徐 彪，馮藝川，李玉發(fā)，何中國(guó)，吳松權(quán)*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 公主嶺 136110)

花生(ArachishypogaeaLinn.)是吉林省重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，也是吉林省西部地區(qū)主栽的旱田作物之一。由于特殊的氣候條件，吉林省花生品質(zhì)好，口感佳，特別是黃曲霉污染較低[1]。但吉林省花生新育成品種遺傳基礎(chǔ)狹窄，品種退化，專用品種少等問題嚴(yán)重影響吉林省花生產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1-2]。因此，開展新型分子標(biāo)記技術(shù)，科學(xué)合理地分析、利用吉林省花生種質(zhì)資源，有利于更好更快地建立花生良種繁育體系，有助于加快專用型花生品種的選育和引進(jìn)[1-2]。

RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)是一種基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，以10核苷酸的隨機(jī)序列，擴(kuò)增所研究材料的基因組DNA分子標(biāo)記技術(shù)[3-4]。由Williams和Welsh于1990年幾乎同時(shí)提出和建立[5-6]。與其它標(biāo)記相比，RAPD既不需要DNA探針，也不需要序列的信息；并且RAPD擴(kuò)增程序不涉及DNA雜交及其相關(guān)步驟，操作簡(jiǎn)單和高效；與RFLP標(biāo)記相比，RAPD能檢測(cè)到更高的多態(tài)性；另外，RAPD擴(kuò)增的產(chǎn)物可以克隆、測(cè)序、轉(zhuǎn)化為其他類型的標(biāo)記，如序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STS)、序列特異擴(kuò)增區(qū)域(SCAR)標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)[4]，廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析。馬孟莉等[7]利用11個(gè)RAPD引物對(duì)48份草果分為4類；王同華等[8]應(yīng)用RAPD和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)湖南省飯豆地方品種進(jìn)行了遺傳多樣性研究，遺傳相似性系數(shù)在0.649～0.876 5之間；朱學(xué)鑫等[9]采用RAPD標(biāo)記研究了國(guó)內(nèi)不同產(chǎn)地白及的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，在遺傳相似性系數(shù)為0.58處分為2類。以上結(jié)果表明，RAPD分子標(biāo)記在不同的物種中均能夠很好的反應(yīng)品種(材料)間的遺傳變異，可用于花生遺傳多樣性分析。

為了進(jìn)一步系統(tǒng)的采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)研究花生的遺傳多樣性和花生品種間遺傳距離。該文利用2×Taq PCR Mix酶的快速簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，首先對(duì)花生RAPD-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，之后使用優(yōu)化后的反應(yīng)體條件對(duì)22個(gè)花生品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，對(duì)提高花生新品種選育和遺傳改良效率均具有現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 植物材料

來源于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花生研究所收集的22份花生種質(zhì)資源(表1)，取15 d花生幼苗嫩葉為試驗(yàn)材料。

表1 花生種質(zhì)資源名稱Table 1 Name of germplasm resources of A.hypogaea

1.2 基因組DNA提取及檢測(cè)

采用BIOMIGA公司Ezgene TM CP Plant Miniprep Kit(GD2621)的方法，提取花生基因組DNA，用超微量分光光度計(jì)和瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測(cè)，將總DNA稀釋為10 ng/μL，置于-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增及檢測(cè)

PCR預(yù)擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，35～40 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)次數(shù)36～40次；12 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2.0%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)Gold View Ⅰ型核酸染色劑染色后在凝膠分子成像儀器(JY04S-3E型)成像保存。

1.4 隨機(jī)引物的篩選

以多個(gè)地理來源的科富花1、花育20、吉花9、雙遼紅粒、白院花8、鐵花16等量均勻混合的花生DNA為模板，對(duì)200個(gè)隨機(jī)引物進(jìn)行篩選。最后選擇多態(tài)性高，重復(fù)性好的24個(gè)引物，用于后續(xù)試驗(yàn)。其中，引物OPJ-14(5'-CACCCGGATG-3')在花生基因組總DNA中擴(kuò)增條帶比較均勻、清楚。因此，該研究中選用引物OPJ-14進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

1.5 RAPD反應(yīng)體系的單因素優(yōu)化設(shè)計(jì)

選用混合后的花生DNA作為反應(yīng)體系優(yōu)化的模板，以引物OPJ-14對(duì)影響反應(yīng)的4個(gè)主要因素(退火溫度、循環(huán)次數(shù)、引物和模板DNA)進(jìn)行單因素優(yōu)化分析，各因素設(shè)置如下：退火溫度為35、36、37、38 、39、40 ℃；循環(huán)次數(shù)為36、37、38、39、40；引物濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 pmol；模板DNA濃度為10、15、20、25、30 ng。保持其他因素不變，其中單一因素濃度改變，篩選最適合的濃度，以獲得最佳的反應(yīng)體系。

1.6 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)電泳圖譜，以0、1統(tǒng)計(jì)RAPD帶型，在相同遷移位置上有條帶計(jì)為“1”，無條帶計(jì)為“0”，條帶缺失計(jì)為“9”，建立二維矩陣，用Microsoft Excel 2017處理相應(yīng)數(shù)據(jù)，并根據(jù)分析軟件的文本格式進(jìn)行相應(yīng)轉(zhuǎn)化。使用NTSYS-pc Version 2.1軟件進(jìn)行計(jì)算遺傳相似系數(shù)，最后使用UPGMA的方法進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA濃度及質(zhì)量檢測(cè)

該試驗(yàn)采用BIOMIGA公司試劑盒提取花生DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)表明，DNA條帶清晰、明亮無拖尾現(xiàn)象(圖1)。OD260/OD280值介于1.8～2.0。純度較高，可進(jìn)一步用于RAPD擴(kuò)增。

2.2 RAPD反應(yīng)體系的單因素優(yōu)化

2.2.1 退火溫度與循環(huán)次數(shù)篩選

退火溫度篩選試驗(yàn)結(jié)果(圖2)，退火溫度為35～40 ℃時(shí)，均能擴(kuò)增出條帶，在36 ℃時(shí)，條帶最清晰，因此，退火溫度采用36 ℃。循環(huán)次數(shù)為36～40時(shí)，均能擴(kuò)增出條帶(圖3)，其中，循環(huán)次數(shù)為38時(shí)，條帶最清晰，因此，循環(huán)次數(shù)采用38。

2.2.2 引物濃度與模板DNA濃度篩選

通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)篩選最佳引物濃度的試驗(yàn)結(jié)果(圖4)顯示，引物濃度為0.1和0.2 pmol時(shí)，擴(kuò)增條帶模糊，有條帶缺失，而引物濃度為0.4和0.5 pmol時(shí)，擴(kuò)增條帶最清晰，因此，引物濃度選用0.4 pmol最為適宜。最佳模板DNA濃度篩選試驗(yàn)結(jié)果(圖5)顯示，反應(yīng)中這5種濃度梯度上均能擴(kuò)增出條帶，模板濃度為10和15 ng時(shí)，擴(kuò)增條帶亮度較弱，在20、25和30 ng擴(kuò)增產(chǎn)物條帶最為清晰，結(jié)果一致，因此，模板DNA濃度選20 ng最為適宜。

2.3 引物篩選與RAPD標(biāo)記多態(tài)性分析

以22份來自不同地區(qū)的花生品種為試驗(yàn)材料，從200個(gè)隨機(jī)引物中篩選出24個(gè)條帶清晰、多態(tài)性高且重復(fù)性好的引物(表2)，用于花生遺傳多樣性分析。24個(gè)引物共擴(kuò)增得到134個(gè)穩(wěn)定條帶，多態(tài)性條帶112個(gè)，多態(tài)性比率83.58%；每個(gè)引物擴(kuò)增條帶數(shù)為3～9條，平均每個(gè)引物產(chǎn)生多態(tài)性條帶數(shù)為4.667條，其中，OPB-10擴(kuò)增的條帶數(shù)最多，為9條；擴(kuò)增引物多態(tài)性比率為100%的為OPB-10、OPB-13、OPC-07、OPD-05、OPH-11、OPI-08、OPJ-01，圖6為引物OPG-11擴(kuò)增結(jié)果。

表2 24條多態(tài)性引物擴(kuò)增結(jié)果Table 2 Amplification results of 24 polymorphic primers

2.4 聚類分析結(jié)果

用NTSYS-pc Version 2.1軟件計(jì)算花生品種遺傳相似性系數(shù)(表3)表明：22個(gè)花生品種的平均遺傳相似系數(shù)為0.697，不同品種之間遺傳相似系數(shù)的范圍為0.385～0.969，其中，鐵花16、錦花30與吉黑花1號(hào)的遺傳相似性系數(shù)最小，為0.385，關(guān)系最遠(yuǎn)。吉花53與吉花54遺傳相似性系數(shù)最大，為0.969，關(guān)系最近，可能來源于同一父母本。根據(jù)供試材料相似值，采用UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，在遺傳相似系數(shù)為0.666時(shí)，供試材料可分為3大類(圖7)，其中，第1大類主要以吉林省選育的花生品種為主，第2大類以引進(jìn)其它省份的花生品種為主，第3類包括兩個(gè)品種白院花10和錦花14。

表3 22份花生品種遺傳相似性系數(shù)Table 3 Genetic similarity coefficients of 22 varieties of A.hypogaea

3 討論與結(jié)論

RAPD是90年代發(fā)展起來的標(biāo)記技術(shù)，由于操作簡(jiǎn)單高效等特點(diǎn)，目前已經(jīng)在很多生物上有報(bào)道[10-16]，說明RAPD標(biāo)記技術(shù)是一個(gè)可靠有效的方法。RAPD分子標(biāo)記技術(shù)存在低重復(fù)性，特異譜帶不穩(wěn)定性，為了讓試驗(yàn)數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確，須對(duì)反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行優(yōu)化，為此獲得更加準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)[17]。葉冰瑩等[18]對(duì)花生RAPD反應(yīng)條件dNTPs、MgCl2和Taq酶濃度等做了初步優(yōu)化，Taq聚合酶類別及用量對(duì)隨機(jī)擴(kuò)增試驗(yàn)起著至關(guān)重要的作用。該試驗(yàn)所用2×Taq Master Mix酶不僅自帶藍(lán)色染料且含有DNTPs、MgCl2、Taq DNA聚合酶，而且2×Taq Master Mix酶還具有靈敏度高、穩(wěn)定性好，只需要加入模板DNA和引物即可[19]，不僅減少人為誤差，還能節(jié)省時(shí)間，因此，該研究利用2×Taq Master Mix對(duì)花生RAPD-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化。研究表明，退火溫度、PCR循環(huán)次數(shù)、模板用量與引物用量均會(huì)決定擴(kuò)增效果[20]。在該試驗(yàn)中，退火溫度為35～40 ℃時(shí)，均能擴(kuò)增出條帶，循環(huán)次數(shù)和模板DNA濃度篩選試驗(yàn)也具有類似結(jié)果，與陳思等[21]研究結(jié)果基本一致，對(duì)該試驗(yàn)影響最大的為引物用量，引物濃度低則PCR產(chǎn)物較少，過高會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增[22]。綜合以上試驗(yàn)結(jié)果,得出適合花生RAPD反應(yīng)體系為20 μL總反應(yīng)體積中含2×Taq Mix 10 μL、引物4 μLpmol、模板DNA 20 ng；確立的擴(kuò)增程序?yàn)椋篜CR擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，36 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min；共循環(huán)38次。

近年來，關(guān)于RAPD標(biāo)記技術(shù)在遺傳多樣性分析上被廣泛應(yīng)用[23-31]，但在花生上的報(bào)道相對(duì)較少。Subramanian等[32]采用RAPD技術(shù)分析了70份花生種質(zhì)資源遺傳多樣性，在48個(gè)隨機(jī)引物中有7個(gè)隨機(jī)引物具有多態(tài)性，多態(tài)性百分率為7%。姜慧芳等[33]采用RAPD技術(shù)對(duì)7個(gè)不同植物學(xué)類型花生種質(zhì)資源進(jìn)行了分析，其中，13個(gè)引物多態(tài)性百分率為21.48%。以上2人的研究結(jié)果與該試驗(yàn)結(jié)論相類似，但多態(tài)性百分率要比該試驗(yàn)低，該研究24個(gè)引物多態(tài)性百分率為83.58%，遺傳相似性系數(shù)為0.385～0.969，說明該試驗(yàn)22個(gè)花生種質(zhì)資源具有較豐富的遺傳多樣性。其中，從分子的角度分析，遺傳距離變異幅度越大，表明品種間遺傳分化越明顯，遺傳多樣性越高[34]?？梢钥闯觯髌贩N之間遺傳差異較廣泛，品種資源豐富。閆苗苗等[35]利用RAPD標(biāo)記對(duì)24份花生栽培品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，其中13個(gè)引物共擴(kuò)增出123個(gè)條帶，依據(jù)Nei-Li系數(shù)將供試的24個(gè)品種的花生聚為4類。一般來講，相同地理環(huán)境的品種應(yīng)該聚為一類，并且地理環(huán)境與分子標(biāo)記間存在著一定的聯(lián)系，遺傳變異程度和地理環(huán)境的關(guān)系一直備受關(guān)注[36]。該研究在遺傳相似性系數(shù)0.666處將供試材料分為3大類(圖7)，說明RAPD標(biāo)記技術(shù)完全可以區(qū)分22份花生品種。但是，在該試驗(yàn)研究中相同粒型和相同地區(qū)并沒有聚為一類，也沒有表現(xiàn)出遺傳距離和地理位置存在聯(lián)系，與林茂[37]等研究結(jié)果基本一致，進(jìn)一步說明分子標(biāo)記技術(shù)有較高的應(yīng)用價(jià)值。牟書靚等[38]利用農(nóng)藝性狀對(duì)花生種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析，其中，東北王與雙遼紅粒在同一個(gè)群組中，這與該試驗(yàn)的結(jié)果相同。吉花53與吉花54的遺傳相似性系數(shù)最大，為0.969，親緣關(guān)系最近，沒有被明顯的區(qū)別開，這是由于來自相同的雙親且選育目標(biāo)完全一致而導(dǎo)致親緣關(guān)系極其相近。鐵花16、錦花30與吉黑花1號(hào)的遺傳相似性系數(shù)最小，為0.385，說明親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。