，獲得了更好的酶解效果。但該類方法獲得的水解產(chǎn)物只是食品工業(yè)中一種中間產(chǎn)物，在實際生產(chǎn)中很有局限性，難以投入大規(guī)模生產(chǎn)，仍有80%的豬皮被廢棄，造成大量環(huán)境污染[7]及蛋白資源的浪費。

固態(tài)發(fā)酵作為一種經(jīng)濟(jì)、高效的發(fā)酵技術(shù)，已經(jīng)在食品工業(yè)中被廣泛利用[8]。發(fā)酵過程中，微生物產(chǎn)生的一些酶系會促進(jìn)營養(yǎng)、活性成分的生成，同時生長代謝也會分泌復(fù)雜的代謝產(chǎn)物，形成特殊的發(fā)酵風(fēng)味。其中霉菌生長繁殖快，產(chǎn)酶效率高，發(fā)酵風(fēng)味優(yōu)良，是固態(tài)發(fā)酵中最常用的微生物之一[9]。如GULSUNOGLU等[10]利用曲霉處理蘋果廢渣來生產(chǎn)抗氧化酚類；SAMURAILATPAM等[11]利用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵大豆提高大豆的抗氧化性能。常見的發(fā)酵火腿[12]、發(fā)酵香腸[13]等食品的生產(chǎn)中也有霉菌的功勞。在中國紹興的腐乳生產(chǎn)中有一種常見的優(yōu)質(zhì)霉菌——總狀毛霉XH-22。該霉菌可分泌蛋白酶、脂肪酶等酶類，能提升產(chǎn)品營養(yǎng)并且賦予食品肉香和脂肪香味，是食品發(fā)酵工業(yè)中一種非常重要的微生物。

本文以總狀毛霉XH-22為菌種對豬皮進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，研究豬皮在發(fā)酵過程中表觀結(jié)構(gòu)，蛋白酶活力，游離氨基酸、多肽、可溶性蛋白等營養(yǎng)成分含量以及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的動態(tài)變化，為發(fā)酵豬皮的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供參考，對改進(jìn)豬皮的加工方式，開發(fā)相關(guān)的功能性食品具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 原料與試劑

滅菌脫脂豬皮，平陽縣錦華寵物用品有限公司；總狀毛霉XH-22，紹興咸亨腐乳廠；KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、乙醇、戊二醛、甘氨酸、NaOH、HCl、2,4,6-三甲基吡啶、三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)、無水Na2CO3(均為分析純)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標(biāo)準(zhǔn)物、硼酸，福林酚試劑、雙縮脲試劑、葡萄糖瓊脂液體培養(yǎng)基(potato dextrose broth，PDB)、酪氨酸、酪蛋白、牛血清蛋白,美國Sigma-Aldrich公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

S-433D型氨基酸自動分析儀，德國Sykam；Gemini 500高分辨掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)，德國Zeiss；752N紫外可見分光光度計，上海精科儀器有限公司；TGL-16M高速臺式冷凍離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；U410-86超低溫冰箱，英國New Brunswick Scientific；SCIENTZ-12N冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；TRACE1300-ISQQD型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo Fisher Scientific。

1.2 實驗方法

1.2.1 毛霉孢子懸浮液的制備

稱取37.5 g PDB培養(yǎng)基，加入1 L水，充分溶解，在121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌30 min，冷卻后接種毛霉孢子。25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h后，加入含1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl的無菌生理鹽水，振蕩均勻后過濾、計數(shù)，計數(shù)結(jié)果約為1×109～1×1011CFU/mL的毛霉孢子懸浮液，-4 ℃冷藏備用。

1.2.2 豬皮固態(tài)發(fā)酵

根據(jù)實驗室已優(yōu)化方法進(jìn)行豬皮的預(yù)處理和固態(tài)發(fā)酵，流程如下：

豬皮滅菌→樣品分割→浸泡→接種培養(yǎng)→取樣觀察

豬皮滅菌時，刮去多余脂肪和豬毛，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%左右的食品級雙氧水浸泡滅菌3 h，清水反復(fù)清洗。

隨后切成3 cm×3 cm片狀規(guī)格。于添加乳清蛋白2.1 g/100mL，葡萄糖1.7 g/100mL的浸泡液中浸泡30 min。然后接種毛霉孢子懸浮液于25 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于發(fā)酵0、1、2、3、4、5、6、7 d取樣，實驗設(shè)置3個重復(fù)樣本。

1.2.3 SEM微觀結(jié)構(gòu)觀察

參考SAFORA等[14]和IVAN等[15]的樣品預(yù)處理方法，并略微改進(jìn)。取樣品用2.5%(體積分?jǐn)?shù))戊二醛固定12 h，使用磷酸緩沖液沖洗3次，15 min/次。然后再用體積分?jǐn)?shù)50%，70%，85%，90%的乙醇梯度脫水，15 min/次，再用無水乙醇脫水2次，15 min/次。脫水完成后冷凍干燥24 h，切成2～3 mm薄片備用，噴金，在掃描電鏡下觀察結(jié)構(gòu)。

1.2.4 游離氨基酸分析

參考王馨雨等[16]和云金虎等[17]的方法，并略微改進(jìn)。分別準(zhǔn)確稱取2.000 g豬皮，研磨后加入4%(體積分?jǐn)?shù))的磺基水楊酸萃取，用10 mL容量瓶定容，振蕩混勻，靜置1 h，12 000 r/min下離心10 min，吸取上清液，最后上清液用孔徑為0.22 μm濾膜抽濾，濾液備用。使用氨基酸全自動分析儀測定游離氨基酸組成。

1.2.5 多肽含量的測定

參考魯偉等[18]的方法，并略微改進(jìn)。取樣品2.000 g，加入10 mL TCA水溶液，混合均勻，靜置10 min，然后在4 000 r/min下離心15 min，將上清液全部轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶，并用5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的TCA定容至刻度；然后取6.0 mL上述溶液置于另一試管中，加入雙縮脲試劑4.0 mL，混合均勻，靜置10 min，2 000 r/min離心10 min，取上清液于540 nm下測定吸光度值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品中多肽含量。

1.2.6 可溶性蛋白含量測定

參考考馬斯亮藍(lán)法[19]測定樣品中可溶性蛋白的含量。

1.2.7 蛋白酶活力的測定

參考GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》[20]和張云娟等[21]的方法測定樣品中蛋白酶活力。

1.2.8 揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

參考李誠等[22]的方法并稍作修改。精確稱取(3.00±0.01)g絞肉機(jī)絞碎樣品后，加入500 μL 2,4,6-三甲基吡啶，裝入15 mL頂空進(jìn)樣瓶中。將活化過的75 μm PDMS SPME萃取頭置于頂空瓶中樣品正上方。將頂空瓶放入60 ℃恒溫水浴鍋中萃取40 min，待萃取完畢后手動取出萃取頭，并置入氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)樣口內(nèi)熱解析。

進(jìn)樣口參數(shù)：選擇不分流模式，溫度為250 ℃，載氣為氦氣，流速控制為1 mL/min。

GC條件：DB-5 MS彈性毛細(xì)管柱60 m×0.32 mm×1 μm，起始溫度40 ℃保持10 min，以5 ℃/min升溫至200 ℃，保持5 min，以20 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min。

MS條件：EI模式，離子源溫度250 ℃，傳輸線溫度250 ℃，全質(zhì)量掃描范圍為35～500 amu，間隔時間0.2 s。

數(shù)據(jù)處理和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的定性和定量：數(shù)據(jù)通過與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(NIST 2014和 Wiley 9)中的譜圖進(jìn)行自動匹配，并結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行人工解析，對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性，利用內(nèi)標(biāo)物峰面積進(jìn)行定量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 26軟件進(jìn)行整理分析，采用Origin 2019b軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬皮發(fā)酵過程中表面結(jié)構(gòu)的變化

如圖1所示，在毛霉固態(tài)發(fā)酵過程中，豬皮的表面結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大變化，膠原纖維結(jié)構(gòu)部分裂解，質(zhì)地從緊致變疏松。發(fā)酵1 d時豬皮膠原纖維結(jié)構(gòu)還呈現(xiàn)明顯捆綁結(jié)構(gòu)；發(fā)酵3 d時捆綁結(jié)構(gòu)略微解體；5 d 時豬皮纖維分散，捆綁結(jié)構(gòu)基本消失但質(zhì)地緊密；7 d時捆綁結(jié)構(gòu)消失且結(jié)構(gòu)松散。分析原因，可能是由于毛霉的生長代謝改變其結(jié)構(gòu)，分泌蛋白酶把膠原纖維蛋白分解成小分子物質(zhì)，溶解于表面的水中，導(dǎo)致纖維結(jié)構(gòu)解體，逐漸由密變稀。

a-發(fā)酵1 d;b-發(fā)酵3 d;c-發(fā)酵5 d;d-發(fā)酵7 d圖1 豬皮固態(tài)發(fā)酵過程中表面結(jié)構(gòu)的SEM圖Fig.1 SEM images of the surface structure of pigskin during solid-state fermentation

2.2 豬皮發(fā)酵過程中蛋白酶活力的動態(tài)變化

本研究采用滅菌脫脂豬皮，總狀毛霉在其表面固態(tài)發(fā)酵過程中主要分泌蛋白酶。如圖2所示，在發(fā)酵過程中，毛霉分泌的蛋白酶活力呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，發(fā)酵2 d酶活力上升至21.391 0 U/g，發(fā)酵2～5 d顯著上升，5 d后酶活力到達(dá)最高點54.733 4 U/g，之后逐漸下降至42.924 2 U/g?？赡艿脑蚴前l(fā)酵2 d時毛霉生長至旺盛期，開始分泌蛋白酶，發(fā)酵2～5 d分泌蛋白酶速度大于酶失活速度，酶活力逐漸上升，5 d后毛霉老化開始產(chǎn)生孢子，產(chǎn)酶效率下降，產(chǎn)酶速度小于酶失活速度，導(dǎo)致毛霉發(fā)酵5 d后蛋白酶活力下降。

圖2 豬皮固態(tài)發(fā)酵過程中蛋白酶活力的動態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of protease activity during solid-state fermentation of pigskin

2.3 豬皮發(fā)酵過程中游離氨基酸含量的動態(tài)變化

由表1和圖3可知,各種游離氨基酸的含量隨著豬皮固態(tài)發(fā)酵時間的增加有著不同程度的變化。其中脯氨酸、丙氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸發(fā)酵3～6 d上升較為明顯(P<0.05)，脯氨酸為膠原蛋白中含量最多的氨基酸，說明豬皮中膠原蛋白在發(fā)酵過程中得到了一定程度的水解。除蘇氨酸外，其余氨基酸都隨著發(fā)酵時間的延長，呈緩慢上漲趨勢。必需氨基酸中，除了色氨酸沒有檢測到，其余7種都呈現(xiàn)緩慢上漲趨勢。其原因可能是豬皮膠原蛋白中含有的氨基酸種類不齊全，色氨酸、蘇氨酸含量較少，就算蛋白水解，蘇氨酸含量也不會有較大的提升。在發(fā)酵過程中，發(fā)酵豬皮的游離氨基酸總量呈現(xiàn)上升趨勢，發(fā)酵0～6 d，發(fā)酵豬皮中游離氨基酸總量由5.711 1 g/100g上升到7.000 1 g/100g，提高了22.6%，其中必需氨基酸總量從1.249 7 g/100g上升到1.484 1 g/100g，提高了18.8%。主要原因是毛霉生長所分泌的蛋白酶酶解了豬皮中的蛋白質(zhì)，使得游離氨基酸含量逐漸升高。發(fā)酵6 d后氨基酸總量和必需氨基酸總量有較不明顯的下降趨勢(P>0.05)，這可能是由于部分氨基酸降解，生產(chǎn)揮發(fā)性鹽基氮或生成酮類物質(zhì)，如壬酮、庚酮等。

圖3 豬皮固態(tài)發(fā)酵過程中游離氨基酸總量的動態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of total free amino acids during solid-state fermentation of pigskin

2.4 豬皮發(fā)酵過程中多肽及可溶性蛋白含量的動態(tài)變化

由圖4可知，發(fā)酵豬皮的可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，0～2 d無顯著性變化(P>0.05)，2～5 d顯著上升(P<0.05)，5 d后開始下降。主要原因是發(fā)酵2 d后毛霉生長所分泌的蛋白酶酶解了豬皮中的蛋白質(zhì)，將難溶的膠原蛋白分解成分子質(zhì)量更小的蛋白質(zhì)，增加了蛋白質(zhì)的溶解性，使得可溶性蛋白含量逐漸升高，而水中的蛋白質(zhì)更容易與蛋白酶接觸分解成肽類和氨基酸，導(dǎo)致5 d后可溶性蛋白含量下降。在固態(tài)發(fā)酵過程中(0～7 d)，豬皮中多肽含量呈現(xiàn)上升趨勢，由0.316 4 g/100g上升到了1.145 9 g/100g，增加了2.6倍，且發(fā)酵3～7 d過程中上升顯著(P<0.05)。分析原因，主要是發(fā)酵3 d后是蛋白酶分泌的旺盛時期，酶活力提高，并且可溶性蛋白含量增加，更易與蛋白酶接觸，使得多肽含量顯著升高。

表1 豬皮發(fā)酵過程中游離氨基酸的含量變化(n=3) 單位：g/100g

圖4 豬皮固態(tài)發(fā)酵過程中多肽含量及可溶性蛋白含量的動態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes of polypeptide content and soluble protein content during solid-state fermentation of pigskin

2.5 豬皮發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分的動態(tài)變化

豬皮毛霉固態(tài)發(fā)酵過程中共檢測出主要揮發(fā)性風(fēng)味成分的組分共35種，如表2所示。以醛類、醇類、酮類、酯類為主，還有其他類被檢出。如表2和圖5所示，在發(fā)酵0～7 d，揮發(fā)性風(fēng)味成分的種類逐漸增加。發(fā)酵0 d的豬皮共檢測出主要揮發(fā)性物質(zhì)15種。到發(fā)酵3 d共檢測出主要揮發(fā)性物質(zhì)18種。發(fā)酵7 d共檢測出主要揮發(fā)性物質(zhì)29種。發(fā)酵7 d檢出的主要揮發(fā)性成分有18種未在發(fā)酵0 d檢出，尤其是醛類和醇類物質(zhì)種類的增加，分別有3-甲基丁醛、正己醛、正辛醛、苯乙醛、反-2-辛烯醛、十二醛、十一醛、正己醇、1-烯-3-辛醇、2-壬醇、苯乙醇、1-壬醇。醛類物質(zhì)閾值較低，對發(fā)酵風(fēng)味的貢獻(xiàn)較大。醇類主要由脂肪酸過氧化物降解產(chǎn)生，或者來自醛酮類羰基化合物的還原作用[23]。此外，酮類物質(zhì)隨著時間的推移，含量顯著上升，尤其是2-壬酮、2-庚酮，可能是由氨基酸的降解生成[23]。酯類物質(zhì)可賦予豬皮獨特的酯香味，雖然含量不高，但是會對發(fā)酵豬皮的整體風(fēng)味起到一定的增香作用[23]。

表2 豬皮發(fā)酵過程中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及其含量變化(n=3) 單位：ng/g

圖5 豬皮固態(tài)發(fā)酵0～7 d主要揮發(fā)性物質(zhì)總量的動態(tài)變化Fig.5 Dynamic changes of the total amount of main volatile substances in pigskin solid-state fermentation for 0-7 days

3 結(jié)論

本文研究了豬皮毛霉固態(tài)發(fā)酵過程中豬皮表觀結(jié)構(gòu)，主要營養(yǎng)成分，相關(guān)酶活力變化以及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化。結(jié)果表明，與未發(fā)酵的豬皮相比，經(jīng)毛霉固態(tài)發(fā)酵后豬皮的游離氨基酸、多肽含量呈現(xiàn)隨時間延長而增加的趨勢，可溶性蛋白含量、蛋白酶活力呈先上升后下降趨勢，于5 d達(dá)到最大值，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)增加12種，醇、醛、酯類物質(zhì)顯著增多，酮類含量顯著增加。本研究結(jié)果表明毛霉固態(tài)發(fā)酵豬皮后能提高豬皮營養(yǎng)價值，改善豬皮風(fēng)味，本研究為利用豬皮開發(fā)功能性配料或食品提供理論依據(jù)。