吳曉晗，李學(xué)峰，范明智，廉美蘭，金美玉

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

軟棗獼猴桃(Actinidiaarguta)屬獼猴桃科，是多年生藤本植物，最早記載于《開寶本草》，在日本、俄羅斯和我國東北南部山區(qū)較為常見[1-3]。隨著對軟棗獼猴桃根的相關(guān)藥理活性的不斷深入研究，發(fā)現(xiàn)其提取物富含大量有效活性物質(zhì)，如萜類、多糖類、生物堿類、黃酮類、多酚類等[4-5]，其中，含量最高的是黃酮類化合物。黃酮類化合物結(jié)構(gòu)類型復(fù)雜多樣[6]，數(shù)量種類繁多，對植物的生長和發(fā)育起著至關(guān)重要的作用[7]，具有抗炎、抗氧化、提高免疫力的藥理功效[8]，特別對治療癌癥應(yīng)用更多，因此，備受國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，成為研究和開發(fā)利用的熱點[9]。近年來對總黃酮的提取方法種類繁多，但其存在能耗高、效率低、提取不充分等缺點，同時，利用不同提取條件提取的軟棗獼猴桃根總黃酮含量的影響也很大[10]。通過對植物提取條件的篩選，可有效提高植物體內(nèi)總黃酮含量的積累。延永等[11]利用堿液提取法、熱水提取法、乙醇回流提取法、超聲提取法、微波提取法等5種方法提取了苦丁茶中的總黃酮，研究發(fā)現(xiàn)乙醇超聲提取法提取黃酮的效率遠高于其他；賈凌云等[12]利用紫外分光光度法對總黃酮提取方式進行系統(tǒng)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用乙醇回流法效果最好，且用14倍量95%乙醇回流提取菊花中的總黃酮可以獲得較高的提取率；孟永海等[13]為了更高效的提取出刺玫果中的總黃酮，采用正交試驗設(shè)計優(yōu)化了刺玫果總黃酮的提取工藝，發(fā)現(xiàn)正交試驗不僅實驗次數(shù)少，而且數(shù)據(jù)點均勻分布。目前，軟棗獼猴桃根的人工栽培技術(shù)并不完善，不能快速生產(chǎn)大量的軟棗獼猴桃植物資源以滿足市場的供應(yīng)[14]，而通過生物反應(yīng)器培養(yǎng)大量植物資源已經(jīng)成為目前研究的熱點與重點。生物反應(yīng)器培養(yǎng)具有條件控制方便、體積大、生產(chǎn)能力高等優(yōu)點[15]，并且可以為生物體生長提供良好的生物活性環(huán)境，達到最佳生長狀態(tài)，使其生物量或目標(biāo)產(chǎn)物達到最高的工程設(shè)備[16]。因此，該實驗以生物反應(yīng)器培養(yǎng)的軟棗獼猴桃不定根為試驗材料，探討在不同提取工藝下對軟棗獼猴桃不定根中總黃酮含量的影響，為今后軟棗獼猴桃根的黃酮類化合物的開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

軟棗獼猴桃組培苗由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。將軟棗獼猴桃組培苗的根切至1 cm，接種于含25 mL培養(yǎng)基 ( MS+IBA 0.25 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g，pH值5.8 )的培養(yǎng)皿中誘導(dǎo)不定根。將誘導(dǎo)出的不定根接種于含4 L培養(yǎng)基(MS+IBA 0.25 mg/L+蔗糖30 g/L)的5 L氣球型生物反應(yīng)器中進行培養(yǎng)。生物反應(yīng)器培養(yǎng)的通氣量調(diào)節(jié)為100 mL/min，在25 ℃下暗培養(yǎng)。30 d后收獲不定根，在流水下沖洗3次，去除表面水分后置于45 ℃恒溫烘干箱中烘至恒重(48 h)，將其作為試驗材料。

1.2 儀器與藥品

JA2002電子天平(上海精天電子儀器有限公司)；THC-58型數(shù)控超聲提取機(中國濟寧天華超聲電子儀器有限公司)；R201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(中國上海申順生物科技有限公司)；YHW-1103遠紅外鼓風(fēng)干燥箱(中國天津市華北實驗儀器有限公司)；UV1102紫外分光光度計(上海天美科學(xué)儀器有限公司)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購于Sigma試劑有限公司，其他試劑購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 軟棗獼猴桃不定根提取物的制備

取軟棗獼猴桃根干品2 g，置于150 mL三角燒瓶內(nèi)，用正丁醇、甲醇、乙醇和水4種不同溶劑，利用超聲提取法，按照1∶30(g∶mL)料液比進行提取，在50 ℃和40 kHz的頻率下進行提取，1 h 后過濾，重復(fù)2次，合并濾液，將濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)真空濃縮，將濃縮后的膏狀物置于烘干箱中45 ℃下干燥至恒重，收集烘干后的不同溶劑提取物，置于冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 軟棗獼猴桃不定根提取物總黃酮含量的測定方法

利用硝酸鋁比色法測定軟棗獼猴桃不定根提取物的總黃酮含量[17]。精確稱取10 mg蘆丁至燒杯內(nèi)，加入70%乙醇溶液溶解后定容至250 mL，即濃度為40 μg/mL。

分別吸取上述溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中，用75%的乙醇定容至2 mL，加入0.3 mL 5% NaNO2溶液搖勻后室溫下靜置6 min，加入3 mL 10% Al(OH)3溶液靜置6 min后加入2.0 mL 4% NaOH溶液，分光光度計510 nm處測定吸光值，繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y=3.414 7 x+0.002 2,R2=0.992 5。精密稱取0.01 g軟棗獼猴桃不定根提取物，用75%乙醇溶解后定容至25 mL，每個樣品取0.4 mL于試管中，用75%乙醇定容至2 mL，即為待測樣品溶液。按標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟操作，測定吸光值，并計算總黃酮含量。

黃酮含量/mg·g-1=CVD/m

式中，C為樣品溶液濃度/mg·mL-1；V為樣品溶液體積/mL；D為稀釋倍數(shù)總黃酮含量；m為樣品質(zhì)量。

1.3.3 軟棗獼猴桃不定根提取物提取工藝的優(yōu)化

1) 單因素試驗 ①乙醇濃度試驗：將乙醇濃度設(shè)置為25%，50%，75%，100%，在50 ℃，料液比 1∶30(g∶ mL)的條件下提取2次，其他提取物提取方法同1.3.1；②提取時間試驗：選取總黃酮含量較高的乙醇濃度，將提取時間設(shè)置為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h，在50 ℃，料液比1∶30(g∶mL)的條件下提取2次，其他提取物提取方法同1.3.1；③提取溫度試驗：以提取時間試驗中總黃酮含量較高的乙醇濃度、時間作為提取條件，將提取溫度分別設(shè)置為30，50，70與90 ℃，料液比1∶30(g∶ mL)的條件下提取2次，其他提取物提取方法同1.3.1；④提取次數(shù)試驗：以提取溫度試驗中總黃酮含量較高的乙醇濃度，時間以及溫度作為提取條件，將提取次數(shù)分別設(shè)置為1，2，3和4次，在料液比1∶30(g∶ mL)，溫度50℃的條件下提取，其他提取物提取方法同1.3.1；⑤料液比試驗：以提取次數(shù)試驗中總黃酮含量較高的乙醇濃度、時間、溫度以及次數(shù)作為提取條件，將料液比設(shè)置為1∶20，1∶30，1∶40與 1∶50(g∶mL)，在50℃條件下提取2次，其他提取物制備方法同1.3.1。

2) 正交試驗設(shè)計 參照上述單因素試驗結(jié)果，選不同提取時間、溫度、次數(shù)以及料液比4個單因素，以不定根提取物中總黃酮的含量作為指標(biāo)，設(shè)定4因素3水平L(34)正交試驗(表1)，確定最佳的提取工藝。然后根據(jù)正交試驗中最佳提取工藝的條件，對其進行重復(fù)3次的驗證試驗，以此確定該條件是否具有穩(wěn)定性。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of L9(34)

3) 驗證試驗 根據(jù)正交試驗中最佳提取條件的結(jié)果，對其進行驗證試驗，重復(fù)3次，確定該條件是否具有穩(wěn)定性。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

該試驗中利用SPSS 22.0(Statistical Product and Service Solutions 22.0)對試驗數(shù)據(jù)進行分析，用鄧肯氏新復(fù)極差法作對比，顯著水平為0.05，每個處理均進行3次重復(fù)試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑對總黃酮含量的影響

軟棗獼猴桃不定根干粉分別用正丁醇、甲醇、乙醇和水提取后測定總黃酮含量，發(fā)現(xiàn)在乙醇和正丁醇提取物中，總黃酮含量較高，2種間無顯著性差異(圖1)。水和甲醇提取物中總黃酮含量較低，因此，不適宜作為提取溶劑。而與正丁醇比較，乙醇價格低廉，所以選用乙醇作為軟棗獼猴桃不定根黃酮的提取較為適宜。

2.2 提取濃度對總黃酮含量的影響

由圖2可知，當(dāng)提取溶劑濃度低于75%時，其黃酮含量隨之升高；提取溶劑濃度達到75%以上，其黃酮含量隨濃度升高逐漸下降。因此，最佳提取溶劑濃度為75%，此時不定根中黃酮的含量最高，為123.64 mg/g。

2.3 提取時間對總黃酮含量的影響

在提取時間從0.5 h上升到2 h過程中，總黃酮的含量呈現(xiàn)先上升的趨勢，當(dāng)提取時間為1.5 h時，總黃酮含量達到最高,為131.25 mg/g(圖3),但當(dāng)時間大于1.5 h時，提取物總黃酮含量顯著降低。所以，選擇最佳的提取時間為1.5 h。

2.4 提取溫度對總黃酮含量的影響

由圖4可知，溫度從30 ℃ 升高至50 ℃ 時，提取物中總黃酮的含量增加，在溫度為50 ℃時，總黃酮含量最高，達到135.59 mg/g(圖4)，但當(dāng)溫度大于50 ℃時，提取物中總黃酮含量顯著下降。因此，以50 ℃提取軟棗獼猴桃不定根中黃酮較為適宜。

2.5 提取次數(shù)對總黃酮含量的影響

當(dāng)提取次數(shù)為1～3次時，不定根中總黃酮的含量增加；提取次數(shù)達到3次以上，其總黃酮含量表現(xiàn)出下降趨勢。因此，提取次數(shù)在3次時，其總黃酮含量達到最高，為134.92 mg/g(圖5)。

2.6 不同料液比對總黃酮含量的影響

在提取試驗中，料液比是指提取物干重與溶劑體積之比。當(dāng)料液比從1∶20增加到1∶30時，總黃酮的含量大幅升高，達到132.32 mg/g(圖6)，但料液比超過1∶40時，總黃酮的含量依次降低。因此，適宜的料液比選定為1∶30。

2.7 正交試驗

根據(jù)上述單因素試驗結(jié)果，設(shè)定L9(33)正交試驗方案，對提取時間、提取溫度、提取次數(shù)、提取料液比4個因素進行不同組合，探究了不同提取組合總黃酮含量的影響，正交試驗方案及結(jié)果見表2。通過極差值(R)進行分析的結(jié)果，溫度 >料液比 >次數(shù) >時間，結(jié)果表明在正交實驗中提取溫度對總黃酮含量的影響最大，其次為提取料液比。其中,2號組合即提取時間1 h、提取溫度50 ℃、提取次數(shù)3次、料液比為1∶30(g∶mL)時，總黃酮含量最高，達到142.28 mg/g。分別計算出各因素水平對總黃酮含量的平均值K，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)提取時間(A)中K1值最大，提取溫度(B)、提取次數(shù)(C)和料液比(D)中K2值最大。綜上所述，最適宜的工藝條件為A1B2C2D2，即，提取時間1 h、提取溫度50 ℃、提取次數(shù)3次、料液比1∶30(g∶mL)。

表2 正交試驗方案及結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment and result

2.8 驗證試驗

為確定最優(yōu)提取工藝是否具有穩(wěn)定性，對表2正交試驗中得到最佳提取條件即提取時間1 h、提取溫度50 ℃、提取次數(shù)3次、料液比1∶30(g∶mL)，進行3次重復(fù)驗證試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)驗證試驗結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值較小，為1.93%(表3)，表明正交試驗所選出的最優(yōu)提取條件具有較好的穩(wěn)定性。

表3 驗證試驗結(jié)果Table 3 Verification of test results

3 討論與結(jié)論

近年來，由于對軟棗獼猴桃根的大量采集，導(dǎo)致其野生資源逐漸稀少，直接影響了軟棗獼猴桃根的研究與利用[18]。而通過生物反應(yīng)器可以大量培養(yǎng)植物細胞、組織或器官，目前已應(yīng)用于金線蓮、高山紅景天等多種植物培養(yǎng)中。通過生物反應(yīng)器培養(yǎng)的軟棗獼猴桃根具有抗炎、抗癌以及抗氧化等多種功效[19]。其含有的黃酮類化合物具有很好的抗氧化效果，可以清除體內(nèi)自由基，延緩衰老，減少癌癥的發(fā)生，成為保健品和化妝品的研發(fā)熱點。而相關(guān)研究表明，不同的提取工藝也很大的影響著黃酮類化合物的含量。馬微等[20]采用加熱回流提取、超聲波提取和熱回流輔助超聲波提取3種不同方法對冬蟲夏草進行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含超聲方式所制得的提取液的穩(wěn)定性和均一性較好，提取到的生物活性化合物種類更多；王秀敏等[21]在提取烏飯樹葉中的黃酮含量時，分別用甲醇，乙醇，丙酮，正己烷和蒸餾水進行提取，篩選發(fā)現(xiàn)當(dāng)提取溶劑為甲醇時竹葉內(nèi)黃酮含量達到最高；陳宇等[22]對竹葉黃酮的提取工藝進行優(yōu)化，結(jié)果顯示當(dāng)乙醇濃度60%，料液比1∶25，超聲時間為1 h時，黃酮含量達到最高。該研究選取軟棗獼猴桃不定根作為試驗材料，篩選出最佳提取溶劑、濃度、提取時間、溫度和次數(shù)，利用硝酸鋁比色法對軟棗獼猴桃不定根不同溶劑提取物中總黃酮的含量進行測定，根據(jù)單因素試驗結(jié)果進行正交設(shè)計并進行驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，軟棗獼猴桃不定根最佳提取溶劑為乙醇，最佳提取濃度75%，根據(jù)正交實驗結(jié)果得出的最優(yōu)提取工藝組合為提取時間1 h、提取溫度50 ℃、提取3次，經(jīng)3次重復(fù)性驗證試驗后，總黃酮含量達到149.97 mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差1.93%。