王 娜， 尹海波， 陳吉祥

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 沈陽(yáng) 110847)

中藥材作為中藥產(chǎn)品的基本原料，種子是其根源，因此要保證中藥材質(zhì)量，首先在于保證其種子質(zhì)量的優(yōu)良與穩(wěn)定。北蒼術(shù)(Atractylodeschinensis(DC.) Koidz)為我國(guó)常用中藥材，是藥典蒼術(shù)的主要基源，主產(chǎn)于我國(guó)東北、內(nèi)蒙古和河北等地，為北蒼術(shù)的道地產(chǎn)區(qū)。北蒼術(shù)具有燥濕健脾，祛風(fēng)散寒，明目的功效，主要用于濕阻中焦，脘腹脹滿，泄瀉，水腫，腳氣痿躄，風(fēng)濕痹痛，風(fēng)寒感冒，夜盲，眼目昏澀[1]等癥。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》(GB/T 3543.1-3543.7—1995)[2]，對(duì)不同產(chǎn)地共22份北蒼術(shù)種子進(jìn)行研究，初步確定北蒼術(shù)種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，以期為促進(jìn)中藥材產(chǎn)業(yè)更好地的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用北蒼術(shù)種子，于 2019年分別收集于遼寧、吉林、黑龍江、內(nèi)蒙古等地，共 22份，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室尹海波教授鑒定為北蒼術(shù)種子(Atractylodeschinensis(DC.) Koidz)。種子編號(hào)及產(chǎn)地信息見表1。

1.2 主要試劑

75%乙醇(天津科密歐試劑有限公司)；紅四氮唑(上海源葉生物科技有限公司)

1.3 主要儀器及設(shè)備

LHP-300型智能人工氣候箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)；LRH-150-GIS 人工氣候箱(韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司)；DHG-9145 A型鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；SLY-C 微電腦自動(dòng)數(shù)粒儀(杭州綠博儀器有限公司)；DSX型電腦篩選器(杭州大吉光電儀器有限公司)；JD 60-4 電子天平(沈陽(yáng)龍騰電子有限公司)；KQ 5200 DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SZ 2-ILST體視顯微鏡(日本東京奧林巴斯株式會(huì)社)；數(shù)顯卡尺(上海九量五金工具有限公司)；干燥器；變色硅膠。

表1 種子來(lái)源信息

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 扦 樣

參考《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》(GB/T 3543.1-3543.7—1995)[2]中扦樣標(biāo)準(zhǔn)，北蒼術(shù)種子送檢樣品最少為500 g，凈度分析試樣最少為50 g[2](凈度分析試樣的最小重量為2 500粒種子)。

2.2 真實(shí)性鑒定

采用種子外觀形態(tài)法[3-4]，對(duì)22份北蒼術(shù)種子全部進(jìn)行隨機(jī)取樣，各選取400粒種子，每100粒為一組重復(fù)。觀察種子大小以及形態(tài)特征，記錄數(shù)據(jù)。

2.3 凈 度

從22份北蒼術(shù)種子中各隨機(jī)稱取 150 g，每50 g為一組重復(fù)。利用電腦篩選器將凈種子與各種雜質(zhì)及其他植物種子分開，谷物選篩的規(guī)格選取3.0、4.0兩種篩子，篩分完畢后利用稱量天平稱定各組分重量，剩余凈種子的重量占樣品總重量的百分率即為種子凈度。

種子凈度(%)=[(供檢種子重量-雜質(zhì)總重量)/供檢種子重量]×100%

2.4 千粒重

利用自動(dòng)數(shù)粒儀從22份北蒼術(shù)凈種子中隨機(jī)數(shù)取 2 000粒，每1 000粒為一組重復(fù)。兩份種子重量的差數(shù)與平均數(shù)之比不應(yīng)超過5%，若超過應(yīng)該再分析第3份重復(fù)，直至達(dá)到要求，取差距較小的2份重量進(jìn)行計(jì)算測(cè)定結(jié)果。

2.5 含水量

本實(shí)驗(yàn)采用高溫烘干法[2]進(jìn)行種子含水量測(cè)定。先將稱量瓶(70 mm×35 mm)預(yù)先烘干，冷卻后稱重并置于干燥器內(nèi)。稱取各產(chǎn)地北蒼術(shù)種子樣品10 g，每5 g為一組重復(fù)。放入預(yù)先烘干和稱重過的稱量瓶?jī)?nèi)，利用電子天平再次稱定(精確到0.001)。將稱量瓶放入預(yù)先加熱至130 ℃的烘箱內(nèi)，迅速關(guān)閉烘箱門，待箱溫在5～10 min內(nèi)回升至130 ℃時(shí)開始計(jì)算時(shí)間，烘干時(shí)間為3 h。待計(jì)時(shí)完畢后，在烘箱內(nèi)蓋好稱量瓶蓋子并迅速取出，放入干燥器內(nèi)冷卻至室溫，20 min后再稱重，計(jì)算北蒼術(shù)種子含水量。

種子含水量(%)=[(M2-M3)/(M2-M1)]×100%;

式中，M1為稱量瓶和蓋子總重量(g)；M2為稱量瓶和蓋子及所盛北蒼術(shù)種子烘干前總重量(g)；M3為稱量瓶和蓋子及所盛北蒼術(shù)種子烘干后總重量(g)。

2.6 發(fā)芽率

對(duì)凈度測(cè)定后的22份北蒼術(shù)種子分別隨機(jī)數(shù)取300粒，每組重復(fù)100粒。用75%乙醇浸泡北蒼術(shù)種子，消毒時(shí)長(zhǎng)為5 min。用清水沖洗后，再用純凈水浸泡北蒼術(shù)種子12 h備用。將浸泡后的北蒼術(shù)種子逐粒接種在直徑為150 mm鋪有兩張濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿接種100粒種子，接種完畢后適當(dāng)補(bǔ)足水分，將培養(yǎng)皿置入人工氣候箱內(nèi)，溫度條件設(shè)定為20 ℃。每一培養(yǎng)皿外部要標(biāo)明種子編號(hào)信息，以便于后期觀察與記錄。在接種第3天時(shí)開始計(jì)數(shù)，并定期定時(shí)觀察，記錄發(fā)芽情況。北蒼術(shù)種子發(fā)芽情況見圖1～圖6。

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽總粒數(shù)/實(shí)驗(yàn)用種子總粒數(shù))×100%

2.7 生活力

本實(shí)驗(yàn)采用四唑染色法[2]進(jìn)行。稱取0.5 g紅四氮唑粉末置于100 mL褐色容量瓶中，加蒸餾水至刻度，如果溶液pH值不在6.5～7.5范圍內(nèi)，則應(yīng)該采用磷酸緩沖液來(lái)配置紅四氮唑溶液。將配置好的溶液置于冰箱冷藏室內(nèi)備用。對(duì)凈度測(cè)定后的22份北蒼術(shù)種子分別隨機(jī)數(shù)取300粒，每100粒為一組重復(fù)。將種子置于純凈水中浸泡12 h，浸泡完畢后，取吸水膨大的北蒼術(shù)種子，用鑷子除去表皮后，分開兩片子葉，選取帶有胚芽的一片浸入0.5%的 TTC溶液中，于45 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光染色2 h。染色完畢后應(yīng)將溶液倒出，并用清水洗凈進(jìn)行染色的北蒼術(shù)種子，周身染成均勻紅色的種子即可視為其有生活力。

生活力(%)=(染色種子數(shù)/供檢種子總數(shù))×100%。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

北蒼術(shù)種子呈倒卵圓形，上部略尖下部鈍圓，長(zhǎng)5.5～8.0 mm，寬1.5～2.5 mm，長(zhǎng)寬比約為3。種子大小均勻且飽滿，外種皮棕色或深褐色，表面被濃密順向貼伏的半透明長(zhǎng)直毛，頂有淡黃色冠毛或者冠毛脫落的環(huán)痕，具有子葉2枚，外表面呈乳白色或紫色，頂端具有胚芽。北蒼術(shù)種子形態(tài)特征見圖7、圖8。其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

結(jié)果表明，各地區(qū)的種子凈度普遍較高，都在85%以上，其中只有LN 2種子凈度略低于其他產(chǎn)區(qū)，為84.53%，除LN 1、LN 4、HB 2、HB 4四個(gè)產(chǎn)地的北蒼術(shù)種子外，其他各地區(qū)種子凈度均達(dá) 90%以上。各產(chǎn)地北蒼術(shù)種子的千粒重在 9.835～15.804 g 之間，其中LN 1與HB 6兩個(gè)產(chǎn)地的北蒼術(shù)千粒重較低，均在10 g以下。不同產(chǎn)地北蒼術(shù)種子的含水量在5.48%～9.37%之間，其中LN 3、LN 4及HB 2含水量均在 7.00%以下，LN 1、LN 2、LN 6、LN 7、HB 1、HB 3、HB 6、JL、NMG 1、LN 9、NMG 3、HLJ、LN 10共13個(gè)產(chǎn)地的北蒼術(shù)種子含水量則達(dá)8.00%以上。不同產(chǎn)地北蒼術(shù)種子的發(fā)芽率差異頗大，在7%～89%之間，其中NMG 3的發(fā)芽率僅為7%，HB 1、HB 2、HB 3、HB 4、HB 7五個(gè)產(chǎn)地的北蒼術(shù)種子的發(fā)芽率一般，在30%～50%之間，其余產(chǎn)地的北蒼術(shù)種子發(fā)芽率較高，LN 1發(fā)芽率最高，為89%。不同產(chǎn)地北蒼術(shù)種子的生活力差異也十分明顯，在17%～94%之間，其中NMG 3的生活力最低，為17%，其他產(chǎn)地北蒼術(shù)種子生活力都達(dá)60%以上，LN 8的北蒼術(shù)種子生活力最高，達(dá)94%。

表2 不同產(chǎn)地北蒼術(shù)種子各指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

表4 北蒼術(shù)種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

3.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

3.2.1主成分分析

應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行主成分分析[3-4](p<0.05，滿足分析條件)，結(jié)果如表3所示。

表3 總方差解釋

提取前3個(gè)主成分的特征值，計(jì)算特征向量。前3個(gè)主成分為：

F 1=0.013X1-0.177X2+0.044X3+0.696X4+0.694X5；

F 2=-0.302X1+0.612X2+0.725X3+0.033X4+0.082X5；

F 3=0.887X1+0.455X2-0.207X3+0.086X4+0.015X5；

式中：X1～X5依次代表北蒼術(shù)種子含水量、凈度、千粒重、發(fā)芽率以及生活力。

進(jìn)一步求得不同產(chǎn)地的主成分綜合得分，并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行排名。22個(gè)不同批次的北蒼術(shù)種子質(zhì)量?jī)?yōu)劣排名順序由高至低依次為：JL、LN 10、NMG 1、HLJ、LN 3、LN 9、HB 5、LN 5、NMG 2、LN 6、LN 7、LN 8、HB 3、HB 6、HB 7、LN 1、LN 2、HB 4、HB 1、LN 4、HB 2、NMG 3(各個(gè)編號(hào)所代表地區(qū)詳見表1)。位于第一的JL綜合得分達(dá)1.11，最后一位NMG 3綜合得分最低，為-1.85。由此排名也可得知，吉林、黑龍江、內(nèi)蒙古部分及遼寧產(chǎn)區(qū)的北蒼術(shù)種子質(zhì)量較好，河北產(chǎn)北蒼術(shù)種子質(zhì)量一般，產(chǎn)自內(nèi)蒙古呼倫貝爾大楊樹林鎮(zhèn)的北蒼術(shù)種子質(zhì)量最差。

3.2.2聚類分析

應(yīng)用 SPSS 25.0 軟件采用系統(tǒng)聚類方法再次進(jìn)行分析，聚類方法采用最遠(yuǎn)鄰元素法，區(qū)間選擇平方歐氏距離[3-4]。分析結(jié)果將22個(gè)不同批次的北蒼術(shù)種子在閾值5處劃分為三類，結(jié)果如圖9。

其中遼寧不同產(chǎn)區(qū)產(chǎn)地的10批種子、內(nèi)蒙古產(chǎn)區(qū)的NMG 1與NMG 2、河北產(chǎn)區(qū)的HB 5與HB 6、吉林產(chǎn)區(qū)以及黑龍江產(chǎn)區(qū)共16批種子聚為一類；河北省產(chǎn)區(qū)的HB 1、HB 2、HB 3、HB 4、HB 7共5批種子聚為一類，產(chǎn)于內(nèi)蒙古的NMG 3單獨(dú)為一類。其分析結(jié)果與主成分分析結(jié)果大致吻合，北蒼術(shù)種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)可參考這兩種分析結(jié)果進(jìn)行制定。

3.3 北蒼術(shù)種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

結(jié)合試驗(yàn)數(shù)據(jù)與統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果，可初步把北蒼術(shù)種子質(zhì)量分為3個(gè)等級(jí)，詳見表4。

4 討 論

目前，大多數(shù)中藥材種子的質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)還處于缺失狀態(tài)，部分市售中藥材種子質(zhì)量參差不齊，市場(chǎng)中也存在以假冒偽劣種子及地方習(xí)用種子充售正品中藥材種子的現(xiàn)象，這導(dǎo)致用其生產(chǎn)出的中藥材質(zhì)量和療效難以保證，嚴(yán)重影響到藥材市場(chǎng)秩序[5-9]。由此看來(lái)，推出中藥材種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)是勢(shì)在必行的首要任務(wù)[10-12]。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)從北蒼術(shù)主產(chǎn)地收集到的共22份北蒼術(shù)種子，嚴(yán)格依據(jù)《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》[2]中各個(gè)質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，并將檢驗(yàn)結(jié)果加以整理及分析，將22份北蒼術(shù)種子分為3個(gè)等級(jí)，初步制定了北蒼術(shù)種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，為維護(hù)北蒼術(shù)種子的市場(chǎng)秩序提供重要理論依據(jù)，同時(shí)也為促進(jìn)中藥材產(chǎn)業(yè)更好地發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

5 結(jié) 論

隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化進(jìn)程的不斷加快，人類對(duì)于中醫(yī)藥相關(guān)知識(shí)有了更加深入的了解，對(duì)于中藥材的需求量也逐漸增加。但是北蒼術(shù)藥材及其種子的銷售環(huán)節(jié)依舊存在著一些不可忽視的問題，貨源以假亂真、質(zhì)量良莠不齊等銷售不規(guī)范的現(xiàn)象屢見不鮮。追根溯源，種子是影響藥材質(zhì)量的根本，從源頭規(guī)范北蒼術(shù)種子的市售標(biāo)準(zhǔn)，可在一定程度上把控北蒼術(shù)的藥材質(zhì)量，因此，北蒼術(shù)種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的推出尤為緊要。本研究對(duì)從我國(guó)北蒼術(shù)主產(chǎn)地收集到的北蒼術(shù)種子，進(jìn)行檢驗(yàn)與統(tǒng)計(jì)分析，初步制定了北蒼術(shù)種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，以期為肅清北蒼術(shù)種子市售不規(guī)范現(xiàn)象提供依據(jù)，從而為北蒼術(shù)藥材的質(zhì)量提供保證。