張峻淞， 曾令杰， 何綺莉, 黃嘉玲， 張曉元

(1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院， 廣州 510006；2.國家中醫(yī)藥管理局嶺南中藥材生產(chǎn)與開發(fā)重點研究室， 廣東 廣州 510006；3.韶關(guān)市華工高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)研究院, 廣東 韶關(guān) 512027)

穿心蓮(Andrographispaniculata(Burm.f.)Nees)為爵床科一年生草本植物，為《中華人民共和國藥典》(2015年版)收錄的品種[1]，在我國主要栽培于福建、廣東、海南、廣西、云南等地，以種子繁殖。種子質(zhì)量直接影響穿心蓮的栽種及其栽培管理，以及穿心蓮藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量。但在大部分產(chǎn)區(qū)，穿心蓮種子只作為藥材采收的副產(chǎn)品，尚沒有相應(yīng)的種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)或等級劃分的國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)可以參考。研究制定穿心蓮種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及合理劃分其質(zhì)量等級對穿心蓮規(guī)范化栽培非常重要。

一般將穿心蓮種子的凈度、含水量、千粒重、發(fā)芽率作為評判穿心蓮種子等級的指標(biāo)，以最低定級原則確定其質(zhì)量等級[2-3]。然而，由于產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境的差異、栽培管理及采收初加工措施的不同，不同來源的穿心蓮種子的凈度、含水量、千粒重、發(fā)芽率等指標(biāo)間差異較大，若以最低定級原則確定穿心蓮種子的等級，難免會造成有些優(yōu)質(zhì)的種子被劃分到較低的等級之中，因此，按最低定級原則確定的等級難以體現(xiàn)種子質(zhì)量的整體情況，達(dá)不到精準(zhǔn)指導(dǎo)及規(guī)范穿心蓮藥材生產(chǎn)之目的。為了更全面地表征穿心蓮種子的質(zhì)量情況，應(yīng)用系統(tǒng)聚類分析及偏最小二乘回歸分析等方法[4-7]，綜合考慮各指標(biāo)對穿心蓮種子質(zhì)量分級的影響，探討并建立了穿心蓮種子等級評價模型，應(yīng)用于穿心蓮種子的等級判定，為種子的等級評價及穿心蓮的規(guī)范化栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試的穿心蓮種子共有38個批次，采自廣東乳源、英德10批(C 1～C 4、C 33～C 38)、廣西貴港9批(C 5～C 8、C 23～C 27)、湖南臨武2批(C 9～C 10)、四川會理2批(C 11～C 12)、云南西疇2批(C 13～C 14)、海南南寶2批(C 15～C 16)、貴州貞豐2批(C 17～C 18)、福建漳浦9批(C 19～C 22、C 28～C 32)。

1.2 方 法

1.2.1凈 度

從每批穿心蓮種子樣品中分別取1.000 0 g，平行3份，將樣品分為：凈種子、其他植物種子、雜質(zhì)，分別稱重。計算凈種子質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即為凈度。

1.2.2含水量

從每一批凈種子樣品中，取樣1.000 0 g種子(取樣誤差不超過1%)，重復(fù)3次。稱后的試樣放入130 ℃的烘箱中烘150 min，使其達(dá)到恒重，然后立即放入干燥器中冷卻30 min，再稱其重量，并計算種子的含水量。

種子含水量(%)=[(樣品烘前重量-樣品烘后重量)/樣品烘前重量]×100%。

1.2.3千粒重

從每批凈種子樣品中，分別隨機(jī)數(shù)取1 000粒種子，稱定重量，并以含水量13%進(jìn)行折算，重復(fù)3次，取平均值作為該批次的千粒重。

1.2.4發(fā)芽率

選擇紙床作為發(fā)芽床，用帶蓋的透明培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)[8]，隨機(jī)選取100粒穿心蓮凈種子，重復(fù)4次，在25～30 ℃的條件下培養(yǎng)7 d，定期加水，定時統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)目，除去發(fā)霉腐爛的種子并統(tǒng)計其數(shù)目。置床后第2天為首次計數(shù)時間，置床后第7天為末次計數(shù)時間。

1.2.5生活力

采用TTC法測定穿心蓮種子生活力。分別隨機(jī)抽取穿心蓮凈種子50粒，重復(fù)4次，將種子預(yù)濕4 h后，沿種脊方向縱切1/2，使種子外形呈U型。然后，將種子浸泡在0.1%紅四氮唑溶液中，置于40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中染色17 h后進(jìn)行觀察并計算染紅種子粒數(shù)。

1.2.6數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計描述；采用SIMCA-P 13.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析、偏最小二乘法判別分析和偏最小二乘回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 穿心蓮種子各項指標(biāo)測定結(jié)果

通過對38批穿心蓮種子各指標(biāo)進(jìn)行測定(見表1、表2)，結(jié)果表明，各批次穿心蓮種子的含水量為9.95%～16.43%，發(fā)芽率為70.00%～98.25%，千粒重為0.883 2～1.325 9 g，生活力為57.50%～97.50%，其中的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)變化最大的是千粒重，為12.53%，最小的是發(fā)芽率，為8.45%，這四項指標(biāo)都可作為穿心蓮種子分級的重要指標(biāo)。

凈度客觀地反映了種子樣品本身的純凈度，在種子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，要求凈度應(yīng)不低于90%，生產(chǎn)上可以通過過篩等簡單的操作達(dá)到這個要求。本實驗收集的38批穿心蓮種子中，除4批穿心蓮種子的凈度較低之外，其余批次穿心蓮種子凈度均在90%以上；由于在測量含水量、發(fā)芽率、千粒重、生活力時，取的是各批次純凈種子進(jìn)行實驗，因而，不同批次穿心蓮種子中，這些指標(biāo)的變化與種子的凈度大小無相關(guān)性，因此在之后的等級劃分時，沒有考慮將凈度作為穿心蓮種子等級劃分的考察指標(biāo)，凈度僅作為穿心蓮種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的一個最基本要求。

表2 穿心蓮種子統(tǒng)計描述Table 2 Statistical description of A. paniculata seeds

2.2 不同來源的穿心蓮種子的系統(tǒng)聚類分析

以能區(qū)分穿心蓮種子質(zhì)量差異的千粒重、含水量、發(fā)芽率及生活力指標(biāo)為依據(jù)，通過SIMCA-P 13.0對38批穿心蓮種子樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，將穿心蓮種子分為3組(圖1)，C 25、C 23、C 26為一個類型；C 34、C 35、C 36、C 37、C 38、C 24、C 29、C 30、C 32、C 33、C 27、C 28、C 31為一個類型；C 1、C 7、C 20、C 16、C 2、C 10、C 15、C 19、C 21、C 13、C 14、C 22、C 8、C 12、C 5、C 18、C 3、C 9、C 4、C 11、C 6、C 17為一個類型。

2.3 偏最小二乘法判別分析與穿心蓮種子等級的劃分

偏最小二乘法判別分析主要反映X變量和分組變量之間的線性關(guān)系，可對不同等級劃分的合理性加以判定。為了判斷系統(tǒng)聚類分析對不同批次穿心蓮種子分組的合理性，利用SIMCA-P 13.0進(jìn)行偏最小二乘法判別分析。由圖2可知，穿心蓮種子樣品同樣可以分為三類，和系統(tǒng)聚類分析結(jié)果一致，說明系統(tǒng)聚類分析等級劃分的結(jié)果是合理的，從PLS-DA得分圖(圖2)可以看出，各組之間有較明顯的界限。

2.4 穿心蓮種子分級模型建立及等級評判

將穿心蓮種子發(fā)芽率、千粒重、生活力、含水量作為自變量(X)，等級作為因變量(Y)，利用SIMCA-P 13.0進(jìn)行偏最小二乘回歸分析(PLS)，建立回歸模型。其回歸方程為：

Y(種子等級)=8.044-2.048X1-0.003X2-0.227X3-0.012X4,其中X1代表千粒重，X2代表發(fā)芽率，X3代表含水量，X4代表生活力。若輸出值在0.3～1.3之間，則判別為一級種子；輸出值在1.3～2.3之間，則判別為二級種子；輸出值在2.3～3.3之間，則判別為三級種子。

為了考察建立的回歸模型的預(yù)測精確度，將原始數(shù)據(jù)代入上述回歸方程計算預(yù)測值，并與實際觀測值進(jìn)行比較，結(jié)果如圖3所示，模型的預(yù)測值與實際值基本在對角線的兩側(cè)，擬合度良好，表明模型有較好的預(yù)測能力，可以用于穿心蓮種子的等級判定。

3 討 論

本研究從穿心蓮各主產(chǎn)地采集了38批穿心蓮種子，測定了其凈度、千粒重、含水量、發(fā)芽率及其生活力等指標(biāo)，并以這些指標(biāo)為依據(jù)，采用數(shù)理統(tǒng)計學(xué)的方法，開展了穿心蓮種子的分級研究。通過系統(tǒng)聚類分析，將這38批穿心蓮種子分為三個不同的質(zhì)量等級，PLS-DA分析的結(jié)果與系統(tǒng)聚類分析的結(jié)果一致，表明等級的劃分合理。

為了便于判定某批穿心蓮種子的等級類型，探討并建立了穿心蓮種子等級的預(yù)測模型，該模型為：Y(種子等級)=8.044-2.048X1(千粒重)-0.003X2(發(fā)芽率)-0.227X3(含水量)-0.012X4(生活力)。若Y在0.3～1.3之間，則為一級種子；Y在1.3～2.3之間，則為二級種子；Y在2.3～3.3之間，則為三級種子。該模型能夠反映影響穿心蓮種子質(zhì)量的各項指標(biāo)所占的權(quán)重，為綜合判斷穿心蓮種子等級的模型，可避免單獨以某項指標(biāo)來確定穿心蓮種子等級的缺陷。

由于自然環(huán)境與人工栽培管理條件的差異，不同來源的穿心蓮種子，各自所具備的優(yōu)勢不同，其胚的完整性、營養(yǎng)物質(zhì)的儲備量等內(nèi)在因素存在差異，最終反映在各指標(biāo)上的數(shù)值大小也不同，若單獨以某個指標(biāo)來判定其種子的質(zhì)量等級有失偏頗；而種子等級判定的回歸模型綜合考慮了影響穿心蓮種子質(zhì)量的各因素，故其評判分級相對比較全面而客觀，有利于穿心蓮優(yōu)質(zhì)種子的篩選和穿心蓮的規(guī)范化栽培，為大規(guī)模生產(chǎn)過程中穿心蓮藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量保障奠定了基礎(chǔ)；同時，該類模型分析方法也為其他中藥材種子質(zhì)量的綜合分級評價提供了參考。