朱慧越，鄒仁英，許夢(mèng)舒，王琳琳，田培郡，陳衛(wèi)，王剛

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

抑郁癥(depression)是一類精神障礙疾病[1]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，焦慮和抑郁[2]已成為影響國(guó)人身心健康的主要公共衛(wèi)生問(wèn)題。近年來(lái)大量臨床研究表明，抑郁患者在抑郁癥發(fā)作時(shí)，會(huì)出現(xiàn)下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA軸)反饋機(jī)制失調(diào)[3-4]、免疫失調(diào)與慢性炎癥[5]等病理特征。伴隨著探索腸道的熱潮，“微生物-腸-腦軸”的研究為抑郁癥的防治打開(kāi)了新的窗口。

抑郁癥常與胃腸疾病有極高的共病性[6]，其機(jī)制涉及“微生物-腸-腦軸”功能異常。作為腸道最重要的一類細(xì)菌代謝產(chǎn)物，短鏈脂肪酸與抑郁癥關(guān)聯(lián)密切。短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)由宿主攝入體內(nèi)的膳食纖維等耐消化物質(zhì)經(jīng)腸道微生物發(fā)酵產(chǎn)生[7]，常見(jiàn)的SCFAs包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸和異戊酸等。SCFAs既能作為G蛋白偶聯(lián)受體的激動(dòng)劑[8]，介導(dǎo)腸上皮信號(hào)，又可作為組蛋白去乙?；傅囊种苿9]，穩(wěn)定神經(jīng)系統(tǒng)，因此成為生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。隨著對(duì)其作用機(jī)制的闡明，SCFAs被認(rèn)為是調(diào)節(jié)精神類疾病的重要信號(hào)分子[10]，廣泛參與調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺(5-hydroxytrptamine，5-HT)生成[11]、維持神經(jīng)元形態(tài)[3]、緩解神經(jīng)炎癥[12-13]等多項(xiàng)生理過(guò)程，表現(xiàn)出巨大的抗抑郁潛力。

由于SCFAs大多氣味濃烈，直接灌胃SCFAs會(huì)影響小鼠情緒，進(jìn)而影響研究結(jié)果；此外，SCFAs的鈉鹽會(huì)被小腸吸收，無(wú)法模擬腸道菌群代謝產(chǎn)生SCFAs的正常生理過(guò)程。因此無(wú)論是SCFAs還是SCFAs鈉鹽的干預(yù)方式都無(wú)法精確體現(xiàn)大腸中微生物代謝產(chǎn)生的SCFAs對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響。而現(xiàn)有研究表明，取代度(degree of substitution，DS)在0.2～0.3的酰化淀粉具有小腸酶抗性[14]，這種SCFAs的衍生產(chǎn)物在小腸難以被吸收分解，在大腸才會(huì)被腸道微生物發(fā)酵，釋放出SCFAs及氣體。FUKUDA等[15]研究證實(shí)，給小鼠喂食添加了乙?；矸鄣氖澄?，乙?；矸墼谛∈蟮拇竽c內(nèi)分解釋放出乙酸，顯著提高糞便中醋酸鹽含量；WANG等[16]通過(guò)對(duì)比不同組織中SCFAs的含量，也證實(shí)了酰化淀粉的抗小腸酶水解功能。

本研究采用SCFA-酰化淀粉，實(shí)現(xiàn)SCFAs在大腸的定點(diǎn)釋放，探究其對(duì)慢性應(yīng)激引起的抑郁癥狀的緩解及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

分析天平、pH計(jì)，美國(guó)METTLER TOLEDO公司；熱力磁力攪拌器，德國(guó)IKA公司；真空冷凍干燥機(jī)，上海泰事達(dá)機(jī)電設(shè)備有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；EthoVision XT 11.5動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡跟蹤系統(tǒng)，原制造商荷蘭Noldus公司；Waters e2695高效液相色譜儀、Waters 2475熒光檢測(cè)器，上海沃特世科技有限公司；PCR基因擴(kuò)增儀，美國(guó)Bio-Rad公司；高通量組織研磨器，寧波新芝公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

高直鏈玉米淀粉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酸酐、丙酸酐、異丁酸酐、丁酸酐，阿拉丁生化科技股份有限公司；異戊酸酐，日本TCI公司；小鼠皮質(zhì)酮(corticosterone，CS)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、小鼠促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)酶聯(lián)免疫分析試劑盒，南京森貝伽生物科技有限公司；qRT-PCR相關(guān)引物，上海桑尼生物科技有限公司。

1.2 飼料的制備

1.2.1 制備?；矸?/p>

?；矸鄣闹苽湓诤檠愕萚17]的方法上加以改進(jìn)。將高直鏈玉米淀粉配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的淀粉乳?？販?0 ℃，滴加酸酐，用量相當(dāng)于淀粉質(zhì)量的50%，用0.50 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)淀粉乳液pH，期間嚴(yán)格控制溫度和pH穩(wěn)定，反應(yīng)2 h。結(jié)束后用0.50 mol/L鹽酸將體系pH值調(diào)整至5.70。水洗至洗液中性，冷凍干燥，得?；矸?。

不加酸酐，嚴(yán)格同上操作制備空白對(duì)照組和抑郁模型組使用的普通淀粉。

1.2.2 測(cè)定取代度

(1)樣品滴定：取2 g?；矸蹣悠芳尤?0 mL蒸餾水，以1%酚酞作為指示劑，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至終點(diǎn)。加入25 mL 0.5 mol/L NaOH準(zhǔn)溶液，皂化反應(yīng)1.5 h。鹽酸滴定體系中過(guò)量的NaOH溶液[18]；平行滴定3次，取均值。

(2)空白實(shí)驗(yàn)：取2 g原料淀粉，檢測(cè)步驟同上。

(3)取代度計(jì)算如公式(1)、公式(2)所示：

(1)

(2)

式中：A，?；|(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；V1，樣品組耗用的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；V2，空白組耗用的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；c，鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；m1，樣品組樣品質(zhì)量，g；m2，空白組樣品質(zhì)量，g；M，取代基的摩爾質(zhì)量，g/mol(乙酰基取43，丙?；?7，丁酰基和異丁?；?1，異戊?；?5)；DS，?；矸廴〈?；162，淀粉相對(duì)分子質(zhì)量，g/mol[高聚體淀粉分子通式為(C6H10O5)n]。

1.2.3 制備飼料

以DS=0.25為基準(zhǔn)換算各類?；矸坌枰砑恿?。以1 000 g混合飼料為例，需要150 g的取代度為0.25的?；矸郏绻?3)所示：

0.25×150=DS×m

(3)

式中：m，1 000 g混合飼料中需加入的淀粉量。

將原飼料經(jīng)粉碎機(jī)破碎成細(xì)小顆粒，加入酰化淀粉，混勻，少量多次加入水，經(jīng)5 mL注射器擠壓成型，分類存放于-20 ℃冰箱。使用時(shí)，將飼料經(jīng)過(guò)紫外照射帶入屏障環(huán)境。

1.2.4 驗(yàn)證酰化淀粉功能

SCFAs的測(cè)定在毛丙永[19]的方法上做適當(dāng)改進(jìn)。稱取小鼠盲腸及內(nèi)容物濕重約50 mg凍干，加入飽和NaCl溶液浸泡樣品，破碎至無(wú)明顯顆粒。硫酸酸化，振蕩均勻。加入乙醚旋渦以提取SCFAs，4 ℃、14 000 r/min離心15 min，將乙醚轉(zhuǎn)移至加入0.25 g無(wú)水硫酸鈉的EP管中，再次離心。將上清液轉(zhuǎn)移至氣相進(jìn)樣小瓶中，用GC-MS測(cè)定，選取各分析物標(biāo)準(zhǔn)品的特征離子進(jìn)行定量分析。外標(biāo)法計(jì)算樣品中SCFAs的含量(μmol/g)。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與方案設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇SPF級(jí)的C57BL/6J雄性小鼠，6周齡，購(gòu)自蘇州格瑞斯威生物科技有限公司。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所有操作符合江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理各項(xiàng)規(guī)定，許可證SYXK(蘇)2016-0045。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理審查批準(zhǔn)，審批號(hào)JN.No20191115c0600109[321]。經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)后，除空白對(duì)照組外，其余6組經(jīng)5周的慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)造模。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)如圖1所示。

圖1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)Fig.1 Animal experiment design

1.3.1 構(gòu)造抑郁模型

采用CUMS結(jié)合C57BL/6J方式進(jìn)行造模[20]，每天隨機(jī)采用1～2種刺激，并避免晝夜節(jié)律，刺激因素如表1所示。

表1 抑郁模型小鼠的造模方式Table 1 Modeling method for depression mice

1.3.2 行為學(xué)測(cè)試

小鼠抑郁行為學(xué)的評(píng)價(jià)借助動(dòng)物房的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室展開(kāi)，通過(guò)EthoVision XT 11.5系統(tǒng)分析行為學(xué)相關(guān)指標(biāo)。

1.3.2.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open field test，OFT)

用鑷子輕輕夾住小鼠尾部，將其放入曠場(chǎng)箱內(nèi)底面中心，同時(shí)進(jìn)行錄像和計(jì)時(shí)，每只觀察時(shí)間為10 min。分析小鼠在中心、邊緣區(qū)域的活動(dòng)情況[21]。

1.3.2.2 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)(elevated plus maze test，EPM)

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)將小鼠面向開(kāi)放臂放入迷宮中央格，同時(shí)進(jìn)行錄像和計(jì)時(shí)。記錄5 min內(nèi)小鼠在開(kāi)放臂、閉合臂的活動(dòng)情況[22]。

1.3.2.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(forced swimming test，F(xiàn)ST)

5 L實(shí)驗(yàn)桶內(nèi)裝有大約3 L的清水，水溫在(24±1) ℃，每只小鼠進(jìn)行6 min游泳測(cè)試。同時(shí)進(jìn)行錄像，分析3～6 min的小鼠靜止、活躍和狂躁時(shí)間[23]。

1.3.3 生理指標(biāo)檢測(cè)

1.3.3.1 血清中HPA軸相關(guān)激素濃度的檢測(cè)

采用雙抗體夾心法ELISA試劑盒測(cè)定小鼠血清中ACTH和CS的含量。操作嚴(yán)格參考使用說(shuō)明書。

1.3.3.2 結(jié)腸組織中神經(jīng)遞質(zhì)及其前體濃度的檢測(cè)

稱取結(jié)腸組織50 mg，10倍稀釋(預(yù)冷PBS)后進(jìn)行組織勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，加入等體積的5%高氯酸沉淀蛋白，充分混勻，再次離心，上清液經(jīng)0.22 μm水系膜過(guò)濾后，上機(jī)分析。外標(biāo)法計(jì)算結(jié)腸樣品中色氨酸(tryptophan，Trp)、5-羥色氨酸(5-Hydroxytryptophan，5-HTP)和5-HT的濃度[24]。

色譜條件：色譜柱為島津Intertsil ODS-3(5 μm，4.6 mm×250 mm)，流動(dòng)相a為0.1 mol/L的NaAc(含0.1 mmol/L EDTA-2 Na)，pH=5.10，甲醇為流動(dòng)相b，流動(dòng)相a∶b=85∶15，流速1.0 mL/min，激發(fā)波長(zhǎng)為290 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為330 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

1.3.3.3 結(jié)腸組織中色氨酸羥化酶1基因表達(dá)量的檢測(cè)

取20 mg結(jié)腸組織，TRIZOL提取總RNA并立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得cDNA模板。使用1 μL cDNA和SYBR Green Supermix在BioRad-CFX384系統(tǒng)上進(jìn)行色氨酸羥化酶1(tryptophan hydroxylase 1，TPH1)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR，每個(gè)樣品重復(fù)3次，記錄樣品的循環(huán)閾值?；虮磉_(dá)量經(jīng)由內(nèi)參Gapdh歸一化處理，使用2-△△Ct法進(jìn)行分析小鼠結(jié)腸Tph1表達(dá)量[10]。

反應(yīng)程序：95 ℃、2 min進(jìn)行預(yù)變性，95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、15 s條件下進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，默認(rèn)程序采集融解曲線小鼠Tph1引物序列(5′-GTAGGAACCAACCAGATTCACCAT-3′；5′-CCAAGGAGAA-GATGAGAGTC-3′)，小鼠Gapdh引物序列(5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′；5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

空白對(duì)照組和抑郁模型組的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Turkey′s test進(jìn)行比較，各?；矸鄹深A(yù)組和抑郁模型組的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用One-way ANOVA進(jìn)行分析，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行計(jì)算和繪圖，使用SIMCA 14.1進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least-squares discrimination analysis, OPLS-DA)和主成分分析(principal component analysis, PCA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ?；矸鄣娜〈?/h3>

本實(shí)驗(yàn)采用堿法推進(jìn)取代反應(yīng)，得到的?；矸墼砘蟮味ㄈ〈取Ｒ阴；矸?、丙?；矸邸惗□；矸?、丁?；矸酆彤愇祯；矸鄣腄S分別為0.22、0.25、0.22、0.26和0.28。

空白對(duì)照組和抑郁模型組小鼠所用的飼料加入不經(jīng)酸酐取代、同等條件操作的淀粉，其余5組以DS=0.25為基準(zhǔn)換算各類?；矸坌枰砑拥牧?。各實(shí)驗(yàn)組的原飼料與酰化淀粉用量情況如表2所示。

表2 干預(yù)飼料淀粉及原飼料用量Table 2 Quantity of starch and raw feed

2.2 酰化淀粉實(shí)現(xiàn)大腸釋放SCFAs

小鼠盲腸及內(nèi)容物中SCFAs檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。通過(guò)對(duì)比各組SCFAs濃度，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充特定的?；矸勰茉诿つc段顯著提高對(duì)應(yīng)的短鏈脂肪酸的濃度，可以認(rèn)為?；矸蹖?shí)現(xiàn)了對(duì)應(yīng)短鏈脂肪酸的大腸定點(diǎn)釋放。此外，雖然空白對(duì)照組和抑郁模型組的飲食相同，但是抑郁模型組的小鼠大腸內(nèi)乙酸和丁酸的濃度顯著低于空白對(duì)照組的小鼠(P<0.05)。

a-小鼠盲腸及內(nèi)容物中乙酸的濃度;b-小鼠盲腸及內(nèi)容物中丙酸的濃度;c-小鼠盲腸及內(nèi)容物中異丁酸的濃度;d-小鼠盲腸及內(nèi)容物中丁酸的濃度;e-小鼠盲腸及內(nèi)容物中異戊酸的濃度圖2 盲腸及內(nèi)容物中主要SCFAs的濃度Fig.2 Concentration of main SCFAs in cecum and contents注：ns表示沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；#表示P<0.05，##表示P<0.01；*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.000 1(下同)

2.3 SCFAs改善行為表型

為評(píng)價(jià)?；矸蹖?duì)抑郁和焦慮癥狀的緩解作用，采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠的行為進(jìn)行測(cè)試。分別就曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中小鼠第一次潛伏期時(shí)間和小鼠在中心區(qū)域的移動(dòng)距離占總移動(dòng)距離比例(%)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中小鼠在開(kāi)放臂活動(dòng)時(shí)間占總時(shí)間比例(%)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中小鼠靜止漂浮時(shí)間占總統(tǒng)計(jì)時(shí)間比例(%)進(jìn)行評(píng)估，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

空白對(duì)照組和抑郁模型組小鼠之間的焦慮及抑郁行為存在顯著差異(P<0.01)，而?；矸鄣母深A(yù)表現(xiàn)出了不同程度的抗焦慮、抗抑郁效果。在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，異丁?；矸鄹深A(yù)組(P<0.05)、丁酰化淀粉干預(yù)組(P<0.01)和異戊?；矸鄹深A(yù)組(P<0.001)的小鼠的第一次潛伏期顯著低于抑郁模型組的小鼠，并且異丁?；矸鄹深A(yù)組(P<0.05)的小鼠在中心區(qū)域移動(dòng)的距離顯著高于抑郁模型組，這提示異丁酸、丁酸和異戊酸可能對(duì)小鼠探索未知環(huán)境的焦慮有潛在的緩解作用；在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，各組小鼠在開(kāi)放臂的停留時(shí)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是?；矸鄹深A(yù)的各組小鼠表現(xiàn)出在開(kāi)放臂中停留時(shí)間增加的趨勢(shì)；在抑郁相關(guān)的行為測(cè)試方面，強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，空白組和模型組之間存在顯著差異(P<0.05)，而?；矸鄹深A(yù)的各組別無(wú)顯著差異，部分組別出現(xiàn)靜止漂浮時(shí)間延長(zhǎng)的趨勢(shì)，這和預(yù)期并不完全一致。先前有研究者提出，一定劑量的丁酸處理對(duì)于急性抑郁和焦慮模型的整體活動(dòng)并沒(méi)有影響，甚至使其在強(qiáng)迫游泳測(cè)試中表現(xiàn)出了更大的不活躍性[25]。這表明丁酸對(duì)情緒的調(diào)節(jié)作用仍需要進(jìn)一步確認(rèn)。

a-曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：小鼠第一次潛伏期;b-曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：小鼠在中心區(qū)域移動(dòng)距離占總移動(dòng)距離的比例;c-高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)：小鼠在開(kāi)放臂停留時(shí)間占總時(shí)間比例;d-強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)：小鼠靜止漂浮時(shí)間占總時(shí)間比例圖3 行為學(xué)測(cè)試結(jié)果Fig.3 Results of behavioral tests

2.4 SCFAs修復(fù)HPA軸功能

測(cè)定小鼠血清中ACTH和CS的濃度，ELISA結(jié)果如圖4所示。抑郁模型組的血清ACTH和CS的濃度顯著高于空白組(P<0.01)，而乙酰化淀粉(P<0.01)、丙酰化淀粉(P<0.01)和異丁?；矸?P<0.01)的干預(yù)使得小鼠體內(nèi)ACTH的水平接近于空白對(duì)照組的小鼠，并且乙?；矸?P<0.05)、異丁?；矸?P<0.05)和丁?；矸?P<0.01)的干預(yù)會(huì)降低小鼠體內(nèi)CS的含量。這表明乙酸和丁酸能通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)，使應(yīng)激激素恢復(fù)到正常水平，進(jìn)而緩解小鼠HPA軸亢進(jìn)。大量臨床研究表明，抑郁患者常伴隨著HPA軸亢進(jìn)的癥狀。長(zhǎng)期應(yīng)激狀態(tài)下，高濃度的糖皮質(zhì)類激素使得海馬體萎縮、調(diào)節(jié)HPA軸負(fù)反饋的能力下降，形成了惡性循環(huán)[26]。趙丹陽(yáng)[27]提出，腸道微生物中，擬桿菌屬和普雷沃氏菌科等菌群的豐度與ACTH的水平呈正相關(guān)，GAREAU等[4]發(fā)現(xiàn)服用乳酸菌能夠降低母嬰分離誘導(dǎo)的異常高的CS水平，并且束縛應(yīng)激的大鼠服用乳酸菌后過(guò)度亢進(jìn)的HPA軸活動(dòng)能夠恢復(fù)正常[28]。有研究明確指出，SCFAs作為主要的腸道菌群代謝產(chǎn)物，攝入后可以降低促皮質(zhì)素釋放激素水平[29]，而人體循環(huán)中SCFAs的增加會(huì)隨著皮質(zhì)醇對(duì)社會(huì)心理壓力反應(yīng)的減弱而顯著協(xié)變[30]，并且可以緩解伴隨炎癥[5]。本文結(jié)果印證了先前的報(bào)道。盡管如此，GAGLIANO等[31]的研究表明，高劑量(1 200 mg/kg)的丁酸也具有應(yīng)激作用，能夠顯著提高血漿中ACTH和CS的外周水平，誘導(dǎo)壓力應(yīng)激行為。因此，SCFAs和抑郁調(diào)節(jié)之間的量效關(guān)系仍需進(jìn)一步探究。

a-小鼠血清中ACTH的質(zhì)量濃度;b-小鼠血清中CS的質(zhì)量濃度圖4 HPA軸亢進(jìn)相關(guān)的激素濃度Fig.4 Concentration of hormone related to HPA axis hyperactivity

2.5 SCFAs影響神經(jīng)遞質(zhì)合成

腸道中，L-Trp經(jīng)TPH1轉(zhuǎn)化可以得到5-HTP，5-HTP進(jìn)而在脫羧酶的作用下轉(zhuǎn)變成5-HT，是體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT合成的主要來(lái)源[11]。Tph1的基因表達(dá)量參見(jiàn)圖5，抑郁模型組小鼠Tph1表達(dá)量顯著低于空白模型組(P<0.05)，表明CUMS造成的抑郁小鼠其結(jié)腸內(nèi)Trp向5-HTP及5-HT的轉(zhuǎn)變受到了影響；而部分SCFAs，尤其是異丁酸(P<0.05)的攝入，能夠恢復(fù)小鼠結(jié)腸內(nèi)Trp向5-HTP及5-HT的轉(zhuǎn)變過(guò)程，同時(shí)乙酸和丁酸也表現(xiàn)出了增強(qiáng)Tph1轉(zhuǎn)錄的特性，盡管沒(méi)有顯著性。我們的結(jié)果與先前的研究結(jié)論類似。REIGSTAD等[32]發(fā)現(xiàn)，恢復(fù)無(wú)菌小鼠的腸道菌群進(jìn)而產(chǎn)生的SCFAs促進(jìn)了腸嗜鉻細(xì)胞模型——BON細(xì)胞中的Tph1轉(zhuǎn)錄，可以顯著增強(qiáng)Trp向5-HTP的轉(zhuǎn)變。并且腸道產(chǎn)孢子菌及其代謝產(chǎn)物(如丙酸鹽和丁酸鹽等)顯著提高了小鼠腸道合成5-HT的功能[33]。SCFAs逆轉(zhuǎn)了小鼠體內(nèi)的低Tph1mRNA水平，是影響5-HT合成的重要因素。

采用HPLC-熒光檢測(cè)法對(duì)小鼠結(jié)腸組織的Trp、5-HTP和5-HT的濃度進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示?？梢钥吹?，5類?；矸鄣母深A(yù)(相當(dāng)于對(duì)應(yīng)SCFAs的攝入)可以顯著增加結(jié)腸內(nèi)的Trp濃度，這表明SCFAs的攝入可能影響了腸道菌群的結(jié)構(gòu)，從而使得由腸道微生物代謝蛋白質(zhì)產(chǎn)生的Trp增多。但從結(jié)腸5-HTP、5-HT的水平變化來(lái)看，抑郁模型組小鼠結(jié)腸5-HT卻顯著(P<0.05)高于空白對(duì)照組，盡管其前體5-HTP的水平在空白對(duì)照組和抑郁模型組的小鼠之間沒(méi)有顯著性變化，并且與Tph1轉(zhuǎn)錄情況并不完全一致，這可能由于模型動(dòng)物處于一種代償性應(yīng)激的狀態(tài)，從而使得神經(jīng)遞質(zhì)及其前體處于一個(gè)短暫升高的階段。但可以肯定的是，SCFAs的攝入，尤其是乙酸和丁酸，均可以使CUMS造成的5-HT水平異常向正?；謴?fù)。

圖5 小鼠結(jié)腸Tph1基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression of Tph1 gene in mouse colon

a-小鼠結(jié)腸中Trp的質(zhì)量濃度;b-小鼠結(jié)腸中5-HTP的質(zhì)量濃度;c-小鼠結(jié)腸中5-HT的質(zhì)量濃度圖6 小鼠結(jié)腸中5-HT及其前體的濃度Fig.6 Concentration of 5-HT and its precursors in mice colon

通過(guò)正交偏最小二乘法分析空白對(duì)照組和抑郁模型組小鼠的組間差異，得到OPLS-DA得分圖，采用主成分分析對(duì)以上行為學(xué)及生理指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行降維處理，得到PCA載荷圖(相關(guān)性圖)。由圖7-a可知，空白對(duì)照組和抑郁模型組在水平方向的差異證實(shí)了抑郁模型構(gòu)建的有效性，在圖7-b中，乙?；矸鄹深A(yù)組、異丁?；矸鄹深A(yù)組及丁酰化淀粉干預(yù)組的小鼠與空白對(duì)照組的各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性較強(qiáng)，這提示乙酸、異丁酸和丁酸均能在一定程度上緩解抑郁癥狀，使得小鼠的行為表型與生理指標(biāo)逐漸恢復(fù)到正常水平。此前，MARCEL等[29]發(fā)現(xiàn)，將乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉的混合藥物添加到飲水中進(jìn)行干預(yù)，SCFAs組在行為學(xué)測(cè)試中表現(xiàn)出抗抑郁和抗焦慮特異性。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與先前報(bào)道一致。

a-OPLS-DA得分圖;b-PCA載荷圖圖7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析Fig.7 Statistical analysis of data

3 結(jié)論與展望

在本文中，首次采用了SCFA-?；矸鄣男问剑瑢?shí)現(xiàn)了對(duì)應(yīng)短鏈脂肪酸在腸道的定點(diǎn)釋放，并證明了乙酸、異丁酸和丁酸均能在一定程度上緩解抑郁樣行為；相較于對(duì)行為表型的影響，SCFAs調(diào)節(jié)生理指標(biāo)的效果更加顯著。在CUMS造模下，小鼠出現(xiàn)HPA軸亢進(jìn)，分泌大量的應(yīng)激激素并進(jìn)入循環(huán)，體內(nèi)5-HT及其前體水平出現(xiàn)紊亂，經(jīng)過(guò)5周的?；矸埏嬍掣深A(yù)，SCFAs使得小鼠體內(nèi)ACTH和CS濃度逐漸恢復(fù)正常，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)起到保護(hù)作用，穩(wěn)定小鼠體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平，緩解小鼠抑郁樣癥狀。

由于人體腸道菌群是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)體系，SCFAs 通過(guò)“微生物-腸-腦軸”系統(tǒng)影響抑郁癥的機(jī)制仍有很多未解的謎題，如SCFAs在腸道內(nèi)的作用靶點(diǎn)、對(duì)宿主原生腸道微生物的影響、體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)涉及的相關(guān)通路與受體等。此外，腸道微生物代謝產(chǎn)生的SCFAs生理濃度是否能有效到達(dá)大腦、進(jìn)而直接參與體內(nèi)神經(jīng)調(diào)節(jié)，還需要更多證據(jù)來(lái)驗(yàn)證。對(duì)SCFAs作用機(jī)制更為詳盡的探究，將為營(yíng)養(yǎng)健康和疾病的精準(zhǔn)干預(yù)提供更加堅(jiān)實(shí)可靠的理論依據(jù)。